Відповідно до підпункту 2 пункту 1 статті 6 Закону України "Про протидію захворюванню на туберкульоз", пункту 4 Положення про Міністерство охорони здоров’я України , затвердженого постановою Кабінету Міністрів України від 25 березня 2015 року № 267, та з метою ефективної діагностики випадків туберкульозу

1. Затвердити Інструкцію з мікробіологічної діагностики туберкульозу, що додається.

2. Визнати таким, що втратив чинність наказ Міністерства охорони здоров’я України від 06 лютого 2002 року № 45 "Про затвердження Інструкції з бактеріологічної діагностики туберкульозу"

3. Директорату громадського здоров’я (Скіпальський А.) забезпечити подання цього наказу в установленому законодавством порядку на державну реєстрацію до Міністерства юстиції України.

4. Контроль за виконанням цього наказу покласти на заступника Міністра з питань європейської інтеграції Стефанишину О.А.

5. Цей наказ набирає чинності з дня його офіційного опублікування.

1. Ця Інструкція визначає детальний зміст та методику виконання мікробіологічних досліджень в лабораторіях, що здійснюють мікробіологічну діагностику туберкульозу, спрямовану на підвищення ефективності лікувально-діагностичного процесу, зменшення невиправданих витрат.

2. Ця Інструкція обов’язкова для виконання та поширюється на заклади охорони здоров’я державної та комунальної форм власності, які забезпечують забір, транспортування матеріалу та проведення мікробіологічних досліджень з метою діагностики туберкульозу.

3. У цій Інструкції терміни вживаються у таких значеннях:

мікроскопічне дослідження мазка мокротиння для виявлення КСБ - дослідження, що проводиться з метою виявлення найбільш небезпечних в епідеміологічному сенсі пацієнтів, хворих на туберкульоз легенів. Переваги мікроскопії, що полягають у швидкості отримання результату, відносній простоті, доступності дослідження й економічній ефективності, роблять її незамінною для виявлення більшості пацієнтів, хворих на туберкульоз легенів;

пряма мікроскопія - метод дослідження з необробленого діагностичного матеріалу або його осаду, якщо матеріал рідкий;

мікроскопія мазка з осаду - матеріал, що підготовлений для культурального дослідження після розрідження, деконтамінації, концентрації та ресуспендування;

кислотостійкі організми, у тому числі М. tuberculosis,- організми, що зберігають забарвлення карболовим фуксином після знебарвлення розчином сірчаної кислоти або солянокислого спирту; метод NALC-NаOH є методом деконтамінації, оскільки застосовується у разі посівів на щільних та рідких поживних середовищах, у тому числі в автоматизовані системи детекції мікобактерій. Під час правильного використання цей метод дозволяє отримати більше позитивних результатів культурального дослідження, ніж будь-який інший метод;

флуоресцентна мікроскопія - оптичне дослідження об’єктів, забарвлених спеціальними барвниками (флуорохромами), що світяться під дією ультрафіолетових променів;

молекулярно-генетичний метод - виявлення відмінностей у генетичній структурі чутливих і стійких штамів шляхом визначення нуклеотидних послідовностей генів, мутації, що призводять до виникнення резистентності M. tuberculosis до протитуберкульозних препаратів;

тест медикаментозної чутливості - визначення спектру чутливості мікобактерій туберкульозу до протитуберкульозних препаратів;

посів - метод виділення культури мікобактерій туберкульозу з біологічного матеріалу на щільних та рідких поживних середовищах;

внутрішній контроль якості бактеріологічних досліджень - ефективний і систематичний моніторинг та забезпечення відповідності усіх лабораторних процесів затвердженим стандартним операційним процедурам (далі - СОП) і встановленим стандартам.

1. Для отримання достовірних результатів дослідження діагностичного матеріалу потрібно дотримуватися таких умов:

робити збір матеріалу до початку хіміотерапії, оскільки навіть декілька днів застосування медикаментозної терапії може бути достатньо для того, щоб убити значну кількість мікобактерій або понизити їх життєздатність і спотворити результати дослідження;

матеріал для дослідження має збиратися рано-вранці;

під час дослідження мокротиння потрібно зібрати дві проби ранкового мокротиння впродовж двох послідовних днів;

зібраний матеріал потрібно якнайшвидше доставити до лабораторій; у разі неможливості негайної доставки матеріал зберігається в холодильнику за температури +2-8 -°C не більше ніж 72 год;

під час перевезення матеріалу потрібно особливо ретельно стежити за збереженням флаконів і правильністю їх маркування.

За відсутності можливості доставки зразків мокротиння для дослідження бактеріоскопії потрібно приготувати і доставити до лабораторії зафіксовані мазки.

Контейнер з порцією мокротиння достатнього об’єму (не менше ніж 3,0-5,0 мл), що містить ущільнені або гнійні грудочки без слини, ретельно закривають кришкою, що загвинчується, потім контейнер маркують і поміщають у спеціальний бікс для транспортування до лабораторії.

2. Для збору діагностичного матеріалу повинні використовуватись спеціальні контейнери, які:

прозорі, виготовлені з ударостійкого і прозорого матеріалу, що не допускає протікання рідини та дозволяє оцінити кількість і якість зібраної проби, не відкриваючи кришки;

легко піддаються маркуванню і надійно зберігають його протягом періоду зберігання, транспортування та проведення дослідження;

мають кришки, що загвинчуються з ущільненням (не використовувати флаконів, що мають кришки, які щільно закупорють його: під час відкриття таких кришок у контейнері виникає розріджений простір, який призводить до утворення аерозолю, створюючи потенційну небезпеку внутрішньолабораторного зараження);

мають об’єм 30,0-50,0 мл;

мають широкий отвір для збору мокротиння (не менше ніж 30,0 мм у діаметрі), щоб пацієнт міг легко відокремлювати мокротиння всередину контейнера, не піддаючи забрудненню його зовнішню поверхню.

Використання таких контейнерів дає можливість оцінити якість і об’єм зібраного матеріалу, а в разі приготування мазків з нативного мокротиння - проводити відбір гнійних грудочок приготування мазка безпосередньо з контейнера, запобігаючи етапу виливання мокротиння в чашку Петрі, надзвичайно небезпечного через утворення аерозолю. У цьому разі ефективність прямої мікроскопії може не поступатися ефективності мікроскопії з осаду.

3. Лабораторія, що проводить мікробіологічні дослідження з метою виділення M. tuberculosis, має бути готова отримати різноманітний біологічний матеріал на дослідження, а саме:

мокротиння;

виділення верхніх дихальних шляхів, після подразнюючої інгаляції;

промивні води бронхів;

бронхоальвеолярні змиви;

бронхоальвеолярний лаваж;

матеріал, отриманий під час бронхоскопії;

транстрахеальний та внутрішньолегеневий біоптати;

промивні води шлунка;

сечу;

пунктати із закритих порожнин (спинномозкову рідину, ексудати і транссудати з плевральної та черевної порожнин, гній, гнійно-некротичні маси, виділення ран, виділення відкритих порожнин тощо).

Якщо хворий не може відкашляти мокротиння, потрібно застосовувати інші методи (відхаркувальні препарати, подразнювальні аерозольні інгаляції, промивання трахеїв, бронхів тощо).

Індуковане мокротиння збирається у разі неможливості самостійного збору мокротиння пацієнтом. Для аерозольних інгаляцій користуються портативними або стаціонарними аерозольними інгаляторами.

Індуковане мокротиння нагадує на вигляд і за консистенцією слину, щоб уникнути вибраковування матеріалу на направленні і на флаконі з матеріалом має бути обов’язкове маркування, що вказує на те, що матеріал отримано після аерозольної інгаляції.

Під час дослідження промивних вод шлунка, щоб уникнути змішування мокротиння, що було проковтнуто з їжею, потрібно брати натщесерце. Останній прийом їжі має бути не менше ніж за 12 годин до взяття промивних вод шлунка.

Перед збором матеріалу пацієнту дають випити 100-150 мл стерильної дистильованої води. Отриманий матеріал нейтралізують додаванням 100 мг натрію бікарбонату, негайно доставляють в лабораторію і піддають обробці, щоб виключити пошкоджуючу дію на мікобактерії шлункових ферментів, що містяться в матеріалі.

Сеча (середня частина ранкової порції або вся ранкова порція) збирається в стерильний посуд після ретельного туалету зовнішніх статевих органів. Аналіз сечі на мікобактерії здійснюється тричі. У лабораторії сечу центрифугують за 3 000 g, використовуючи метод накопичення осаду.

Бактеріологічного дослідження добової сечі не проводять.

Асептично зібрані рідини (ліквор, перикардіальна, синовіальна, асцитична рідина, кров, кістковий мозок) мають збиратися лікарем в асептичних умовах у стерильний контейнер з використанням відповідних методик. До рідин, що мають схильність до згортання, додають стерильні гепарин (0,2 мг на 1,0 мл) або оксалат калію (0,01-0,02 мл 10,0 % нейтрального оксалату на 1,0 мл матеріалу). Матеріал має бути доставлено до лабораторії негайно.

Асептично зібрані тканини поміщаються в стерильні контейнери без додавання будь-яких консервантів. У разі тривалого транспортування тканини потрібно помістити в стерильний ізотонічний розчин, обкласти сухим льодом або охолодити за температури +4-8 -°C. Матеріал має бути доставлено до лабораторії негайно.

Матеріал відразу після збору слід відправляти до лабораторії (протягом декількох годин). У разі віддаленості лабораторії від місця взяття матеріалу його відправка в лабораторію може здійснюватися два рази на тиждень. У цьому разі контейнери із зібраним матеріалом мають зберігатися в холодильнику за температури +4-8 -°C не довше ніж 72 год. За потреби зберігання понад 72 год до діагностичного матеріалу додають консервант. У цьому разі термін зберігання збільшується до 5 діб.

Для інших матеріалів, якщо їх транспортування передбачається за високої температури навколишнього середовища або їх доставка до лабораторії більше, ніж через 24-72 год після збору (взяття), рекомендується використовувати такі хімічні консерванти:

10,0 % розчину тризаміщеного фосфату натрію;

1,0 % розчину цетилпіридин хлориду у 2,0 % хлориду натрію. М. tuberculosis залишаться життєздатними до 1 тижня;

подвійний об’єм 2,0-3,0 % розчину борної кислоти.

Зазначені розчини рекомендується застосовувати для збереження зразків мокротиння. У разі їх застосування матеріал може зберігатися за кімнатної температури. Однак консерванти токсичні для мікобактерій і їх застосування може знижувати висіюваність мікобактерій. Для зниження токсичності консервантів проби рекомендується зберігати в холодильнику за температури від +4 до +8 -°C.

Діагностичний матеріал може бути заморожений, а в разі, якщо він не буде піддаватись розморожуванню і повторному заморожуванню, життєздатність мікобактерій збережеться.

4. Для безпечного транспортування дослідний матеріал має бути упаковано у водонепроникну ємність, що не б’ється, а також захищену від струсів, ударів та інших можливих пошкоджень.

Для транспортування матеріалу потрібно мати в лабораторії кілька спеціальних металевих або пластикових транспортувальних ящиків, які влаштовано так, щоб у вертикальному положенні фіксувати 20-30 контейнерів з діагностичним матеріалом. Кришка ящиків має надійно закриватися, щоб виключити можливість самовільного відкривання кришки і висипання контейнерів зі зразками. Для транспортування можна використовувати металеві бікси. Під час транспортування матеріал не повинен знаходитись на сонці.

На зразки, залежно від мети дослідження, та контейнери заповнюється направлення відповідно до чинного законодавства.

Усю зазначену супровідну документацію розміщають окремо від матеріалу (у файлі, конверті, поліетиленовому пакеті тощо), поза транспортним контейнером (ящиком/біксом) зі зразками.

Перед відправкою зібраного матеріалу медичний працівник повинен перевірити:

відповідність кількості контейнерів з мокротинням їх кількості, зазначеній у списку направлення;

відповідність номера кожного контейнера номерам, зазначеним у направленні.

Після перевірки даних супроводжувальної документації медпрацівник зазначають дату відправлення матеріалу на дослідження, ставить свій підпис та вкладає у файл (конверт, поліетиленовий пакет) супроводжувальний лист і заповнені бланки направлень на мікроскопічне дослідження на кожну пробу матеріалу та прикріплює конверт до транспортного контейнера (бікса, ящика) зовні.

5. Прийом матеріалу має забезпечуватися в спеціально відведеному місці. Бікси / транспортувальні ящики з контейнерами повинні відкривати у витяжній шафі або на спеціально виділеному столі з дотриманням таких вимог:

одягнути одноразові рукавички, контейнер відкривати у шафі біологічної безпеки;

провести зовнішню обробку бікса відповідним дезінфектантом;

обережно відкрити бікс і перевірити цілісність контейнерів. Биті контейнери знезаражують шляхом занурення в дезінфектант, кип’ятіння або автоклавування. Матеріал з таких зразків не досліджується. У цьому разі потрібно запросити новий зразок на аналіз;

витягнути контейнери з матеріалом із бікса. Провести обробку дезінфектантом зовнішніх поверхонь усіх контейнерів, що знаходяться у біксі;

продезінфікувати внутрішню частину бікса. Якщо виявлено забруднення бікса, проавтоклавувати його або занурити в дезінфікуючий розчин;

перевірити відповідність номерів у супроводжувальній документації номерам, що позначені на контейнерах із матеріалом;

присвоїти матеріалу лабораторний порядковий номер. Позначити відповідним номером контейнер (на бічній стінці) і внести номер до бланка направлення;

зняти рукавички і помістити їх у контейнер для дезінфекції, а потім вимити руки з милом.

У лабораторії має бути розроблено документально оформлені правила вибракування матеріалу, що передбачають:

відмову від під часйому первинних проб без потрібної ідентифікаційної документації та маркування;

належну поведінку стосовно проб незадовільної якості;

заходи в разі виявлення пошкоджених або негерметично закритих контейнерів.

Задовільна якість матеріалу передбачає наявність у матеріалі слизового або слизово-гнійного мокротиння. Об’єм зібраного матеріалу має коливатися в межах 3,0-5,0 мл, хоча в разі задовільної якості прийфнятна і менша кількість. Потрібно відзначити якість отриманого матеріалу в журналі реєстрації досліджень і в бланку видачі результатів дослідження. У разі вибракування матеріалу потрібно запросити нову порцію на дослідження.

Дослідження зразка виконуються тільки за наявності заповненої форми направлення. Неприпустимо проведення досліджень на підставі усного запиту, без відповідного письмового направлення.

Усі отримані первинні проби має бути зареєстровано у формах первинної облікової документації відповідно до направлення.

У день надходження до лабораторії консервованого матеріалу його центрифугують, відмивають стерильною дистильованою водою і без додаткової деконтамінації використовують осад для приготування мазків та посіву на живильні середовища.

1. Метод мікроскопії є найбільш швидким, простим і менш витратним методом виявлення КСБ в нативному матеріалі (найчастіше в мокротинні) без попередньої його обробки й гомогенізації. Мікроскопічне дослідження мазків мокротиння, забарвлених за методом Ціля-Нільсена, дозволяє виявити КСБ за умови, що їх кількість буде складати 10 000 і більше в 1,0 мл мокротиння. Негативний результат не виключає діагнозу "туберкульоз", оскільки в мокротинні може міститися кількість мікобактерій нижча, ніж межа виявлення методом мікроскопії.

Основним діагностичним матеріалом для мікроскопії на КСБ слугує мокротиння.

Результати мікроскопічного дослідження на КСБ інших біологічних матеріалів (різних рідин, гною, сечі тощо) мають обмежене значення.

Дослідження мазків з осаду центрифугованої сечі не завжди дозволяє отримати достовірні результати, оскільки в сечі можуть бути наявні нетуберкульозні мікобактерії.

За потреби виявлення збудника туберкульозу в різних біологічних матеріалах рекомендується використовувати культуральний метод дослідження.

2. Процедура приготування мазка розпочинається з підготовки предметних скелець. Потрібно використовувати тільки одноразові, нові, без подряпин і сколів, знежирені у спирті або суміші Нікіфорова (96-° етиловий спирт + ефір у співвідношенні 1 : 1). Скло підписують простим олівцем по матовій смузі або алмазним олівцем по склу. Номер, проставлений на скельці, має відповідати номеру дослідження в лабораторному реєстраційному журналі.

Під час приготування мазків із нативного матеріалу контейнер відкривають акуратно, уникаючи розбризкування аерозолю, що містить мікобактерії.

Мікобактерії частіше виявляються в щільних гнійних грудочках мокротиння.

Обпаленою в полум’ї спиртівки й охолодженою бактеріологічною петлею, одноразовою бактеріологічною петлею або зламаними кінцями дерев’яної палички (нової для кожної порції мокротиння) захоплюють невелику кількість мокротиння з гнійними грудочками. Щільно притиснувши петлю або паличку перпендикулярно до скла, дрібними круговими рухами розподіляють гнійну грудочку мокротиння по поверхні предметного скельця як можна тоншим шаром площею 1,0-2,0 см x 2,0-3,0 см у вигляді овалу.

Товщина мазка у висушеному незабарвленому стані має бути такою, щоб можна було прочитати газетний шрифт, розміщений за скельцем на відстані 5,0-10,0 см. Якщо мазок занадто тонкий, під час мікроскопічного дослідження можна отримати хибнонегативний результат. Якщо мазок занадто товстий, він може бути змитий з предметного скельця в разі забарвлення.

На одному предметному склі можна робити тільки один мазок.

Використані для приготування мазка палички чи одноразову бактеріологічну петлю скидають в ємність з дезінфікуючим розчином або в контейнер з відпрацьованим інфекційним матеріалом. Пінцет і ножиці обпалюють в полум’ї пальника (за потреби).

Приготування мазків для мікроскопічного дослідження є відносно небезпечною процедурою, під час якої може відбуватися розсіювання аерозолів, що містять збудник.

У разі якщо мазок готують за допомогою бактеріологічної петлі, потрібно обпалювати петлю після кожної маніпуляції в полум’ї спиртового чи газового пальника доти, доки вона не стане червоного кольору. Перед повторним використанням петлю ретельно прожарюють в полум’ї пальника, яке під час цьому має бути безбарвним чи блакитним. Принятніше використовувати одноразові бактеріологічні петлі.

Мазки з осаду отримують після центрифугування діагностичного матеріалу. Для приготування мазка до осаду додають 1,0 мл фосфатного буфера, ресуспендують. На скельце наносять 1-2 краплі ресуспендованого осаду, розподіляючи його тонким шаром у центрі скла на площі близько 1,0-2,0 см ґ 2,0-3,0 см.

Мазки з осаду рідкого матеріалу легко змиваються в процесі забарвлення, тому їх потрібно готувати на скельцях, заздалегідь оброблених сироваткою чи бичачим сироватковим альбуміном, який наносять ватним тампоном на чисті знежирені предметні скельця, рівномірно розподіляючи на 2/3 їх поверхні. Оброблені сироваткою скельця висушують за кімнатної температури. Скельця готують заздалегідь. Термін зберігання таких скелець - до 5 діб.

Не можна здійснювати приготування мазків способом "розтяжки" матеріалу між двома предметними скельцями, оскільки такий спосіб збільшує площу мазка більше ніж у 2 рази та знижує можливість виявлення КСБ.

Приготовані мазки висушують за кімнатної температури до висихання у витяжній шафі або шафі біологічної безпеки.

Не допускається підсушування або фіксації сирих мазків над полум’ям пальника.

Приготування, фіксацію, забарвлення і перегляд препаратів потрібно завершити до кінця робочого дня. Якщо дослідження не вдається завершити, предметні скельця з мазками залишають на ніч у закритій коробці. Нефіксовані мазки не повинні залишатися відкритими на ніч в робочому приміщенні.

3. Для фіксації мазків можна використовувати такі прийоми:

скельця з мазками, що висохли, фіксують триразовим проведенням їх упродовж 3-5 с через верхню третину полум’я спиртівки до зникнення ознак запотівання скелець;

скельця з мазками, що висохли, поміщають на електронагрівач для просушування предметних скелець за температури +65-75 -°C не менше ніж на 1 год;

скельця з мазками, що висохли, поміщають у сушарну шафу за температури +105 -°C на 10 хв.

4. Барвники, які використовуються, нерідко містять різні домішки, тому під час приготування розчинів барвників потрібно враховувати вміст фарбувальної речовини. Наважку розраховують шляхом ділення потрібної кількості фарби на десятковий еквівалент вмісту фарбувальної речовини.

Якщо вміст фарбувальної речовини становить 88,0 % і більше, перераховувати наважку не потрібно.

Кристали фенолу безбарвні, а якщо вони мають коричневий колір, їх не слід використовувати, оскільки в цьому разі якість забарвлення може бути незадовільною.

Реактиви:

Забарвлюючий розчин (3,0 % розчин фуксину).

Повільно нагрівають кристали фенолу у флаконі до рідкого стану на водяній бані і додають злегка підігріту дистильовану воду.

Робочий розчин:

Змішують 10,0 мл розчину 1 і 90,0 мл розчину 2, переливають у ємність із темного скла. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати за кімнатної температури впродовж шести місяців. Перед використанням розчин слід профільтрувати.

Знебарвлюючий розчин (розчин 3,0 % солянокислого спирту):

Концентрована соляна кислота - 3,0 мл

96-° етиловий спирт - 97,0 мл.

Акуратно додають концентровану соляну кислоту до спирту у флакон з темного скла. Забороняється вливати спирт у кислоту. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати за кімнатної температури впродовж шести місяців.

Замість 3,0 % розчину солянокислого спирту для знебарвлення можна використовувати 25,0 % розчин сірчаної кислоти.

Знебарвлюючий розчин (розчин 25,0 % сірчаної кислоти):

Концентрована сірчана кислота - 25,0 мл

Дистильована вода - 75,0 мл

Акуратно додають концентровану сірчану кислоту до води, нашаровуючи її по стінці посудини.

Забороняється вливати воду в кислоту. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготуваня і термін зберігання. Розчин можна зберігати за кімнатної температури впродовж шести місяців.

Розчин, що дофарбовує (0,3 % розчин метиленового синього):

Хлорид метиленового синього - 0,3 г

Дистильована вода - 100 мл

Розчиняють хлорид метиленового синього в дистильованій воді.

На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати за кімнатної температури впродовж шести місяців.

5. Промарковані й зафіксовані мазки поміщають на підставку ("рейки") так, щоб вони не торкалися один одного. Не слід забарвлювати одночасно більше ніж 12 скелець.

На кожен мазок накладають смужку фільтрувального паперу. На всю поверхню фільтрувального паперу, що покриває скельце, наливають забарвлюючий розчин.

Повільно нагрівають препарат над полум’ям пальника до легкої появи парів. Не допускається закипання або повне випарювання забарвлюючого розчину на предметному скельці. Якщо розчину недостатньо, його треба додати і нагріти вдруге.

Прогрітий мазок залишають на 5 хв не допускаючи повного випарювання рідини, після чого фільтрувальний папір видаляють пінцетом і поміщають його в контейнер для відходів.

Кожне предметне скельце акуратно змивають під слабкою течією води до повного видалення забарвлюючого розчину. Не дозволяється змивати і знебарвлювати одночасно декілька мазків, щоб уникнути перехресної контамінації.

На скельця з мазками наливають знебарвлювальний розчин, повністю покриваючи всю поверхню мазка, і залишають на 3 хв.

Обережно промивають кожне предметне скельце, як зазначено вище. Знебарвлений мазок дофарбовують 0,3 % розчином метиленового синього впродовж 60 с.

Промивають скельця водою, видаляючи залишки вологи. Залишають препарат на повітрі за кімнатної температури у вертикальному або похилому положенні для висихання. Не слід промокати препарат.

6. Для налаштування мікроскопа і методики дослідження препаратів шляхом обертання макрогвинта віддаляють об’єктив від предметного столика. Обертаючи револьвер, встановлюють об’єктив із малим збільшенням (5 хв або 10 хв) точно над конденсором. Предметне скельце розміщують на предметному столику власне під об’єктивом. Дивлячись збоку для контролю відстані між склом і лінзою об’єктиву, повільно обертаючи мікрогвинт, опускають об’єктив до предметного скельця, не торкаючись лінзою препарату.

Дивлячись через окуляри, регулюють інтенсивність світлового потоку джерела світла.

Повертають макрогвинт так, щоб лінза об’єктиву відійшла від предметного столика, до отримання різкого зображення. Повертають мікрогвинт, щоб отримати чіткіше зображення.

Дивлячись на препарат збоку, вибирають об’єктив із великим збільшенням (100х). Слід переконатися, що об’єктив не торкається предметного скла. Аплікатором (піпеткою) наносять одну краплю імерсійної олії на препарат, не торкаючись скла. Щоб уникнути забруднення імерсійної олії й отримання хибноопозитивного результату, не можна торкатися піпеткою крапельниці олії до мазка. Крапля олії має вільно впасти на скельце. Опускають об’єктив до зіткнення з краплею олії. Повільно підіймають об’єктив до появи чіткого зображення. Налаштовують зображення, використовуючи мікрогвинт.

Для перегляду мазка під час мікроскопічного дослідження (додаток 1), забарвлених за методом Ціля-Нільсена, слід використовувати світловий бінокулярний мікроскоп з об’єктивом (100х) з масляною імерсією та окуляром (10х) (загальне збільшення 1 000х). Слід використовувати тільки синтетичну імерсійну олію з коефіцієнтом заломлення nD = 1,5.

Відповідними вважають поля зору, у яких видно клітинні елементи бронхіального походження (лейкоцити, слизові тяжі, клітини епітелію). Поля зору, що не містять таких елементів, не враховуються. Кількості полів зору якщо довжині мазка близько 2,0 см відповідає щонайменьше 100-120. У разі якщо результат такого дослідження виявляється негативним, для підтвердження рекомендується проглянути додатково ще 200 полів зору. Таким чином, вивчається 300 полів зору. У разі значної кількості КСБ у мазку (2+) досить дослідити 50 полів зору, а для мазка КСБ (3+) - досить проглянути 20 полів зору (додаток 1).

Після закінчення мікроскопічного дослідження кожного препарату для видалення імерсійної олії потрібно помістити мазок у витяжну шафу, накрити смужкою фільтрувального паперу і змочити її декількома краплями ксилолу. Через 2-3 хв фільтрувальний папір видаляють.

Очищений у такий спосіб від імерсійної олії препарат слід зберігати в коробці для позитивних або негативних препаратів, що були переглянуті раніше. Після перегляду кожного препарату слід ретельно протирати об’єктив мікроскопа від імерсійної олії безворсовими серветками, щоб запобігти контамінації наступного мазка. Серветки потім опускають у бак для відходів.

Кислотостійкі бактерії - тонкі малиново-червоні палички завдовжки 1-10 (частіше - 1-4) мкм, завширшки 0,2-0,6 мкм, злегка зігнуті, більш-менш зернисті. Мікобактерії розміщуються ізольовано, або парами, або у вигляді груп, добре помітні на блакитному фоні мазка.

Кислотостійкість, що виявляється під час забарвлення за Цілем-Нільсеном, властива не тільки різним видам мікобактерій, але й іншим мікроорганізмам, наприклад, Rhodococcus, Nocardia, Legionella, а також цистам Cryptosporidium та Isospora. Мікобактерії, що швидко ростуть, можуть розрізнятися за мірою кислотостійкості. Іноді вони можуть забарвлюватися у фіолетово-малиновий колір. У сумнівних випадках рекомендується тривало (впродовж 45-60 хв) знебарвлювати мазок у солянокислому спирті. Сапрофіти під час цьому втрачають забарвлення і виглядають як палички блакитного кольору.

7. Кількість виявлених КСБ визначає тяжкість захворювання і міру епідемічної небезпеки хворого. Підраховують кількість КСБ у мазку. Отже, дослідження має бути не тільки якісним, але й кількісним. Реєстрація результатів із зазначенням кількості виявлених КСБ проводиться відповідно до градації результатів мікроскопічного дослідження під час забарвленні за методом Ціля-Нільсена (додаток 2).

8. Результати мікроскопічного дослідження вносять до лабораторного реєстраційного журналу обліку мікроскопічних досліджень та бланків направлення на дослідження.

Результати мікроскопії слід повідомляти до відділення, яке надало проби, якнайшвидше, бажано впродовж 24 год з моменту отримання проб мокротиння. У бланку результату дослідження має бути зазначено такі відомості:

паспортні дані пацієнта;

найменування установи виконавця і відправника;

характеристика якості матеріалу;

використаний метод забарвлення;

кількість КСБ у мазку;

дата дослідження і прізвище співробітника, який проводив дослідження.

Мазок із виявленими КСБ є документом, від якого залежить постановка діагнозу ТБ легень у конкретної людини. Його слід зберігати в лабораторії, а результати потрібно підтвердити повторним дослідженням.

9. Флуорохромні барвники (аурамін О, родамін С тощо) зв’язуються з воскоподібними структурами бактерійних клітин, які під час опромінення ультрафіолетовими променями візуалізуються як палички жовтого або помаранчевого кольору на темному фоні.

Перевага флуоресцентного методу мікроскопії полягає в можливості перегляду більшої площі мазка, що пов’язано з використанням об’єктива з меншим збільшенням.

Аурамін має канцерогенну активність, тому не слід допускати попадання на шкіру його порошку або розчину. Зважувати аурамін потрібно у вінілових рукавичках або двох парах звичайних рукавичок та захисних окулярах. Для захисту дихальної системи потрібно використовувати респіратор. Приміщення після зважування слід провітрювати. Готувати розчин і проводити забарвлення мазків варто тільки у витяжній шафі.

Під час забарвлення мазків флуорохромними барвниками потрібно:

уникати неповного знебарвлення;

готувати досить тонкі мазки, оскільки зайва товщина мазка перешкоджає якісному знебарвленню, а додаткове дофарбовування може під часховати наявність мікобактерій. Окрім цього, товсті мазки погано фіксуються на предметному скельці, а тому можуть бути змиті в процесі фарбування;

уникати надмірно інтенсивного дофарбовування, яке приховує наявність мікобактерій.

Оскільки із часом флуоресцентне забарвлення може зблідніти, мікроскопію роблять за можливості відразу ж після закінчення процедури забарвлення і висихання мазків. У разі неможливості проведення мікроскопії безпосередньо після фарбування допускається зберігання забарвлених мазків у темному місці, бажано в холодильнику, не більше ніж 24 год.

Реактиви:

1. Забарвлюючий розчин

Кристали фенолу (температура плавлення - +41 -°С) розчиняють у дистильованій у воді, підігріваючи на водяній бані.

Робочий розчин:

У витяжній шафі змішують розчини 1 і 2, переливають у ємність із темного скла, що щільно закривається. На етикетці зазначають назву реактиву, дату притування і термін зберігання.

Розчин можна зберігати в ємності з темного скла в прохолодному затемненому місці впродовж трьох місяців, у процесі зберігання розчин може стати каламутним, проте це не впливає на якість фарбування.

Знебарвлюючий розчин (розчин 0,5 % солянокислого спирту):

Концентрована соляна кислота - 0,5 мл

96-° етиловий спирт - 100,0 мл

Акуратно додають концентровану соляну кислоту в етиловий спирт. Слід обережно влити кислоту в спирт, але не навпаки. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування, термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.

Для дофарбовування можна використовувати розчини перманганату калію, акридинового помаранчевого або метиленового синього.

Розчин перманганату калію:

Перманганат калію (КMnО4) - 0,5 г

Дистильована вода - 100 мл

Перманганат калію розчиняють у дистильованій воді і переливають у бутель з темного скла, який щільно закривається. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.

Розчин акридинового помаранчевого:

Безводний двозаміщений фосфат натрію (Na2HPO4) - 0,01 г;

Акридиновий помаранчевий - 0,01 г;

Дистильована вода - 100 мл.

Фосфат натрію розчиняють у дистильованій воді. Додають акридиновий помаранчевий. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.

Розчин метиленового синього:

Метиленовий синій хлорид - 25,0 мг;

Вода дистильована - 100 мл.

25,0 мг метиленового синього хлориду розчиняють у 100 мл дистильованої води. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.

10. Промарковані й зафіксовані мазки поміщають на підставку ("рейки") так, щоб вони не торкалися один одного. Не слід забарвлювати одночасно більше ніж 12 скелець.

На кожне скельце наливають крізь воронку з паперовим фільтром забарвлюючий розчин на 15-20 хв. Не слід підігрівати мазків і користуватися смужками фільтрувального паперу.

Промивають мазок дистильованою водою. Водопровідна вода містить з’єднання хлору, які можуть вплинути на флюоресценцію.

На скельце наливають знебарвлювальний розчин і залишають на 2 хв.

Промивають мазок дистильованою водою.

Знебарвлений мазок дофарбовують розчином перманганату калію, акридинового помаранчевого або метиленового синього з використанням воронки з паперовим фільтром упродовж 2 хв.

Промивають мазок дистильованою водою.

Залишають препарат на повітрі за кімнатної температури у вертикальному або похилому положенні для висихання. Не слід промокати препарат. Можливе висушування мазків у сухожаровій шафі малого об’єму впродовж 10 хв за температури +110 -°C.

Під час використання перманганату калію час його дії не повинен перевищувати 2 хв.

Точність експозиції має вирішальне значення, оскільки в разі перевищення часу експозиції інтенсивність флуоресценції може зменшуватися.

11. Облік результатів мікроскопічного дослідження під час забарвлення флуорохромними барвниками здійснюється при значно меншому збільшенні (зазвичай 400х), ніж збільшення, яке використовується для перегляду мазків, забарвлених за методом Ціля-Нільсена (1000х). Тому поле зору, що переглядається під люмінесцентним мікроскопом, має значно більшу площу, ніж поле зору світлового мікроскопа. Отже, кількість КСБ у 100 полях зору препарату, забарвленого флуорохромами і переглянутого у разі збільшення в 400 разів, буде значно вищою, ніж під час дослідження цього самого препарату, забарвленого за Цілем-Нільсеном і переглянутого в разі збільшення в 1 000 разів.

Під час мікроскопії препарату, забарвленого флуорохромними барвниками, слід переглядати не менше ніж 40 полів зору. Переглянута площа мазка під час мікроскопії 40 полів зору зі збільшенням 400х дорівнює площі 100 полів зору зі збільшенням 1 000х або одній лінії мазка, рівній 2 см.

12. Внутрішній контроль якості мікроскопічного дослідження проводиться під час фарбування кожної партії мазків.

Із цією метою досліджуються контрольні (свідомо позитивні та негативні мазки), які готують заздалегідь, фіксують і зберігають у закритому контейнері.

Для підготовки контрольних мазків бажано використовувати справжні проби мокротиння, проте допустимо додавати до проб мокротиння суспензію М. tuberculosis (для позитивних мазків), кишкової палички чи інших некислотостійких паличок (для негативних мазків).

З кожного зразка мокротиння готують принаймні по 20 мазків, максимально ідентичних за розміром і товщиною, маркуючи кожну серію мазків одним і тим самим ідентифікаційним номером.

Мазки забарвлюють, переглядають 2–3 мазки з кожної серії, зазначають середню кількість КСБ для КСБ+ мазків у журналі контролю якості.

Позитивні і негативні контрольні мазки включають до кожної партії мазків, що будуть забарвлюватися. Мікроскопію контрольних мазків слід проводити перед мікроскопією мазків від пацієнтів.

Досліджують контрольні мазки, зазначають результати в журналі контролю якості, реєструючи номер партії барвника та/або дату приготування розчину.

Незадовільними результатами контролю мікроскопічного дослідження за Цілем-Нільсеном є такі:

у позитивному контрольному мазку КСБ забарвлені не яскраво або їх кількість занадто мала;

фон позитивного контрольного мазка залишається червоним;

у негативному контрольному мазку виявляються КСБ;

у мазках наявні конгломерати барвника.

Незадовільними результатами контролю мікроскопічного дослідження із забарвленням флуорохромами є такі:

у позитивному контрольному мазку КСБ забарвлені в неяскравий жовтий колір або їх кількість занадто мала;

фон негативного контрольного мазка залишається яскраво-жовтим після знебарвлення;

фон занадто темний або містить надто багато флуоресціюючих артефактів;

у негативному контрольному мазку виявляються КСБ.

Якщо під час проведення контролю якості відзначаються проблеми принаймні в одному із вищезазначених пунктів, слід з’ясувати, чи мали місце проблеми з притуванням розчинів, і повторити забарвлення двох негативних і двох позитивних контрольних мазків, зважаючи на можливі помилки. Якщо в разі повторного фарбування мають місце незадовільні результати, слід приготувати нові розчини барвників.

13. Причини, що знижують результативність мікроскопічного дослідження:

неправильне маркування флаконів із мокротинням (наприклад, під час маркування кришки флакона, а не власне флакона);

відсутність маркування на склі або пошкодження його в процесі забарвлення, помилки під час маркування зразків;

відсутність бінокулярного мікроскопа, поганий стан або погане налаштування мікроскопа;

недостатня підготовка персоналу;

технічні помилки під час запису або передачі результатів дослідження;

неправильна реєстрація результатів.

Неправильні результати можуть бути обумовлені помилками лабораторних працівників, пов’язаними переважно із фізичними і психологічними причинами (так званий "людський фактор"). Багато помилок, що виникають у разі неправильного обліку результатів мікроскопії мазків мокротиння, можна попередити під час здійснення постійного централізованого контролю роботи з мікроскопічної діагностики ТБ курируючими бактеріологічними лабораторіями за умови правильного навчання та періодичної перепідготовки лабораторних працівників.

14. Можливі причини хибнопозитивних результатів:

повторне використання контейнерів або предметних скелець;

розчин барвника приготований із використанням води, що містить сапрофітні мікобактерії;

використання непрофільтрованого розчину або забарвлюючого розчину, що зберігався впродовж тривалого часу;

недотримання методики фарбування мазків;

крос-контамінація КСБ внаслідок відсутності проміжків між сусідніми скельцями, що забарвлюються;

неадекватне знебарвлення;

неправильна інтерпретація результатів мікроскопії, коли внаслідок недоліку досвіду наявність у мазку кристалів погано профільтрованого барвника розцінюється як КСБ+;

поганий стан або погане налаштування мікроскопа;

контамінація імерсійної олії.

Можливі причини хибнонегативних результатів:

низька якість зразка мокротиння;

недостатній об’єм зразка мокротиння, узятого для підготовки мазка;

неправильний вибір грудочок мокротиння для приготування мазка;

порушення методики приготування мазка (занадто тонкий або товстий), погана його фіксація;

погана якість барвників;

недотримання методики приготування розчинів;

недостатній час експозиції із забарвлюючим розчином;

надмірне знебарвлення;

занадто сильне дофарбовування;

перегрівання в ході фарбування;

читання менше ніж 100 полів зору, хаотичний або недостатньо ретельний перегляд;

занадто тривала експозиція забарвлених мазків за денного освітлення;

занадто довгий інтервал між фарбуванням і читанням, особливо якщо мазки були погано забарвлені і не зберігалися в темряві.

1. Проби клінічного матеріалу, що надходить до мікробіологічної лабораторії для бактеріологічного дослідження з метою діагностики і контролю хіміотерапії туберкульозу, різною мірою забруднені бактеріями, які швидко ростуть, а пишний їх ріст на багатих живильних середовищах заважає розвитку мікобактерій та ускладнює їх виділення. Тому перед посівом на живильні середовища діагностичний матеріал піддають спеціальній обробці, що забезпечує деконтамінацію, тобто загибель гноєрідної та гнилісної мікрофлори.

М. tuberculosis, що виділяються з дихальних шляхів хворого, оточені великою кількістю слизових речовин, що затрудняють їх виділення. Тому мокротиння та інші подібні матеріали перед посівом одночасно з деконтамінаціею піддають розрідженню й гомогенізації.

Усі препарати, що використовуються в певний час для розрідження і деконтамінації діагностичного матеріалу, мають виражену токсичність стосовно мікобактерій. Щоб забезпечити виживання достатньої частини мікобактеріальної популяції, потрібно використовувати бережні методи обробки, які дозволяють, з одного боку, подавити гнійні і гнилісні мікроорганізми, що швидко ростуть, а з другого - максимально зберегти життєздатність наявних у матеріалі мікобактерій.

Частота контамінації посівів (кількість проростів) у лабораторіях, де проводяться дослідження свіжозібраних проб, під час культивування мокротиння на щільних яєчних середовищах зазвичай становить 2,0-5,0 %. Якщо клінічний матеріал до надходження до лабораторії зберігався протягом декількох днів у нерегламентованих умовах, частота контамінації може досягати більше ніж 5,0 %, що припустимо. Якщо кількість проростів менше ніж 2,0 %, це свідчить про надмірно жорсткий режим деконтамінації, що може призвезти до загибелі значної кількості M. tuberculosis, які містяться в діагностичному матеріалі. Для уніфікації результатів дослідження потрібно, щоб мікробіологічні лабораторії використовували для гомогенізації й деконтамінації діагностичного матеріалу один зі стандартних методів, зазначених нижче.

Під час здійснення посівів на М. tuberculosis потрібно мати на увазі такі важливі аспекти:

клінічні зразки мають бути гомогенізовані, щоб звільнити М. tuberculosis з тканин, в яких вони можуть міститися;

ні гомогенізація, ні деконтамінація не повинні істотно зменшувати кількості життєздатних М. tuberculosis в діагностичному матеріалі;

успіх гомогенізації й деконтамінації залежить від ряду чинників, зокрема:

підвищеної стійкості мікобактерій до різко лужної або кислої реакції розчинів, які використано для гомогенізації матеріалу;

тривалості обробки матеріалу цими речовинами;

температури зразка в процесі його центрифугування;

ефективності центрифугування, яке використовується для осадження мікобактерій.

2. Процедура передпосівної обробки має бути максимально щадною й забезпечувати частоту контамінації не більше ніж 5,0 % для щільних середовищ і 8,0-10,0 % - для рідких.

Усю процедуру деконтамінації проводять тільки у шафах біологічної безпеки 2 класу. Оскільки потрібно суворо дотримуватися певної тривалості обробки матеріалу, доцільно одночасно обробляти не більше ніж 8-12 проб.

Для передпосівної обробки діагностичного матеріалу використовують тільки стерильні розчини детергентів, лугів і кислот. Для обробки й посіву матеріалу використовують тільки стерильний посуд (контейнери для збору діагностичного матеріалу, центрифужні пробірки, піпетки тощо).

Надосадову рідину, отриману в результаті центрифугування, зливають у контейнер з воронкою, що зменшує розбризкування рідини й утворення аерозолю. Використані піпетки поміщають у ємність з дезінфікуючим розчином або в пакети для автоклавування. Увесь забруднений лабораторний посуд з біологічними рідинами і використані витратні матеріали утилізуються автоклавуванням.

3. Усі реактиви, які використовують під час приготування розчинів для обробки діагностичного матеріалу, повинні мати ступінь очищення не менше ніж категорія "хімічно чисті" (ХЧ).

Для передпосівної обробки діагностичного матеріалу рекомендується використовувати нижчезазначені методи й реагенти.

4. Застосування муколітичного препарату NALC, що використовується для швидкого розрідження мокротиння, прискорює процес деконтамінації та зменшує концентрацію деконтамінуючої речовини (NAOH) до 1,0 %. NALС швидко втрачає свою активність в розчиненому вигляді, тому його розчин має готуватися щодня і вживатися свіжим. У муколітичну суміш входить цитрат натрію для зв’язування іонів важких металів, що можуть бути наявні в пробі й інактивувати дію N-ацетил-L-цистеїну.

NALC викликає тільки розрідження зразків мокротиння і не має деконтамінуючих властивостей. Тому для інших біологічних матеріалів (сеча, змиви, ліквор тощо) деконтамінацію слід проводити без додавання NALC (тільки розчином гідроксиду натрію й цитрату натрію).

Для отримання деконтамінуючого розчину, що містить 2,0 % NAOH (із цитратом натрію), потрібно з’єднати рівні об’єми 4,0 % розчину NAOH і 2,9 % розчину цитрату натрію безпосередньо перед використанням.

Розчини готують так:

розчин NAOH: 4,0 г NAOH розчинити в 100 мл дистильованої води;

розчин цитрату натрію: 2,9 г Na-цитрату дегідрату або 2,6 г Na-цитрату безводного розчинити в 100 мл дистильованої води.

Зазначені розчини стерилізують і зберігають в стерильному закритому посуді для подальшого використання.

Другий варіант приготуваннярозчину NaOH-цитрат - в 1,0 л дистильованої води розчинити:

гідроксид натрію (NAOH) - 20,0 г

цитрат натрію (Na3C6H5O7x 2H2O) - 14,5 г.

Безпосередньо перед проведенням процедури обробки матеріалу готують робочий розчин деконтамінанту: у розчин NaOH-цитрат додають порошок муколітичного (розріджуючого) агента NALC із розрахунку 0,5 г на 100 мл розчину.

Суміш NALC-NaOH може бути використана тільки впродовж 24 год, оскільки після закінчення зазначеного терміну розчин швидко втрачає свою муколітичну активність. Тому рекомендується готувати невеликі об’єми розчину, щоб кожного разу використовувати для процедури деконтамінації свіжий розчин, не зберігаючи для подальшого використання об’єм розчину, що залишився.

У разі значного забруднення зразків сторонньою мікрофлорою концентрацію гідроксиду натрію у вихідному розчині можна збільшити до 3,0 %.

5. Для отримання фосфатного буфера (рН = 6,8) готують два розчини:

9,47 г безводного Na2HPO4 розчиняють в 10,0 мл дистильованої води;

9,07 г KH2PO4 розчиняють в 10,0 мл дистильованої води.

Потім для приготування буфера з рН = 6,8 обидва приготовані розчини змішують у рівній кількості й перевіряють рівень рН за допомогою рН-метра або індикаторної паперової смужки. Потрібного значення рН досягають, додаючи розчин а чи б. Розчин а підвищує значення рН, розчин б - знижує.

Другий варіант приготування буферного розчину: в 10,0 мл дистильованої води потрібно розчинити:

двозаміщений фосфат натрію (Na2HPO4) - 4,74 г;

однозаміщений фосфат калію (KH2PO4) - 4,54 г.

Стерилізація буфера проводиться в автоклаві за температури +121 -°C протягом 15 хв у ємності з кришкою, що частково відкручена. Після охолодження розчину до кімнатної температури кришку слід щільно закрутити.

Обробку матеріалу слід проводити в ламінарній шафі біобезпеки з дотриманням стерильності за такою схемою:

до зразка (приблизно 5,0-10,0 мл), який міститься в пластиковій градуйованій центрифужній пробірці на 50,0 мл, додати рівний об’єм NALC-NaOH;

щільно закривши кришку, змішати вміст пробірки струшуванням або за допомогою вортексу (протягом 5-20 с) до повного розрідження;

перевернути пробірку, щоб усі ділянки її внутрішніх поверхонь і кришки піддалися дії розчину.

Потрібно уникати посиленого струшування, щоб запобігти окисленню й інактивації NALC. Необхідний ступінь інтенсивності змішування деконтамінуючого розчину з оброблюваним матеріалом забезпечується під час центрифугування, для чого потрібно:

залишити зразок на 15 хв за кімнатної температури для деконтамінації (у разі якщо потрібно збільшити ступінь деконтамінації, час експозиції може бути продовжено до 25 хв);

додати до пробірки стерильний фосфатний буфер (рН = 6,8) до відмітки "50,0 мл" (для зниження дії NAOH і зменшення щільності розчину перед центрифугуванням);

щільно закрити кришку й перемішати вміст пробірки струшуванням, щоб змити всі внутрішні поверхні пробірки і кришки;

центрифугувати зразок протягом 15-20 хв за 3 000 g в антиаерозольній центрифузі для осадження 95,0 % наявних у матеріалі мікобактерій;

перелити надосадову рідину в ємність з дезінфікуючим розчином за допомогою стерильної піпетки (або злити супернатант в ємність з дезінфектантом, після чого витерти край пробірки серветкою, змоченою дезінфектантом, або акуратно обпалити), а потім закрити пробірку.

Потрібно додати до осаду 0,5-2,0 мл нової порції стерильного фосфатного буфера, а потім ресуспендувати осад і використовувати його для інокуляції.

Розчин тризаміщеного фосфорнокислого натрію може використовуватися в 10,0 % концентрації.

Тризаміщений фосфорнокислий натрій (Na3PO4) добре пригнічує супутню флору і навіть при 2-3-денному зберіганні матеріалу за температури +4 -°C не пошкоджує мікобактерій і мало впливає на їх здатність до росту на живильних середовищах.

Тризаміщений фосфорнокислий натрій може використовуватися для консервації, транспортування і деконтамінації зразків мокротиння. Метод не має жорстких обмежень за часом. Цей метод обробки матеріалу використовується тільки для посіву на щільні живильні середовища.

6. Для приготування розчину потрібно розчинити у 800 мл дистильованої води 100 г тризаміщеного фосфату натрію, довести об’єм розчину до 1 л і стерилізувати автоклавуванням протягом 15 хв за температури +121 -°C.

Для обробки досліджуваний матеріал потрібно залити рівним об’ємом 10,0 % тризаміщеного фосфату натрію, щільно закрити ємність і помістити її на 10 хв на струшувач. Крім того, для кожного зразка бажано мати свою пробірку з Na3PO4 або окрему піпетку, щоб уникнути перехресної контамінації зразків під час заливання деконтамінуючого розчину.

Пробірку або флакон з матеріалом, залитим деконтамінантом, помістити на 18-20 год у термостат за температури +37 -°C.

Після цього пробірки, не відкриваючи, помістити у відповідну центрифугу, урівноважити їх і центрифугувати під за 3 000 g протягом 15 хв. При зазначеному режимі відбувається осадження 95,0 % наявних у матеріалі мікобактерій.

Якщо процес деконтамінації проводився у контейнері, в якому матеріал надійшов до лабораторії, після закінчення деконтамінації осад матеріалу з контейнера слід перенести стерильною піпеткою об’ємом 5,0-10,0 мл у центрифужну пробірку, врівноважити пробірки й центрифугувати в описаному режимі.

Надосадову рідину відібрати стерильною піпеткою на 5,0-10,0 мл і перенести її в ємність з дезінфікуючим розчином, залишивши в кожній пробірці 1,2-1,5 мл осаду.

Використану піпетку опустити в ємність з дезінфікуючим розчином.

До осаду стерильно додати кілька крапель 6,0 % соляної кислоти або 1,0 % лимонної кислоти до отримання нейтрального значення рН, визначеного індикаторною паперовою смужкою.

Пробірку з осадом помістити у штатив в порядку реєстраційних номерів матеріалу.

Для зниження токсичного впливу на мікобактерії різних залишків речовин (у тому числі можливих хіміопрепаратів) проводять ще одну процедуру відмивання осаду 10,0-15,0 мл ізотонічного розчину хлориду натрію.

Супернатант видаляють, а осад в об’ємі 0,8-1,0 мл готують до інокуляції й приготування мазка.

Під час проведення процедури деконтамінації потрібно пам’ятати, що центрифугування є однією з найбільш небезпечних процедур стосовно ризику утворення інфекційного аерозолю.

Процедури піпетування, переливання з ємності в ємність також має бути скорочено до мінімуму і здійснено у шафі біобезпеки.

Загальний час обробки матеріалу за методом Петрова не повинен перевищувати 40 хв.

Обробка за допомогою NaOH є досить жорсткою і може призвести до загибелі у зразку, що досліджується, до 60,0 % мікобактерій. Цей показник не залежить від додаткової загибелі бактерій за рахунок підвищеної температури під час центрифугування та інших факторів.

7. Розчин їдкого натру токсичний відносно як супутніх мікроорганізмів, так і М. tuberculosis. Тому під час використання цього методу потрібно суворо дотримуватися зазначених термінів обробки.

Приготування розчинів:

4,0 % розчин їдкого натру (NaOH):

40,0 г їдкого натру заливають дистильованою водою до об’єму 1 000 мл;

10,0 % розчин соляної кислоти:

10,0 мл концентрованої соляної кислоти додають до 90,0 мл дистильованої води.

Розчини стерилізують в автоклаві за температури +121 -°C протягом 20 хв.

Для обробки досліджуваний матеріал, який перебуває в стерильному контейнері, залити подвійним об’ємом 4,0 % розчину їдкого натру і помістити на 10-30 с на струшувач.

Витримати отриману суміш 15 хв за кімнатної температури з періодичним ручним струшуванням. При цьому не варто перевищувати часу експозиції.

Стерильною піпеткою об’ємом 5,0-10,0 мл перенести оброблений матеріал у пробірки.

Пробірки врівноважити і центрифугувати матеріал за 3 000 g протягом 15 хв.

Стерильною піпеткою об’ємом 5,0-10,0 мл перенести надосадову рідину в ємкість з дезінфікуючим розчином, залишивши в пробірці 0,8-1,2 мл осаду.

До осаду додати стерильної піпеткою 15,0 мл стерильного 0,9 % розчину хлориду натрію.

Пробірки врівноважити і повторно центрифугувати матеріал за 3 000 g протягом 15 хв.

Стерильною піпеткою об’ємом 5,0-10,0 мл перенести надосадову рідину в ємність з дезінфікуючим розчином, залишивши в пробірці 1,2-1,5 мл осаду.

До осаду додати 0,5-1,0 мл буферного розчину для отримання нейтрального значення рН.

Закрити пробірку і струснути її вміст. Пробірку з осадом помістити в штатив, розмістивши її у порядку реєстраційних номерів матеріалу.

8. Стерильним пінцетом вносять тампон з мазком із носоглотки в стерильну пробірку для центрифугування (50,0 мл). Додають 2,0 мл стерильної дистильованої води. Проводять обробку матеріалу NALC-NаOH. Перед додаванням фосфатного буфера тампон виймають із пробірки.

9. Дослідження промивних вод шлунка має бути проведено впродовж перших 4 год після їх отримання від пацієнта, оскільки через високу кислотність М. tuberculosis можуть швидко загинути. Зазвичай під час дослідження промивних вод шлунка немає потреби здійснювати деконтамінацію, якщо пробу було взято в стерильний контейнер з дотриманням правил асептики. Увесь об’єм проби центрифугують за 3 000 g впродовж 30 хв. Відразу ж після цього роблять посів матеріалу на живильне середовище.

10. З метою виділення мікобактерій із сечі до зразка рекомендують додавати:

на об’єм до 20,0 мл - 1 краплю 1,0 % Твін 80, 1 краплю 20,0 % сульфосаліцилової кислоти і 0,1 мл білкового розчину (7,0-8,0 % стерильного бичачого сироваткового альбуміну, сироватки або плазми);

на об’єм 20,0-30,0 мл - 1 краплю 1,0 % Твін 80, 2 краплі 20,0 % сульфосаліцилової кислоти і 0,3 мл білкового розчину (7,0-8,0 % стерильного бичачого сироваткового альбуміну, сироватки або плазми);

на об’єм 30,0-50,0 мл - 1 краплю 1,0 % Твін 80, 3 краплі 20,0 % сульфосаліцилової кислоти і 0,5 мл білкового розчину (7,0-8,0 % стерильного бичачого сироваткового альбуміну, сироватки або плазми).

Проби сечі залишають на 2 год у холодильнику за температури +2 -°C. Зразки, об’єм рідини в яких перевищує 30,0 мл, слід розділити порівну на дві пробірки. Зразки центрифугують за 3 000 g впродовж 20 хв, зливають надосадову рідину. Потім обробку матеріалу проводять за методикою деконтамінації мокротиння (NaLC-NaOH), після чого негайно роблять посів на живильне середовище. Дослідження бактеріоскопії осаду сечі на КСП проводити недоцільно.

10. Лімфатичні вузли, біоптати та інші тканини, резецировані під час хірургічного втручання, потрібно подрібнити за допомогою стерильного скальпеля або ножиць і пінцета. Зразок гомогенізують у стерильній фарфоровій ступці або в гомогенізаторі тканин, додавши 0,5-1,0 мл стерильного ізотонічного розчину хлориду натрію і, за потреби, невелику кількість стерильного піску. Цю суспензію можна використати для посіву на живильне середовище у тих випадках, коли зазначені вище маніпуляції було проведено з дотриманням правил асептики. Якщо правил асептики не дотримувалися, проводять деконтамінацію проби 4,0 % розчином сірчаної кислоти, як це рекомендують робити під час обробки сечі. Якщо отриманий матеріал не може бути відпрацьований у день отримання проби, до зразка потрібно додати рівну за об’ємом кількість (не менше ніж 1,0 мл) стерильного ізотонічного розчину, щоб запобігти висиханню тканини. Зберігати матеріал у такому вигляді можливо не більше ніж 48 год у холодильнику за температури +4 -°C.

11. Гній обробляється так само, як і аспіровані рідини. Якщо гній дуже густий, його слід обробляти так само, як мокротиння.

12. Стерильно взяту спинномозкову рідину засівають без попередньої обробки.

Якщо стерильність зразка викликає сумніви, можна обробити його за методикою, описаною для мокротиння. Рекомендується проводити посів на рідкі живильні середовища. Якщо дозволяє об’єм зразка, доцільно розділити його на дві частини, посіявши одну з них без обробки, іншу - після обробки.

13. Слизово-гнійні рідини обробляють так само, як і мокротиння, коли об’єм проби становить 10,0 мл або менше.

14. Якщо матеріал отримано з дотриманням правил асептики, його центрифугують за 3 000 g впродовж 15 хв і відразу ж роблять посів осаду на живильне середовище. Якщо об’єм проби перевищує 10,0 мл, її обробляють так само, як промивні води шлунка.

15. Кров та інші рідкі матеріали з великою домішкою крові після додавання 3,0 % розчину лимоннокислого натрію центрифугують за 3 000 g, а осад тричі відмивають стерильною дистильованою водою.

М. tuberculosis можуть "приклеюватися" до скла або пластику. Щоб досягти максимального витягання мікобактерій, контейнер обполіскують стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію. Центрифугують розчин за 3 000 g впродовж 15 хв і роблять посів 2-3 крапель осаду на живильне середовище.

16. Близько 5,0 г калу переносять у пробірку. Заливають гіпернасиченим розчином NaCl (у розчині має міститися нерозчинена сіль) і залишають на 4 год у ШББ. Зразок фільтрують через стерильну марлю в центрифужну пробірку, центрифугують за 3 000 g упродовж 20 хв, зливають надосадову рідину. До осаду додають 0,3 % розчин хлорамфеніколу в пропорції 1 : 3. Зразок поміщають на ніч у холодильник за температури +2 -°C. Потім проводять обробку матеріалу за методикою деконтамінації мокротиння (NaLC-NaOH). Посів проводять як на щільні, так і в рідкі живильні середовища. Дослідження бактеріоскопії осаду калу на КСБ проводити недоцільно.

17. Під час внутрішньолабораторного контролю якості деконтамінації та оцінки можливих причин контамінації зразка, слід уточнити, чи не був занадто великим інтервал між збором зразка і його обробкою. Якщо це так, потрібно вжити заходів для організації транспортування зразків.

Потрібно суворо дотримуватися часу контакту зразка з деконтамінантом. Короткий час контакту призводить до високої частоти контамінації, занадто тривалий контакт викликає втрату життєздатності мікобактерій.

Потрібно переконатися, що ротор досягає необхідну відносну силу центрифугування 3 000 g і підтримує її впродовж 15 хв.

Контамінація може мати місце серед зразків, оброблених протягом одного дня або серед деконтамінованих зразків, зібраних у якому-небудь одному місці. У таких випадках слід перевірити стерильність розчинів для деконтамінації, виконання процедури деконтамінації чи організацію системи збору і транспортування зразків. Якщо виявлено помилки, слід прийняти негайні корегувальні дії. Якщо виявлено проблеми у виконанні процедури, слід провести навчання співробітників лабораторії, які виконують деконтамінацію.

Якщо має місце контамінація зразків від одного і того самого пацієнта, потрібно використовувати жорсткішу процедуру деконтамінації для обробки зразків від цього пацієнта. Треба збільшити концентрацію реактиву, але не термін обробки, використавши два об’єми розчину для деконтамінації одного об’єму зразка. Таку жорстку процедуру слід застосовувати тільки для обробки контамінованих зразків.

Крос-контамінація зразків від епідеміологічно не пов’язаних між собою пацієнтів може призвести до серії позитивних результатів бактеріологічного дослідження за короткий проміжок часу. У таких випадках слід оцінити можливість крос-контамінації для виключення хибнопозитивних результатів дослідження. Потрібно з’ясувати такі обставини:

чи мають пацієнти, які отримали позитивний результат культурального дослідження, клінічні симптоми туберкульозу;

чи отримано позитивний результат культурального дослідження під час дослідження інших зразків від тих самих пацієнтів;

чи не було оброблено один або декілька зразків із ростом одиничних колоній M. tuberculosis відразу після зразків із великою кількістю КСБ.

Якщо крос-контамінацію не може бути виключено, слід переконатися, що процедури виконуються правильно, зокрема такі:

деконтамінації зразків не проводиться паралельно з посівом культур мікобактерій;

під час внесення розчинів у пробірки не відбувається торкання шийки;

розчини реагентів діляться на аліквоти;

аліквотів розчинів, відкритих упродовж робочого дня, не використовують повторно;

зразки з високою вірогідністю КСБ+ обробляються і засіваються в останню чергу;

контейнери або пробірки зі зразками не відкриваються до того, як будуть закриті попередні;

контейнери або пробірки зі зразками не відкриваються безпосередньо після діставання із центрифуги;

надосадова рідина акуратно зливається в контейнер, що містить дезінфікуючій розчин, уникаючи розпліскування, наприклад, через воронку;

рукавички в ході роботи змінюють часто і ніколи не використовують повторно.

Тестування якості деконтамінації з використанням референс-штаму проводять із використанням референс-штаму мікобактерій. Можна використати будь-який доступний референс-штам або добре вивчений клінічний ізолят мікобактерій.

Прийнятніше використати швидкорослі НТМБ (M. fortuitum тощо). Під час проведення тестування оцінюється швидкість і рясність зростання деконтамінованої й необробленої суспензії мікобактерій.

Тестування проводиться щомісяця, кожного разу під час зміни реагентів, в разі незадовільних результатів контролю якості - щотижня.

Готують суспензію M. fortuitum у 2,0 мл стерильного фосфатного буфера за стандартом каламутності McFarland 1.

Суспензія 1: 0,1 мл суспензії вносять у 9,9 мл ізотонічного розчину хлориду натрію.

Суспензія 2: 1,0 мл суспензії 1 вносять у 9,0 мл ізотонічного розчину хлориду натрію.

Засівають по 0,2 мл суспензії 1 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена. Засівають по 0,2 мл суспензії 2 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена.

Залишки суспензії 1 і суспензії 2 піддають повній процедурі деконтамінації і центрифугування. Осад суспензії 1 ресуспендують в 1,0 мл стерильного буферу (суспензія 3). Осад суспензії 2 ресуспендують в 1,0 мл стерильного буферу (суспензія 4).

Засівають по 0,2 мл суспензії 3 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена. Засівають по 0,2 мл суспензії 4 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена.

Засівають по 0,2 мл суспензії 4 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена.

18. Через 5-7 днів інкубації оцінюють рясність росту M. fortuitum.

У пробірках, засіяних суспензією 1, має бути отримано густий ріст M. fortuitum (3+), у пробірках, засіяних суспензією 2,- помірний ріст (2+).

У пробірках, засіяних суспензіями 3 і 4, має бути отримано такий самий ріст (3+, 2+) або на ступінь нижче (2+, 1+).

У разі використання іншого референс-штаму слід проводити облік густоти росту після закінчення терміну, достатнього для появи видимого росту цього референс-штаму.

Процедурам деконтамінації й центрифугування піддають пробірку із середовищем Middlebrook 7Н9 чи ізотонічним розчином хлориду натрію, засіяну E. coli. Через 3 дні оцінюють наявність росту E. coli в контрольній пробірці та інших пробірках, оброблених одночасно, з метою встановлення можливої крос-контамінації.

Можна піддати процедурам деконтамінації й центрифугування незасіяну пробірку із середовищем Middlebrook 7Н9 чи ізотонічним розчином хлориду натрію. Через 3 дні оцінюють наявність росту в контрольній пробірці.

19. Для оцінки рівня контамінації визначають питому вагу контамінованих пробірок від загального числа засіяних пробірок для кожного живильного середовища. Така оцінка проводиться щомісяця, а в разі неадекватного рівня контамінації чи незадовільних результатів контролю якості - щотижня. Розрахунок рівня контамінації проводять за такою формулою:

Допустимий рівень контамінації для посівів у рідкі живильні середовища становить 6,0-8,0 %.

Високий рівень контамінації може бути викликано такими причинами:

недостатній час деконтамінації;

низька концентрація NaOH, NALC;

розчин NALC-NaOH приготований більше ніж 24 год тому;

незадовільна якість реагентів;

проблеми з референс-штамом (нежиттєздатний, неправильна каламутність суспензії);

нестерильні розчини.

Низький рівень контамінації, відсутність росту або незначний ріст культур мікобактерій може бути спричинено такими факторами:

перевищення часу деконтамінації зразків більше ніж на 20 хв;

завищена концентрація NaOH, NALC;

незадовільна якість реагентів;

проблеми з референс-штамом (нежиттєздатний, неправильна каламутність суспензії);

не належний рівень рН (вище ніж 8);

не належний режим центрифугування (час, швидкість, температура).

20. У випадках відхилення рівня контамінації від норми слід переконатися, що в лабораторії дотримуються таких вимоги внутрішнього контролю якості:

належні якість, термін придатності, концентрації реагентів і розчинів;

приготований робочий розчин використовується впродовж 24 год;

pH розчинів і зразка після деконтамінації не перевищує 8,0;

термін експозиції з деконтамінуючим розчином не перевищує 20 хв;

розчини і живильні середовища стерильні;

належна якість стерилізації в автоклаві й сухожаровій шафі;

належна якість контрольного штаму M. fortuitum.

У разі будь-якого відхилення від задовільних показників деконтамінації слід проаналізувати отримані результати й можливі причини цього.

Якщо в період, за який зареєстровано відхилення рівня контамінації, результати внутрішнього контролю якості живильних середовищ, обладнання і внутрішнього контролю якості деконтамінації, проведеної з використанням тест-штаму, були задовільними, змін до методики деконтамінації не вносять, а спостерігають за рівнем контамінації під час використання нової партії середовища.

Якщо мають місце незадовільні результати внутрішнього контролю якості деконтамінації, негайно здійснюють заходи для підвищення якості методу.

1. Для посіву діагностичного матеріалу використовують живильні середовища, серед яких можна виділити такі основні групи:

щільні живильні середовища на яєчній основі;

щільні або напіврідкі живильні середовища на агаровій основі;

рідкі живильні середовища;

рідкі синтетичні й напівсинтетичні живильні середовища.

Кожне із цих середовищ має свої переваги й недоліки. Оптимальне середовище для культивування M. tuberculosis має бути недорогим, простим у приготуванні, складатися з доступних компонентів. Крім того, середовище має пригнічувати ріст супутньої мікрофлори, забезпечувати хороший ріст під час посіву невеликої кількості мікобактерій і можливість попередньої диференціації колоній, що виросли, за морфологічними ознаками. Тобто оптимальне середовище повинне мати добрі інгібуючі, ростові й диференційні властивості. Яєчні середовища найбільшою мірою відповідають вище зазначеним вимогам у разі проведення посіву з мокротиння.

2. Переваги яєчних середовищ:

економічність (найбільш дешеві зі всіх середовищ, що використовуються для виділення мікобактерій) і простота приготування;

можуть зберігатися в холодильнику до 4 тижнів;

добре підтримують ріст більшості штамів М. tuberculosis;

дозволяють проводити попередню ідентифікацію мікобактерій за морфологією колоній;

малахітовий зелений, що входить до складу середовищ, пригнічує ріст супутньої мікрофлори, яка швидко росте, зменшуючи вірогідність контамінації посівів.

3. Недоліки яєчних середовищ:

поява росту мікобактерій упродовж 2-12 тижнів і довше;

у процесі культивування з’являється ріст супутньої мікрофлори, який спостерігається на всій поверхні живильного середовища, внаслідок чого ці пробірки потрібно відбраковувати. Для бактеріологічної діагностики ТБ потрібно використовувати щонайменше два різні за складом живильні середовища - Левенштейна-Єнсена і Фінна-II.

4. Середовище Левенштейна-Єнсена - щільне яєчне середовище, на якому хороший ріст М. tuberculosis одержують приблизно на 18-25 добу після посіву клінічного матеріалу з позитивним результатом мікроскопії на КСБ. До складу цього живильного середовища входить гліцерин, який сприяє росту M. tuberculosis. Для виділення M. bovis рекомендують варіант середовища Левенштейна-Єнсена, до складу якого замість гліцерину входить 0,5 % розчин пірувату натрію.

5. Середовище Фінна-II відрізняється від середовища Левенштейна-Єнсена тим, що замість L-аспарагіну в ньому використовується глутаміновокислий натрій (глутамат натрію) і склад солей розрахований так, що кінцева кислотність середовища має нижчі показники (рН 6,3-6,5), ніж у середовищі Левенштейна-Єнсена (рН 7,2-7,4), і більшу стабільність. Ці властивості обумовлюють більш високу ефективність середовища під час посіву матеріалу, обробленого лужними детергентами.

Ріст мікобактерій спостерігається на цьому середовищі на декілька днів раніше, ніж на середовищі Левенштейна-Єнсена, а відсоток виділення культур на 6,0-8,0 % вищий.

6. Вода для приготування живильних середовищ має бути дистильованою, вільною від речовин, що можуть сповільнити ріст мікроорганізмів.

Дистильовану воду зберігають у контейнерах, виготовлених із інертних матеріалів (наприклад, з нейтрального скла, поліетилену тощо), які мають бути вільними від будь-яких інгібуючих речовин.

Усі реактиви, що використовують для приготування живильних середовищ, повинні мати ступінь очищення не менше ніж категорія "ХЧ".

Посуд для приготування живильних середовищ має бути досить великого об’єму, щоб було зручно перемішувати середовище. Не слід готувати в одній ємності більше ніж 2,0 л середовища.

Під час приготування середовища потрібно використовувати хімічно чистий лабораторний посуд, а також щойно приготовлену дистильовану воду. Усі живильні середовища чутливі до нагрівання, тому не потрібно нагрівати їх довше, ніж цього потребує така процедура.

Для отримання якісного середовища й уникнення забруднення його сторонньою мікрофлорою рекомендують дотримуватися таких основних правил:

приміщення, де готують живильні середовища, утримують у максимальній чистоті. Рекомендують регулярно мити підлогу з додаванням дезінфікуючого засобу, а також протирати дезінфектантом обладнання й робочі поверхні. Перед приготуванням середовищ потрібно обробити приміщення УФ-опромінювачем;

використовувати тільки стерильний посуд;

використовувати потрібну кількість реагентів;

правильно проводити приготування розчинів, тобто використовувати мірний посуд, доводити об’єм розчину по нижній межі меніска;

постійно контролювати температуру у згортувачі;

не допускати перегріву середовищ у згортувачі;

суворо дотримуватись вимог асептики;

ретельно обробляти поверхню яєць перед їх розбиванням для приготування яєчної маси;

не піддавати готового середовища дії УФ променів;

зберігати готові середовища у темному прохолодному місці;

проводити контроль якості кожної партії приготованих середовищ;

розливати в пробірки по 5,0 мл середовища.

Для приготування щільних яєчних живильних середовищ використовують сольову основу різного складу залежно від найменування середовища, яке потрібно приготувати, яєчну масу та розчин малахітового зеленого (антисептик, який запобігає росту на середовищі не мікобактеріальної мікрофлори).

7. Нижче зазначено склад і рекомендації щодо приготування найбільш поширених щільних яєчних середовищ - Левенштейна-Єнсена та Фінна-II.

Левенштейна-Єнсена

Склад середовища

Розчин мінеральних солей:

Зазначені інгредієнти розчиняють у теплій дистильованій воді в зазначеній послідовності за слабкого підігрівання (не доводячи до кипіння) на водяній бані. L-аспарагін рекомендують розчиняти окремо і вносити останнім. Потім сольовий розчин стерилізують в автоклаві за 1 атм. (121 -°C) протягом 30 хв. Термін зберігання розчину становить 3-4 тижні за кімнатної температури.

Для культивування M. bovis середовище Левенштейна-Єнсена збагачують 0,5 % піруватом натрію, виключивши із сольового розчину гліцерин. Із цією метою до складу сольового розчину замість гліцерину додають 8,0 г пірувату натрію.

Розчин малахітового зеленого:

Наважку порошку малахітового зеленого потрібно розчинити в стерильній теплій дистильованій воді й помістити розчин у термостат на 1,0-2,5 год для більшого розчинення (рекомендують часте помішування, оскільки порошок розчиняється дуже погано). Потім профільтрувати розчин через паперовий фільтр, розлити по флаконах або невеликих колбах і стерилізувати за 1 атм. (+121 -°С) протягом 30 хв. Приготований розчин не підлягає тривалому зберіганню в разі появи осаду або зміни забарвлення його слід замінити свіжим розчином.

Для приготування яєчної маси свіжі (що зберігаються не довше ніж 7 днів) дієтичні курячі яйця без тріщин і дефектів шкаралупи ретельно відмивають у теплій проточній воді за допомогою ручних щіток і лужного мила. Потім яйця занурюють у 70,0 % етиловий спирт на 30 хв.

Перш ніж почати роботу з чистими й сухими яйцями, рекомендують ретельно вимити руки з милом і щіткою. Потім у стерильному боксі розбивають яйця стерильним ножем у стерильний посуд, доводячи загальний об’єм яєчної маси до 1 000 мл (для цього потрібно в середньому 20-25 яєць залежно від їх розміру).

Потрібна кількість яєчної маси визначається за об’ємом, а не за кількістю яєць. Ретельно перемішують яєчну масу стерильним вінчиком або в стерильному міксері за мінімальної швидкості. Потрібно мінімізувати утворення піни.

Для приготування середовища у велику стерильну ємність, дотримуючись правил асептики, поміщають такі розчини:

розчин мінеральних солей - 600 мл;

гомогенізована яєчна маса - 1 000 мл.

Суміш ретельно перемішують і фільтрують через стерильний марлевий фільтр, що має не менше ніж чотири шари марлі. Додають 20,0 мл розчину малахітового зеленого, ретельно перемішують, уникаючи утворення піни. Одразу розливають у пробірки приблизно по 5,0 мл, стежачи за тим, щоб у розчині не сформувалося осаду. Не допускати потряпляння піни в пробірки.

8. Для згортання середовища використовуються спеціальні апарати-згортувачі. Пробірки з розлитим у них середовищем поміщають у спеціальні касети з підібраним кутом нахилу для формування скосу середовища заввишки 8,0-10,0 см. Штативи встановлюють у згортувач і проводять коагуляцію за температури +80-85 -°C протягом 30 хв.

Згортання не є процедурою стерилізації, а тільки коагуляції.

Стерильність середовища забезпечується стерильними умовами його приготування і розливу.

Приготувння і розлив живильного середовища здійснюються в умовах дотримання стерильності, а якість приготованого яєчного середовища залежить від дотримання температурного і часового режимів коагуляції.

Приготована партія середовища повинна мати етикетку з датою виготовлення і зберігатися в холодильнику за температурою +4 -°C з ретельно закритими пробками для запобігання висиханню. Термін зберігання середовища не повинен перевищувати 4 тижні.

9. Середовище Фінна-II:

Розчин мінеральних солей:

Перелічені інгредієнти розчиняють у дистильованій воді в зазначеній послідовності за слабкого підігрівання (не доводячи до кипіння) на водяній бані. Кислотність не коригують. Стерилізують в автоклаві за 1 атм. (+121 -°С) протягом 30 хв. Термін зберігання розчину становить 3-4 тижні за кімнатної температури.

10. Приготоване яєчне середовище після його коагуляції має бути візуально оцінено. Правильно приготоване середовище має бути щільним і міцно прилипати до стінок пробірки. Вміст конденсату в пробірці із середовищем не повинен перевищувати 0,2 мл. Знебарвлення середовища або поява поглиблень чи бульбашок усередині середовища та на його поверхні свідчить про надмірну температуру коагуляції. Партію середовища з виявленими недоліками не можна використовувати для посіву і має бути знищено.

Однією з обов’язкових процедур внутрішнього контролю якості є перевірка приготованого середовища на стерильність і на ростові властивості.

Після згортання кожна приготована партія середовища спочатку піддається контролю на стерильність. Із цією метою шість пробірок зі свіжоприготовленої партії середовища поміщають у термостат за температури +37 -°C і витримують протягом трьох діб, що достатньо для росту забруднюючих мікроорганізмів.

Якщо принаймі 1 пробірка проростає супутньою мікрофлорою, аналогічним чином має бути перевірено 10 додаткових пробірок. Якщо хоча б в одній із цих 10 пробірок з’являється ріст, аналогічним чином має бути перевірено всі пробірки цієї партії. Усі пробірки з ростом забруднюючої мікрофлори слід видалити. Решту неконтамінованих пробірок може бути використано.

Потрібно проводити тестування ростових якостей кожної партії середовища за допомогою стандартного тест-штаму. Як тест-штам рекомендується використовувати лабораторний (музейний) штам M. tuberculosis H37Rv. Для приготування суспензії потрібно зробити змив чотирьохтижневої культури зі всієї поверхні щільного середовища, гомогенізувати суспензію за допомогою струшування на струшувачі (вортексі) протягом 1 хв і приготувати кілька її розведень.

Щоб утворити суспензію № 1, потрібно розвести бактеріальну суспензію за стандартом мутності 1 McF (3 x 10-8 КУО/мл).

Приготувати серійні десятикратні розведення культури із суспензії № 1, щоб одержати 3 x 10-3 і 3 x 10-4 бактерії в 1,0 мл.

Засіяти по 0,2 мл кожної із суспензій (3 x 10-3 і 3 x 10-4) на дві пробірки приготованої партії середовища. Розподілити інокулят по поверхні пробірок. Подальша інкубація - у звичайному порядку. Реєструвати щотижня ріст і відносний розмір колоній у пробірках, порівнюючи ріст на новоприготованій партії середовища з результатами росту, одержаними на попередній партії середовища й зафіксованими в журналі приготування середовищ (термін появи росту, кількість і розмір колоній).

Посів розведень 3 x 10-3 і 3 x 10-4 має дати ріст 1-10 і 10-100 колоній відповідно. За таких результатів росту на середовищах, що контролюються, їх якість вважають задовільною.

Контроль ростових властивостей середовища можна проводити одночасно з посівом діагностичного матеріалу. У разі незадовільної якості середовища негативні результати посіву, одержані на ній, вважаються недостовірними. Залишки незасіяного середовища має бути знищено.

11. Результати контролю якості середовищ фіксують у журналі приготування середовищ. У цьому журналі мають бути зазначені дата приготування середовища, об’єм приготованого середовища або кількість розлитих пробірок, ПІБ лаборанта, що приготував середовище, результати тесту на стерильність і на ростові якості (час появи росту для обох штамів, кількість колоній в різних розведеннях), дата проведення контролю, ПІБ лаборанта, що проводив контроль якості середовища, висновок про придатність середовища. Нове середовище придатне до вживання, якщо ріст на ньому еквівалентний або кращий, ніж на попередньому середовищі. Не використовувати партії середовища, якщо ріст на ньому гірший, ніж на попередній партії.

12. Мікроскопічне та бактеріологічне дослідження мають проводитися паралельно з однієї й тієї самої проби діагностичного матеріалу.

Перед процедурою посіву потрібно підготувати пробірки із живильними середовищами, пронумерувати їх відповідно до реєстраційних номерів зразків і послідовно розміщувати у вертикальному штативі. Так само потрібно підготувати й пронумерувати предметні скельця.

Осад, одержаний після попередньої обробки діагностичного матеріалу одним із вищезазначених методів, потрібно піддати паралельно бактеріологічному й мікроскопічному дослідженням.

Перед початком відбору посівного матеріалу в піпетку слід переконатися в тому, що номер пробірки з посівним матеріалом відповідає номерам пробірок з поживним середовищем і номеру предметного скла для приготування мазків:

набрати стерильною мірною піпеткою (краще одноразовою пастерівською пластиковою) 1,0-1,2 мл підготовленого осаду, залишивши приблизно 0,1-0,2 мл для подальшого приготування мазка для мікроскопії;

дотримуючись умов стерильності, внести потрібні об’єми набраного матеріалу в 2 пробірки з різними щільними живильними середовищами;

пробірки із живильним середовищем під час посіву мають знаходитися в похилому положенні (під кутом 40-45-°);

посівний матеріал нанести на середовище у верхню третину скосу живильного середовища;

засіяні пробірки закрити пробками і помістити в штатив так, щоб посівний матеріал рівномірно розподілився по всій поверхні скосу живильного середовища (краще використовувати пробірки з кришками, що загвинчуються);

залишок осаду забрати тією самою піпеткою й нанести на заздалегідь підготоване і пронумероване предметне скло 2-3 краплі осаду для отримання мазка для мікроскопічного дослідження, розподіливши матеріал рівномірним шаром у центрі скла на площі близько 1,0 x 2,0 см;

використану для посіву і приготування мазка піпетку опустити в ємність із дезінфікуючим розчином;

після закінчення посіву всіх проб засіяні пробірки перемістити в горизонтальні штативи і помістити в термостат за температури +37 -°C (при цьому поверхня скосу живильного середовища має знаходитися в горизонтальній площині, а нахил штатива має виключати змочування пробки матеріалом посіву в разі використання ватно-марлевих пробок).

Інкубація посівів з метою виділення M. tuberculosis потребує тривалого терміну для отримання видимого росту колоній. Тривалий термін інкубації потребує дотримання низки правил для збереження життєздатності клітин мікобактерій і ростових властивостей живильного середовища.

Оптимальна температура інкубації - 37 -°C.

У разі первиного посіву мікроскопічно негативного матеріалу середня тривалість росту мікобактерій на щільних живильних середовищах може становити 20-46 діб. Ріст окремих штамів спостерігається через 60 діб і більше. Це обумовлює необхідність, за відсутності росту мікобактерій, витримувати посіви в термостаті до 10 тижнів для видачі негативного результату.

У процесі інкубації посівів потрібно дотримуватися таких рекомендацій:

у разі використання ватно-марлевих пробок після закінчення першої доби інкубації їх замінюють герметичними;

пробірки переводять у вертикальне положення;

інкубацію проводять протягом 10 тижнів за обов’язкового щотижневого перегляду пробірок із посівами;

для полегшення процедури щотижневого перегляду та обліку, посіви, здійснені протягом одного дня, розміщувати в окремих ящиках із матеріалу, який піддається обробці дезінфектантами й автоклавуванню, або штативах у порядку номерів реєстрації. При цьому кожен штатив або ящик слід забезпечити етикеткою, на якій зазначаються дата посіву, перший та останній реєстраційні номери партії.

13. Під час оцінювання результатів культурального дослідження діагностичного матеріалу потрібно дотримуватися таких правил:

спостереження за посівами і перегляд пробірок з посівами слід проводити щотижня;

за відсутності росту посіви мають витримуватися в термостаті протягом 10 тижнів. Негативний результат бактеріологічного дослідження може бути видано тільки після закінчення цього терміну інкубації;

під час чергового перегляду слід відбирати всі пробірки, у яких є ріст колоній, розставляючи їх у порядку номерів реєстрації матеріалу;

реєструвати такі параметри:

"появу росту" - дату появи росту в пробірках (у тому разі, якщо ріст спостерігається одночасно в обох пробірках). Якщо культура виросла тільки в одній із пробірок (при цьому є хороший ріст культури у відповідні терміни), а в другій ріст відсутній, рекомендується зареєструвати дату появи росту і показник росту в пробірці з культурою, що виросла, і використовувати її для подальшої роботи, не чекаючи появи росту колоній в іншій пробірці. Другу пробірку залишають у термостаті для подальшої інкубації і за наявності в ній росту надалі реєструють отримані результати;

"інтенсивність росту" - число колоній, що виросли в кожній із пробірок. За наявності одночасного росту у пробірках рекомендується оцінити кількість КУО в кожній пробірці, що засіяна таким матеріалом. Цей показник має важливе діагностичне і прогностичне значення, особливо якщо посіви здійснюють у динаміці спостереження за хворим у процесі хіміотерапії;

"проріст" сторонньою мікрофлорою або грибами (за наявності такого);

"відсутність росту" (зазначений параметр реєструється через 10 тижнів культивування).

Дотримання зазначених правил дозволяє, по-перше, своєчасно виявляти видимий ріст мікобактерій або супутньої мікрофлори, а по-друге, на підставі реєстрації термінів появи росту і його особливостей здійснювати первинну ідентифікацію мікобактерій.

Поява росту кислотостійких мікобактерій протягом 7-10 днів культивування на щільних живильних середовищах може свідчити про виділення нетуберкульозних мікобактерій, що швидко ростуть, які не належать до комплексу M. tuberculosis, тому перед видачею відповіді такі культури мають піддатися первинній ідентифікації;

поява росту кислотостійких мікобактерій після 3-4 тижнів культивування свідчить про виділення M. tuberculosis, а також інших мікобактерій, що повільно ростуть, які можуть належати до потенційно патогенних нетуберкульозних мікобактерій або до нешкідливих кислотостійких сапрофітів.

Під час щотижневих переглядів посівів за підозри на забруднення сторонньою мікрофлорою потрібно видалити і знешкодити ті пробірки, у яких спостерігається забруднення всієї поверхні живильного середовища чи зміна живильного середовища (розрідження або знебарвлення).

Мікроорганізми, які забруднюють посіви, мають здатність розкладати інгредієнти середовища з утворенням кислоти, що призводить до зниження pH-середовища. На такому середовищі мікобактерії не ростуть, а ці пробірки підлягають видаленню.

Посіви із частковим забрудненням потрібно витримати до закінчення терміну інкубації або до розвитку хоча б декількох колоній мікобактерій, оскільки пізня поява забруднення не виключає росту M. tuberculosis. У таких випадках потрібно зробити мазок, пофарбувати його за методом Ціля-Нільсена і за наявності кислотостійких мікобактерій обробити культуру, що виросла, 3,0-4,0 % розчином сірчаної кислоти, а після відмивання її ізотонічним розчином хлористого натрію знову посіяти осад на живильні середовища.

У всіх випадках отримання росту, щоб уникнути невірного результату, відповідь про виділення кислотостійких мікобактерій видається тільки після мікроскопії мазка з колоній, що виросли, забарвленого за методом Ціля-Нільсена.

14. Вірулентні культури M. tuberculosis ростуть на щільних живильних середовищах у вигляді R-колоній різного розміру та вигляду, мають жовтуватий або злегка кремовий відтінок (колір слонової кістки), шорстку поверхню, що нагадує манну крупу або цвітну капусту. Колонії сухі, зморшкуваті, але в разі дисоціації можуть траплятися й вологі, злегка пігментовані колонії, рожево-жовтий пігмент яких суттєво відрізняється від оранжевого чи жовтого пігменту сапрофітних або деяких нетуберкульозних мікобактерій. Останні ростуть у S-формі. Слід зазначити, що на середовищі Фінна-II колонії часто виглядають вологішими, ніж на середовищі Левенштейна-Єнсена.

Після курсу хіміотерапії від хворих на туберкульоз можуть виділятися гладкі колонії з вологим ростом (S-форми).

Під час приготування мазків для мікроскопічного дослідження колонії M. tuberculosis проявляють свої фізико-хімічні особливості: вони не емульгуються в ізотонічному розчині, а утворюють зернисту крихтоподібну суспензію.

Під час мікроскопічного дослідження мазків із колоній, забарвлених за Цілем-Нільсеном, виявляються яскраві малиново-червоні паличкоподібні бактерії, що розміщуються поодиноко або групами. Під час культивування на рідких середовищах або в умовах підвищеної вологості M. tuberculosis утворюють скупчення чи переплетення у вигляді "кіс" - феномен "корд-фактора".

M. tuberculosis виглядають як тонкі, прямі або злегка зігнуті палички завдовжки 1-10 (частіше 1-4) мкм, завширшки 0,2-0,6 мкм, гомогенні або зернисті з ледь заокругленими кінцями. Часто в препараті, особливо з культур, що тривало ростуть, видно скупчення темно забарвлених зерен. У молодих культурах, особливо виділених від хворих, які тривалий час лікуються протитуберкульозними препаратами, мікобактерії відрізняються великим поліморфізмом аж до появи коротких, майже кокоподібних, форм.

Нетуберкульозні мікобактерії та авірулентні сапрофітні мікобактерії можуть варіювати за формою колоній і морфологією клітин. Деякі з них грубіші, товщі, іноді менш інтенсивно забарвлені, рідко утворюють джгутоподібні скупчення ("корд-фактор", зазвичай, відсутній). Проте деякі види нетуберкульозних мікобактерій (фотохромогенні) можуть рости у вигляді характерної для М. tuberculosis R-форми. Багато нетуберкульозних і сапрофітних мікобактерій мають кислотостійкі зерна, схожі за морфологією з такими у вірулентних M. tuberculosis.

Остаточний висновок про належність виділеної культури до комплексу M. tuberculosis можна зробити тільки після первинної диференціації культури, що здійснюється в ході проведення тесту на медикаментозну чутливість. Потрібно здійснити подальшу ідентифікацію виділеної культури, що дасть можливість віднести мікобактерії до того чи іншого виду.

15. Під час виділення культури кислотостійких мікобактерій відповідають певним характеристикам, а саме:

поява росту колоній на щільних живильних середовищах не раніше ніж через 3-4 тижні інкубації;

наявність колоній характерної морфології й забарвлення;

мікроскопічне підтвердження кислотостійкості виділеного мікроорганізму в разі забарвлення за методом Ціля-Нільсена потрібно провести напівкількісне оцінювання інтенсивності росту.

Усі характеристики мікобактерій, що виросли на щільних живильних середовищах, заносяться до лабораторного журналу обліку результатів культуральних досліджень, до бланків відповідей, а також до картотеки. Результати дослідження реєструються та зберігаються в лабораторному модулі Реєстру хворих на ТБ.

16. Аналізатор BACTEC MGIT 960/320 являє собою повністю автоматизований комплекс для одночасної інкубації та моніторингу 960/320 пробірок. Культивування мікобактерій здійснюється в індикаторній пробірці MGIT, що містить 7,0 мл модифікованого середовища Middlebrook 7H9. Ця система дає можливість виявляти у клінічних зразках більшість штамів M. tuberculosis протягом 10-20 днів і визначати чутливість культури збудника до медикаментозних препаратів у термін, що не перевищує двох тижнів.

Аналізатор BACTEC MGIT 960/320 є єдиною повністю автоматизованою системою для визначення чутливості мікобактерій до медикаментозних препаратів, яка забезпечує прискорене тестування культури до майже всіх препаратів, у тому числі й до піразинаміду.

Матеріалом дослідження на аналізаторі BACTEC MGIT 960/320 можуть бути респіраторні зразки, насамперед мокротиння, будь-які біологічні рідини (крім крові й сечі), а також виділення ран, промивні води шлунка і тканини організму, отримані під час хірургічних втручань. Умови збору діагностичного матеріалу і його якість мають відповідати існуючим вимогам, оскільки преаналітичний етап значно впливає на результати дослідження. Найбільш зручною ємністю для збору клінічних зразків вважають стерильну градуйовану пробірку на 50,0 мл з кришкою, що загвинчується і перешкоджає розбризкуванню матеріалу під час відкривання. Оптимальна кількість рідкого діагностичного матеріалу має становити близько 5,0 мл.

Перед інокуляцією в рідкі середовища розрідження й деконтамінацію матеріалу рекомендується проводити з використанням NALC-NAOH (за методом Kubika) з подальшим отриманням осаду в результаті центрифугування (за 3 000 g протягом 15 хв).

Цей метод дозволяє перетворити зразок у сконцентровану гомогенну суспензію, у якій практично знищена будь-яка мікрофлора, крім мікобактерій, що зберегли життєздатність. За такої обробки одним із факторів збільшення ефективності культурального (як і мікроскопічного) дослідження є збереження реакції середовища, близького до нейтрального (рН 6,8).

Виявлення мікобактерій із використанням системи бульйонного культивування обов’язково передбачає паралельний посів зразка на щільне яєчне середовище. Інокуляцію діагностичного матеріалу в рідке середовище проводять одночасно з посівом на щільне яєчне середовище, що потрібно для більш повного задоволення живильних потреб мікобактерій, які можуть дати ріст тільки на одному із середовищ. Цей принцип дозволяє також уникнути деяких помилок, пов’язаних із технічними похибками, неправильною інтерпретацією росту в позитивній пробірці.

З метою підтвердження належності культури, що виросла на рідкому середовищі будь-якого аналізатора, до комплексу M. tuberculosis потрібно проводити бактеріоскопію за Цілем-Нільсеном і субкультивування на щільному яєчному середовищі вмісту позитивної процесорної ємності. Використання ПЛР-аналізу (ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція) з метою диференціювання комплексу M. tuberculosis і НТМБ у разі отримання позитивних результатів в автоматизованій системі може на 7 днів і довше скоротити час бактеріологічної діагностики туберкульозу.

17. Аналізатор ВАСТЕС MGIT 960/320 працює на прнципах технології MGIT: індикаторні пробірки після внесення до них діагностичного матеріалу інкубуються у приладі й періодично піддаються УФ-тестуванню.

Важливим компонентом системи ВАСТЕС MGIT 960/320 є пробірка MGIT із флуоресцентним індикатором, світіння якого погашене киснем. Мікробна популяція, що розмножується, активно поглинає кисень, вивільняючи флуоресцентний компонент, який починає світитися в промені ультрафіолетового світла.

Прискорення росту мікобактерій і зниження контамінації забезпечується доповненням бульйону 7Н9 рідкою живильною добавкою OADC і п’ятьма ліофілізованими антибіотиками PANTA, які вносять до індикаторної пробірки перед посівом. OADC містить чотири живильні компоненти: олеїнову кислоту, бичачий сироватковий альбумін, декстрозу і каталазу.

Суміш PANTA містить препарати, що пригнічують життєдіяльність Грам+, Грам–, анаеробних бактерій, а також грибів. Вона складається з поліміксину В, амфотерицину В, налідиксової кислоти й азлоциліну. Прилад ВАСТЕС 960 оцінює пробірку як позитивну, якщо кількість живих мікроорганізмів у ній досягла 10-5-10-6 на 1,0 мл середовища.

Таким чином, прилад ВАСТЕС MGIT 960/320 здійснює комп’ютерний моніторинг стану бактеріальної популяції у збагаченому рідкому живильному середовищі Middlebrook 7H9 і сигналізує про розмноження мінімальної кількості мікроорганізмів.

Пробірки MGIT на 7,0 мл призначені для культивування мікобактерій із використанням приладу BACTEC 960/320. У кожній пластиковій пробірці з кришкою, що загвинчується, міститься 7,0 мл середовища Міддлбрука 7Н9, яке перед інокуляцією збагачується живильними добавками й антимікробними речовинами для запобігання контамінації. Інокулятом можуть слугувати заздалегідь оброблені (розріджені, деконтаміновані й концентровані) клінічні зразки, за винятком сечі, стерильні біологічні рідини (виключаючи кров) та культури мікобактерій. Пробірки також призначені для визначення медикаментозної чутливості мікобактерій, за винятком піразинаміду. Пробірки поставляються у картонній коробці, що містить 100 пробірок. Температура зберігання +2-25 -°C.

Набір MGIT 960/320 Supрlement складається із шести флаконів із 15,0 мл ростової добавки OADC, що містить олеїнову кислоту, бичачий альбумін, глюкозу і каталазу, а також із шести флаконів із ліофілізованою сумішшю антибіотиків PANTA, що містять поліміксин Б, амфотерицин Б, налідиксову кислоту, триметопід часм і азлоцилін. Кожен набір розрахований приблизно на 100 пробірок, температура зберігання +2-8 -°C.

Набір MGIT 960/320 IRE Kit призначений для визначення чутливості культури мікобактерій до критичних концентрацій ізоніазиду, рифампіцину й етамбутолу, містить по одному флакону кожного з препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин та етамбутол) у ліофілізованому стані, а також вісім флаконів по 20,0 мл збагачувальної добавки MGIT 960 AST supplement (OADC), яка відрізняється від аналогічної добавки, призначеної для виявлення мікобактерій, за кількісним співвідношенням компонентів. Перед додаванням до пробірок MGIT, препарати слід розчинити у 4,0 мл стерильної деіонізованої води. Набір розрахований на 40 тестів, температура його зберігання +2-8 -°C.

Набір BACTEC MGIT 960/320 PZA Kit призначений для визначення чутливості мікобактерій до піразинаміду, містить два флакони з ліофілізованим піразинамідом і шість флаконів живильної добавки.

Перед додаванням піразинаміду до пробірок MGIT з пониженим рН (5,9) його слід розчинити в 2,5 мл стерильної дейонізованої води. Набір розрахований на 50 тестів, температура його зберігання - 2-8 -°C.

Пробірки MGIT 960/320 PZA призначені для визначення чутливості мікобактерій до PZA. Пробірка містить 7,0 мл модифікованого бульйону Міддлбрука 7Н9 зі зниженим значенням (рН = 5,9). Пробірки поставляються в картонній коробці по 25 штук. Температура зберігання пробірок - 2-25 -°C.

Набір MycoPrep призначений для розрідження й деконтамінації клінічних зразків, направлених для мікроскопічного та культурального досліджень з метою виявлення кислотостійких мікобактерій. Набір складається з десяти флаконів (по 75,0 мл або по 150 мл) 2,0 % розчину NаOH, де в кожному флаконі міститься скляна ампула з порошкоподібним муколітиком NALC, а також із пакетів фосфатного буфера.

Безпосередньо перед використанням розчину NALC-NaOH (перед додаванням в його в рівному об’ємі до досліджуваного зразка) ампулу слід розчавити всередині флакона. Кожен пакет із солями для фосфатного буфера розчиняють у 0,5 л очищеної води й заздалегідь стерилізують автоклавуванням. Температура зберігання набору +2-25 -°C.

Реагенти для обробки клінічних зразків можна приготувати в умовах лабораторії.

Для отримання деконтамінуючого розчину, що містить 2,0 % NаOH (з цитратом натрію), потрібно з’єднати рівні об’єми 4,0 % NаOH і 2,9 % цитрату натрію або розчинити в 1 літрі дистильованої води:

Перед обробкою додають порошок муколітичного (розріджувального) агента NALC до розчину NaOH-цитрат із розрахунку 0,5 г на 100 мл. Після додавання NALC суміш NALC-NaOH може бути використано тільки протягом 24 год, оскільки після закінчення зазначеного терміну розчин швидко втрачає муколітичну активність.

Цитрат натрію додають до розчину NаOH, щоб зв’язати іони важких металів, що можуть бути наявні у зразку й інактивувати NALC.

У разі високого забруднення зразків сторонньою мікрофлорою концентрацію гідроксиду натрію в початковому розчині можна збільшити до 3,0 %.

Для отримання фосфатного буфера в 1 л дистильованої води потрібно розчинити:

Стерилізація буфера проводиться в автоклаві за за температури +121 -°C протягом 15 хв у ємності з кришкою, що частково відкручена. Після охолодження розчину за кімнатної температури кришку слід щільно закрутити.

18. Перш ніж провести інокуляцію в індикаторну пробірку MGIT, потрібно виконати попередню обробку клінічного зразка з метою його розрідження, деконтамінації та концентрації. Якнайкращі результати забезпечує обробка 2,0-3,0 % розчином NаOH з NALC, яку рекомендують здійснювати в ламінарній шафі з дотриманням стерильності за такою схемою:

до зразка (під часблизно 5,0 мл), що міститься в пластиковій градуйованій пробірці об’ємом 50,0 мл, додати рівний об’єм NALC-NaOH або препарату MycoPrep;

щільно закривши кришку, змішати вміст пробірки струшуванням або за допомогою вортексу 15-30 с, прагнучи досягти повного розрідження, і залишити на 15 хв за кімнатної температури, перевертаючи для змішування кожні 5 хв;

додати фосфатний буфер до відмітки "50,0 мл" і змішати струшуванням (після додавання фосфатного буфера рН досліджуваного матеріалу відповідає значенню 6,8;

центрифугувати зразок протягом 15 хв за 3 000 g, залишивши у шафі біологічної безпеки на 5 хв для осадження аерозолів;

видалити надосадову рідину;

додати до осаду 1,0 мл фосфатного буфера, загальний вміст має скласти 1,5-2,0 мл.

Використовувати отриманий матеріал для:

посіву в пробірки MGIT;

посіву на щільне середовище;

приготування мазків;

молекулярно-генетичних досліджень (GeneXpert тощо).

Якщо матеріал не використовують негайно, його потрібно заморозити (-20 -°С).

19. Інокуляцію осаду обробленого матеріалу в індикаторні пробірки MGIT проводять за допомогою одноразової пастерівської піпетки. Для цього потрібно:

зняти кришку, що відкручується, з пробірки MGIT;

додати вміст флакона зі збагачувальною добавкою MGIT (Growth supplement) (15,0 мл) до флакона з ліофілізованими антибіотиками PANTA;

перенести 0,8 мл отриманої суміші до пробірки MGIT;

внести 0,5 мл осаду діагностичного матеріалу до пробірки MGIT і паралельно провести посів 0,2 мл матеріалу на щільне середовище Левенштейна-Єнсена або Фінна-II та нанести краплю на предметне скло, промарковане заздалегідь;

переконавшись, що пробка пробірки щільно закручена, перевернути пробірку для перемішування вмісту та провести завантаження пробірки в прилад ВАСТЕС 960 відповідно до інструкції з експлуатації.

Для інкубації пробірок у системі потрібно відкрити один із ящиків приладу ВАСТЕС MGIT 960/320 і натиснути кнопку "Tube enter", що з’явилася на екрані ("завантаження пробірки"). При цьому загорається лампа сканера для зчитування штрих-коду з пробірки.

Відсканувати сканером штрих-код пробірки з інокулятом і встановити її у гніздо, що рекомендує прилад.

Слід щодня перевіряти показання приладу на предмет появи позитивних і негативних результатів.

Про позитивний результат (ріст мікобактерій) свідчить червоний сигнал позитивного індикатора на відповідному ящику і значок на дисплеї приладу.

У разі появи інформації про позитивний результат потрібно відкрити зазначений ящик, натиснути кнопку "positive", що з’явилася на екрані, витягнути відповідну пробірку з гнізда і відсканувати штрих-код.

Пробірки, у яких не зафіксовано приладом росту мікобактерій протягом 42 діб, оцінюються системою як негативні. Про негативний результат (відсутність росту мікобактерій) свідчить зелений сигнал негативного індикатора на відповідному ящику і значок на дисплеї прилаладу.

У разі появі інформації про негативний результат потрібно відкрити зазначений ящик, натиснути кнопку "negative", що з’явилася на екрані, витягнути зазначену пробірку з гнізда і просканувати її штрих-код.

20. Позитивний результат, що свідчить про зростання культури в індикаторній пробірці, може реєструватися із четвертого дня після інокуляції, а позитивний сигнал у першу - третю добу може бути розцінений як мікробна контамінація зразка.

Для підтвердження росту мікобактерій, а також ідентифікації M. tuberculosis у позитивній пробірці проводять певні процедури.

Видаливши позитивну пробірку з приладу, слід візуально оцінити прозорість бульйонного середовища для визначення можливого росту мікобактерій.

Зазвичай ріст культури M. tuberculosis виявляється у вигляді характерних придонно розміщених пластівців, які за незначного струшування піднімаються й поширюються по всьому середовищу, а рідке середовище зберігає прозорість. Помутніння середовища в позитивній пробірці свідчить про можливу контамінацію сторонньою флорою.

Приготувати мазок за методом Ціля-Нільсена для виявлення кислотостійких мікобактерій.

Провести субкультивування на щільне яєчне середовище для підтвердження росту типових колоній мікобактерій.

Провести субкультивування на середовищі Левенштейна-Єнсена, що містить 500 мкг/мл саліциловокислого натрію або 500 мкг/мл паранітробензойної кислоти, для диференціації M. tuberculosis і НТМБ.

Для того, щоб переконатися у відсутності контамінації позитивної пробірки сторонньою мікробною флорою, слід приготувати мазки із забарвленням за Грамом і провести пересіви вмісту пробірки на чашку з кров’яним агаром. Наявність росту на чашці в результаті інкубації протягом 24 год за температури 37 -°C свідчить про мікробну контамінацію матеріалу.

За наявності ніацинового, нітратредуктазного чи імунохроматографічного тестів доцільно провести ідентифікацію позитивної культури, отриманої після культивування в автоматизованій системі.

21. Позитивний результат, що свідчить про виділення культури M. tuberculosis, видається на 5-41 день за таких умов:

позитивний сигнал приладу + наявність мікроколоній у вигляді "кіс" під час бактеріоскопії, позитивної проби, забарвленої за Цілем-Нільсеном;

позитивний сигнал приладу + кислотостійкі бактерії під час бактеріоскопії + характерний ріст колоній на щільному середовищі + відсутність росту на середовищі Левенштейна-Єнсена, що містить 500 мкг/мл саліциловокислого натрію;

позитивний сигнал під часладу + відсутність кислотостійких бактерій і мікроколоній контамінуючої мікрофлори під час бактеріоскопії + характерний ріст колоній на щільному середовищі + відсутність росту на середовищі Левенштейна-Єнсена, що містить 500 мкг/мл саліциловокислого натрію;

позитивний сигнал прилаладу + кислотостійкі бактерії і мікроколонії контамінуючої мікрофлори під час бактеріоскопії + характерний ріст колоній мікобактерій на щільному середовищі (за відсутності контамінації в контрольному мазку із цього щільного середовища) + відсутність росту на середовищі Левенштейна-Єнсена, що містить 500 мкг/мл саліциловокислого натрію;

позитивний сигнал приладу + кислотостійкі бактерії або відсутність кислотостійких бактерій і мікроколоній контамінуючої мікрофлори під час бактеріоскопії + позитивний результат ПЛР із праймерами для M. tuberculosis із позитивної процесорної ємності.

Негативний результат росту M. tuberculosis на автоматизованих системах видається на сорок другий день. За наявності ознак можливого росту M. tuberculosis на щільному середовищі (наприклад, є колонії у вигляді пластівців у рідкій фазі над скосом) негативна відповідь видається за результатами відсутності росту мікобактерій на щільному середовищі через 10 тижнів (70 днів).

Контроль якості виконується під час отримання кожної нової партії пробірок з використанням колекційних штамів таких мікобактерій: M. tuberculosis ATCC 27294, M. kansasii ATCC 12478 і M. fortuitum ATCC 6841. Контроль якості можна проводити за допомогою інших лабораторних штамів. Зокрема, штам M. tuberculosis Н37Rv (під час посіву в пробірку MGIT 0,5 мл мікробної суспензії, приготованої по 0,5 стандарту McFarland і розведенню 1 : 100) має дати ріст, підтверджений позитивним сигналом ВАСТЕС 960, на 7-9 день після внесення до приладу.

Прийнятним для збагаченого рідкого середовища вважається рівень контамінації, що досягає 5,0-8,0 % від загального числа посівів. У разі підвищення рівня контамінації більше ніж на 10,0 % потрібно терміново виявити причини і вжити заходів щодо їх усунення.

У разі отримання позитивного результату під приладу ВАСТЕС 960 (із 4 по 42 день) потрібно переконатися, що в рідкому середовищі позитивної пробірки не міститься контамінуючих мікроорганізмів. Якщо в результаті мікроскопії за Цілем-Нільсеном виявлено мікобактерії, а під час посіву на кров’яний агар контамінація матеріалу в пробірці підтверджена, за потреби можна провести повторну деконтамінацію і спробувати виділити чисту культуру мікобактерій. Із цією метою потрібно зробити таке:

перенести увесь контамінований вміст із позитивної пробірки MGIT до стерильної об’ємом 50,0 мл;

додати рівний об’єм стерильного 4,0 % розчину NAOH і провести обробку за методом Петрова;

зробити посів на щільне яєчне середовище.

Як заходи боротьби з контамінацією посівів, здійснюваних за допомогою автоматизованих систем, можуть бути рекомендовані такі заходи:

збільшення концентрації лугів під час первинної обробки матеріалу (не більше ніж до 1,5 % після з’єднання зі зразком);

збільшення часу обробки мокротиння розчином NALC-NaOH до 25 хв;

збільшення концентрації PANTA шляхом зменшення кількості рідкої добавки, яку використовують для розчинення ліофілізованої PANTA (більш концентрований розчин PANTA можна одержати під час розчинення PANTA у 10,0 мл (замість 15,0 мл) збагачувальної добавки, де перед інокуляцією до пробірки МGIT додають звичайний об’єм - 0,8 мл розчину отриманої суміші).

Зміни параметрів обробки мокротиння рекомендують проводити в зазначеному порядку. Слід пам’ятати, що в разі надмірного збільшення концентрації PANTA може спостерігатися пригнічення росту деяких видів мікобактерій (але не M. tuberculosis). Не варто змінювати відразу декілька параметрів одночасно.

Якщо контамінація одним(и) і тим(и) самим(и) видом (видами) мікроорганізмів спостерігається часто, її причина - у недостатній чистоті реактивів або відсутності стерильності реагентів і посуду.

Загальним правилом є аліквотування розчинів невеликими об’ємами. Таким чином, кожного разу використовують свіжий розчин, а розчину, що залишився від аліквоти, не зберігають.

Важливим фактором боротьби з контамінацією є скорочення часу зберігання мокротиння, чим попереджається його забруднення сторонньою мікрофлорою. За потреби, зберігати мокротиння слід у холодильнику за температури +4 -°C.

У процесі деконтамінації мокротиння розчином NALC-NaOH важливо кілька разів перевернути пробірку, щоб дії розчину було піддано всі ділянки внутрішньої стінки пробірки, особливо в її верхній частині.

1. У бактеріологічних лабораторіях II-III рівнів має проводитися попередня ідентифікація комплексу M. tuberculosis (родова ідентифікація).

Основою ідентифікації є такі характеристики:

швидкість росту бактерій довше ніж 10 днів;

морфологія і забарвлення колоній;

результати дослідження мазків, приготованих із виділеної культури й забарвлених за методом Ціля-Нільсена.

Під час перегляду посівів проводиться вивчення усіх культур, що виросли. На підставі морфологічних ознак колоній здійснюється попередній розподіл культур на ті, що належать до M. tuberculosis complex, нетуберкульозні мікобактерії та споріднені таксони.

Колонії M. tuberculosis на більшості живильних середовищ виглядають сухими, світло-кремового кольору, шорсткими (R-форма), товстими, піднятими в центрі, з вузлуватою або зморшкуватою поверхнею і нерівними краями (нагадують цвітну капусту).

На деяких живильних середовищах (Фінна-II, ліофілізованому середовищі Левенштейна-Єнсена) або під час обробки діагностичного матеріалу 1,0 % розчином сірчаної кислоти (без подальшої нейтралізації) колонії виглядають напівкулястими, гладкими (S-форма), м’якими, вологими, іноді злегка складчастими. Ріст культури M. tuberculosis характеризується як пишний - еугонічний. Після курсу хіміотерапії від хворих на ТБ можуть виділятися гладкі колонії з вологим ростом (S-форми).

M. bovis на середовищі Левенштейна-Єнсена показує дисгонічний ріст, що стелиться.

Колонії більшості нетуберкульозних мікобактерій морфологічно не схожі з M. tuberculosis. Сапрофітні мікобактерії можуть варіювати за формою колоній. Вони бувають гладкі, круглі, вологі, блискучі, куполоподібні, маслянисті. Добре емульгуються у воді. Іноді можуть мати проміжну форму. Колонії кремового кольору М. fortuitum, M. chelonae, М. kansasii і М. terrae complex бувають сухі і зморшкуваті, тому їх іноді помилково приймають за M. tuberculosis. Забарвлення колоній НТМБ може бути від білого, тілесного і кремового кольорів до світло-жовтого, жовтого і помаранчевого. Ріст культури НТМБ може бути пишним або таким, що стелиться, і мати випіт, тобто може бути дисгонічним.

Морфологічно колонії споріднених мікроорганізмів відрізняються від колоній M. tuberculosis, проте деякі види нетуберкульозних мікобактерій (фотохромогенні) можуть рости у вигляді характерної для M. tuberculosis R-форми. Оскільки нетуберкульозні мікобактерії також можуть викликати захворювання людини (мікобактеріози), вони також підлягають вибору для подальшої ідентифікації.

Головною відмінною особливістю роду мікобактерій є сувора кислото-, луго- і спиртостійкість, тому першим ступенем ідентифікації є мікроскопія усіх виділених культур із забарвленням мазків за методом Ціля-Нільсена.

2. Потрібно приготувати мазки з усіх культур, відібраних під час перегляду посівів.

Забарвити мазки за методом Ціля-Нільсена.

Провести мікроскопію мазків.

У разі забарвлення методом Ціля-Нільсена КСБ виглядають червоними на синьому фоні. Мікобактерії мають вигляд тонких, ледь зігнутих паличок, коротких, завдовжки 1-10 (частіше 1-4) мкм, завширшки 0,2-0,6 мкм, гомогенних або зернистих із трохи заокругленими кінцями. У мазках культури M. tuberculosis, що виросла на напіврідкому або рідкому середовищі, можна побачити мікроколонії мікобактерій у вигляді кіс і джгутів, феномен "корд-фактора".

У разі приготувння мазків для мікроскопічного дослідження колонії M. tuberculosis проявляють свої фізико-хімічні особливості: вони не емульгуються в ізотонічному розчині, а утворюють зернисту крихтоподібну суспензію.

Під час перегляду мазка слід звернути увагу на морфологічні особливості паличок і розміщення їх у препараті. НТМБ у мазку з культури можуть розміщуватись у вигляді частоколу, паркету або мати форму кокобацил. Незважаючи на те, що морфологічна характеристика паличок може асоціюватися з певним видом мікобактерій, це не є підставою для видової ідентифікації.

У разі підтвердження кислотостійкості культур, що виросли, їх відносять до роду мікобактерій і проводять подальше вивчення.

На підставі морфології колоній і позитивного забарвлення мазка з культури видається попередня відповідь.

Група споріднених мікроорганізмів (нокардії, родококи тощо) відрізняється частковою або слабкою кислотостійкістю. У мазку можна одночасно спостерігати червоні і сині палички або фіолетово-сині кокобацили. Морфологічно в мазку з культури вони представлені у вигляді міцелію, що фрагментується на палички, або крупних поліморфних паличок.

Для диференціації роду мікобактерій і споріднених таксонів, окрім описаного тесту, додатково можна використовувати забарвлення мазка за методом Грама.

Мікобактерії мають дуже слабке забарвлення за Грамом. Нокардії, родококи та коринебактерії, що добре сприймають забарвлення за Грамом,- грампозитивні.

На підставі властивостей мікобактерій і споріднених таксонів (додаток 3) та швидкості росту проводиться визначення роду виділеної культури. У споріднених мікроорганізмів відзначається слабка або часткова кислотостійкість, швидкий ріст на простих і яєчних середовищах, виражене забарвлення за методом Грама і значний поліморфізм у разі мікроскопічного дослідження мазка. Нокардії й родококи не мають важливого клінічного значення і можуть досліджуватися в наукових лабораторіях.

Рід мікобактерій характеризується суворою кислотостійкістю в разі забарвленні за методом Ціля-Нільсена і слабким забарвленням за Грамом. У мазках мікобактерії представлені у вигляді довгих, тоненьких або коротких паличок. Мікобактерії характеризуються повільним ростом у разі посіву діагностичного матеріалу на яєчні середовища.

Після оцінки культур, що виросли, лікар-бактеріолог робить висновок про належність культури до комплексу M. tuberculosis, про що робить відмітку у відповідній графі журналу реєстрації досліджень і видає відповідь за результатом культурального дослідження.

3. Диференціація M. tuberculosis complex від НТМБ має проводитися в лабораторіях II і III рівнів. Культури, віднесені за морфологічними властивостями до M. tuberculosis complex, потрібно диференціювати від НТМБ.

У роботі лабораторії трапляються культури, які за морфологічними ознаками не вкладаються в характеристику M. tuberculosis, але показують кислотостійкі властивості під час забарвлення мазка. І навпаки: у разі зовнішньої схожості вирощених колоній із колоніями M. tuberculosis мікроскопічна картина (дрібні палички, кокобацили) викликають сумніви щодо належності культури до цього виду. У подібних випадках не можна видавати відповіді про виділення M. tuberculosis до проведення диференціальної діагностики з НТМБ.

У разі первинного виділення культури з діагностичного матеріалу з урогенітального тракту також слід видавати позитивну відповідь тільки після диференціальної діагностики. Це пояснюється не тільки тим, що подібний матеріал має найбільш високу ймовірність забруднення мікобактеріями навколишнього середовища, але й тим, що сапрофітні мікобактерії можуть бути нормальною мікрофлорою людини.

Ідентифікація M. tuberculosis complex і нетуберкульозних мікобактерій заснована на їх культуральних властивостях і здатності росту на диференційно-діагностичних середовищах.

Бактеріологічна характеристика М. tuberculosis:

на середовищі Левенштейна-Єнсена вони утворюють сухі колонії з нерівними краями, кольору слонової кістки;

ріст можливий за температури +35-37 -°С;

ріст на щільних живильних середовищах можливий не раніше ніж через 3 тижні. Ріст субкультури може з’явитися через 10-14 днів;

відсутність росту на середовищі з 500 мкг/мл саліциловокислим натрієм або 500 мкг/мл паранітробензойної кислоти (ПНБК), а також із 1 000 мкг/мл тіоацетазону (тібону).

Реактиви:

середовище Левенштейна-Єнсена з 500 мкг/мл саліциловокислого натрію - 100 мл (до згортання);

натрій саліциловокислий - 50,0 мг.

4. Для приготування до наважки натрію саліциловокислого 50,0 мг потрібно додати 1,0 мл етилового спирту для дезінфекції, 2,0 мл стерильної дистильованої води та 97,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання). Ретельно розмішати. Середовище із вмістом 500 мкг/мл саліциловокислого натрію розлити в пробірки по 5,0 мл і згортувати за температури +85 -°C протягом 30 хв.

Реактиви:

середовище Левенштейна-Єнсена з 500 мкг/мл ПНБК - 100 мл (до згортання);

ПНБК - 50,0 мг;

4,0 % розчин NaOH;

10,0 % розчин HCl.

Для приготування наважку ПНБК (50,0 мг) потрібно ретельно розтерти в стерильній ступці, додати 1,0 мл етилового спирту, 4,0 мл дистильованої стерильної води і 20-24 краплі 4,0 % розчину NaOH до отримання рН 8,0 (за індикаторним папірцем). За допомогою 10,0 % розчину HCl довести рН до 7,0 (додати 1-2 краплі). Приготований розчин додати до 95,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена, ретельно розмішати. Середовище з 500 мкг/мл ПНБК розлити в пробірки по 5,0 мл, згортати за температури +85 -°C протягом 30 хв.

M. tuberculosis та M. bovis чутливі до тіоацетазону (тіосемікарбазону пара-ацетамінобензальдегіду), тоді як інші мікобактерії, за винятком M. kansasii, до нього стійкі.

Реактиви:

тіоацетазон (тібон) - 10,0 мг;

Етиловий спирт 96°.

Готують розчин тіоацетазону з 1 000 мкг/мл препарату. Для цього до наважки 10,0 мг тібону, висипаної у пробірку, додають 1,0 мл етилового спирту і 9,0 мл стерильної дистильованої води. Отримують розведення 1 000 мкг/мл. 1,0 мл цього розведення додають до 99,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена, одержують концентрацію тібону 10,0 мкг/мл і розливають у пробірки по 5,0 мл. Середовище в пробірках згортають у скошеному вигляді за температури 85 -°C протягом 30 хв.

Для диференціації M. tuberculosis complex і нетуберкульозних мікобактерій 0,1 мл бактеріальної суспензії дослідної культури в стандартному розведенні 10-2 засіяти на середовище із саліциловокислим натрієм або на середовище з ПНБК. Визначення здатності росту мікобактерій на одному із цих діагностичних середовищ проводиться одночасно з визначенням їх стійкості до протитуберкульозних препаратів.

M. tuberculosis complex не ростуть на середовищах із саліциловокислим натрієм та ПНБК, а також із тіоацетазоном (тібоном). Ця властивість слугує для диференціації M. tuberculosis та M. bovis від нетуберкульозних мікобактерій.

У деяких випадках під час постановки тесту спостерігається почорніння, побуріння середовища із саліциловокислим натрієм без зміни кольору середовища в контролі. Здатність викликати деградацію саліциловокислого натрію є відмітною особливістю M. fortuitum і M. сhelonae.

Метод ґрунтується на здатності нетуберкульозних мікобактерій V групи рости на середовищі з 5,0 % NaCl. Крім цієї групи, на такому середовищі ростуть тільки М. terrae complex (містить М. triviale, М. terrae, М. nonchromogenicum і М. flavescens, а також деякі мікобактерії I групи (М. marinum). Усі інші мікобактерії, у тому числі М. tuberculosis і М. bovis, на цьому середовищі не ростуть.

Інгредієнти:

NaCl;

сольова основа середовища Левенштейна-Єнсена;

яєчна суміш середовища Левенштейна-Єнсена.

До сольової основи середовища Левенштейна-Єнсена додають NaCl із розрахунку 5,0 г на 100,0 мл сольової основи (5,0 %). Отриманий розчин стерилізують за температури +121 -°C 20 хв. Потім готують середовище, як зазначено в рецепті приготування середовища Левенштейна-Єнсена.

На всі зазначені вище середовища засівають по 0,2 мл зависі дослідної культури.

На підставі відсутності росту на діагностичних середовищах із саліциловокислим натрієм або ПНБК утворення сформованих непігментованих колоній протягом 3-4 тижнів за температури +37 -°C досліджену культуру можна віднести до M. tuberculosis complex.

Крім росту на цих середовищах, використовують здатність мікобактерій по-різному рости на рідких живильних середовищах. НТМБ ростуть дифузно у вигляді кучок, на відміну від істинних туберкульозних мікобактерій, що ростуть плівкою, або придонно, мають корд-фактор і ростуть у вигляді "кіс", "джгутів", "вусів" - у тісному переплетенні окремих паличок одна з одною. Це може слугувати диференціальною ознакою. Проте стійкі до препаратів групи ГІНК (препарати групи гідразиду ізонікотинової кислоти) M. tuberculosis цілком або частково втрачають корд-фактор. Тому для диференціації туберкульозних культур від НТМБ визначення корд-фактора потрібно використовувати в комплексі з іншими тестами.

Для того, щоб відрізнити М. tuberculosis від інших мікобактерій (М. bovis і НТМБ), використовують різноманітні біохімічні методи.

Видова ідентифікація M. tuberculosis complex має проводитися в усіх лабораторіях II і III рівнів. Найбільш актуальними представниками цього комплексу є М. tuberculosis, M. bovis і M. bovis-BCG, M. africanum, M. microti, M. caneti.

Їх видова ідентифікація заснована на фенотипічній характеристиці та біохімічних тестах, а саме:

тесту на наявність здатності продукувати нікотинову кислоту;

тесту на наявність нітратредуктазної активності;

тесту визначення здатності росту культури на середовищі з гідразид-тіофен-2-карбоксиловою кислотою (ТСН);

тесту визначення здатності до росту на середовищі з нікотинамідом;

тесту визначення чутливості до циклосерину;

тесту визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно;

тесту на наявність термостабільної каталази;

реакції гiдролiзу твiну-80.

Ніацин продукують усі мікобактерії, але у M. tuberculosis у результаті блокування ряду метаболічних шляхів нікотинова кислота накопичується у великій кількості. Тому цей тест є одним з основних, що дає можливість відрізнити M. tuberculosis від інших мікобактерій.

Принцип методу полягає у визначенні нікотинової кислоти хімічними методами в живильному середовищі, але не у власне мікобактеріях, за допомогою ціаністих сполук, з якими нікотинова кислота дає яскраво-жовте забарвлення. Цей тест одержав назву ніацинового. Класичний метод засновано на використанні ціаністих сполук.

Зазначений метод визначення ніацину потребує для роботи застосування ціаністого калію, робота з яким має проводитися під витяжною шафою і потребує певних умов, що обмежує широке застосування цього тесту. У зв’язку із цим, на особливу увагу заслуговує метод визначення ніацину паперовими смужками, запропонований Кубика і Кильбурн, у модифікації Бараускене.

Перевага цього методу - у використанні роданистого калію замість ціаністого калію - речовини нелеткої і більш доступної для бактеріологічних лабораторій, а також у швидкості реакції, яка дозволяє через 3-4 год дати відповідь про належність культури, що виросла на щільному середовищі, до M. tuberculosis або до інших мікобактерій.

Принцип методу полягає в екстракції ніацину з мікобактерій дистильованою водою і визначення його за допомогою паперових смужок, які заздалегідь обробляють відповідними реактивами.

Приготування реактивів:

20,0 % розчин пара-аміносаліцилової кислоти (ПАСК):

у пробірку наливають 1,75 мл 95,0 % спирту, 0,25 мл диметилсульфоксиду (димексиду) і додають 400,0 мг ПАСК. Суміш підігрівають на водяній бані за температури 56 -°C протягом 5-10 хв з періодичним струшуванням до повного розчинення ПАСК;

60,0 % розчин роданистого калію:

наважку 1,5 г роданистого калію розчиняють у пробірці з 2,5 мл 8,0 % розчину лимонної кислоти (200,0 мг лимонної кислоти і 2,5 мл дистильованої води);

50,0 % розчин хлораміну "Б":

3,125 г хлораміну "Б" розчиняють у 6,25 мл дистильованої води на водяній бані за температури 56-60 -°C зі струшуванням. Гарячий розчин капають на смужки.

Індикаторні смужки готують із фільтрувального паперу Filtrak 11. Один кінець смужки, розміром 60,0 x 8,0 мм, позначають простим олівцем. Пастерівськими піпетками на папір наносять по одній краплі свіжоприготованих реактивів у такому порядку: 20,0 % розчин ПАСК - на позначений олівцем кінець, 60,0 % розчин роданистого калію - посередині смужки і 50,0 % розчин хлораміну "Б" - на інший кінець. Між краплями мають залишатися сухі проміжки. Папірці висушують за кімнатної температури в темряві протягом 24 год, після чого зберігають їх у холодильнику в пробірках, що загвинчуються, або закритих гумовими корками. Індикаторні смужки залишаються активними протягом трьох місяців. Для одержання більш чіткої реакції рекомендують наносити повторно одну краплю хлораміну "Б" на вже висохлу краплю.

Для тесту використовують 3-4-тижневі життєздатні культури (не менше ніж 50 колоній) у середовищі Левенштейна-Єнсена.

Екстракт мікобактерій одержують шляхом додавання до пробірки з культурою 1,0-1,5 мл дистильованої води або ізотонічного розчину натрію хлориду і витримування пробірок у горизонтальному положенні, щоб усі колонії добре відмилися водою протягом 30 хв у термостаті. Якщо культура росте "газоном", поверхню середовища потрібно злегка проткнути піпеткою для того, щоб збільшити контакт дистильованої води чи ізотонічного розчину натрію хлориду із середовищем. Потім 0,6 мл екстракту мікобактерій відсмоктують мірною піпеткою до пробірки.

Індикаторну смужку поміщають кінцем, поміченим олівцем, до пробірки з 0,6 мл досліджуваного екстракту мікобактерій. Пробірку закривають пробкою та витримують за кімнатної температури, періодично струшуючи, поки вся смужка не просочиться екстрактом. У разі позитивного ніацинового тесту через 15-30 хв рідина забарвлюється в яскраво-жовтий колір. Дегазація пробірки після проведення реакції здійснюється шляхом додавання 10,0 % розчину нашатирного спирту.

Використання паперових смужок для визначення ніацину дає можливість застосовувати цей тест в усіх практичних лабораторіях.

Наразі існують комерційні набори готових паперових смужок, крапельних наборів для проведення ніацинового тесту, що значно його спрощує і стандартизує.

Потрібно пам’ятати, що ряд НТМБ - M. simiae, M. chelonae і деякі штами M. marinum також блокують ніацин. Хромогенні штами НТМБ можуть давати хибнопозитивні реакції.

Негативний результат не є остаточним, оскільки культури M. tuberculosis, виділені від хворих, які тривалий час одержують протитуберкульозні препарати, слабо продукують ніацин. У подібних випадках потрібно повторити тест, а культуру пересіяти, щоб одержати пишний ріст, і використати для тестування 3-4-тижневу культуру.

5. Для внутрішнього контролю якості (далі - ВКЯ) як позитивний контроль слід використовувати штам M. tuberculosis, а як негативний - M. bovis.

ВКЯ ніацинового тесту проводиться щоразу під час проведення тестування. Як позитивний контроль використовують ідентифікований або референс-штам (музейний) M. tuberculosis. Як негативний контроль використовують ідентифікований або референс-штам (музейний) НТМБ, наприклад, M. fortuitum, або дистильовану воду. Слід переконатися в чистоті дослідних штамів, строго дотримуватися правил зберігання і термінів використання розчинів, реагентів і паперових смужок.

6. Для ідентифікації М. tuberculosis користуються також реакцією відновлення нітратів у нітрити. Реакція відновлення нітратів дає можливість диференціювати М. tuberculosis, які мають нiтратредуктазу, від М. bovis, М. avium і від деяких НТМБ, у яких цей фермент відсутній. Виняток становлять фотохромогенні мікобактерії (М. kansasii) та деякі з III і IV груп.

Активність нiтратредуктази визначається за кількістю відновленого з нітрату нітриту, що дає кольорову реакцію з пара-диметиламінобензальдегідом.

Реактиви:

0, 067 М фосфатний буфер (рН-7,1), що містить 0,1 % нітрату натрію;

2,0 % розчин (вага/об’єм) пара-диметиламінобензальдегіду в 10,0 % НCl;

10,0 % розчин НCl.

Для реакції використовують 3-4-тижневі культури, вирощені на яєчному середовищі.

Хід дослідження: 2 петлі біомаси 3-4-тижневої культури суспендують у 5,0 мл (можна суспендувати 10,0 мг культури в 1,0 мл) 0,067 М фосфатного буферу (рН-7,1), що містить 0,1 % нітрату натрію, й інкубують за температури 37 -°C 15-16 год. Утворення нітриту перевіряється додаванням 2 крапель 2,0 % розчину пара-диметиламінобензальдегіду до 10,0 % НCl + 1,0 мл 10,0 % НCl. Поява жовтого забарвлення свідчить про належність культури до М. tuberculosis (метод Тсукамура).

Крім активності зазначених ферментів, для відрізнення М. tuberculosis від інших кислотостійких мікобактерій можна використовувати різну активність окисно-відновних ферментів.

M. tuberculosis резистентні до ТСН і дають хороший ріст на середовищі з гідразид- тіофен-2-карбоксиловою кислотою. M. bovis і M. bovis-BCG чутливі до ТСН і не ростуть на середовищі, що містить цю сполуку.

Реактиви:

середовище Левенштейна-Єнсена - 600 мл (до згортання);

гідразид-тіофен-2-карбоксилової кислоти.

Приготувати наважку ТСН 20,0 мг, розчинити у 20,0 мл стерильної дистильованої води. Одержали розведення 1 000 мкг/мл (розчин А). До 12,0 мл стерильної дистильованої води додати 3,0 мл розчину А. Отримали розведення 200 мкг/мл (розчин Б).

Приготування середовища Левенштейна-Єнсена з ТСН:

1) розведення - 199 мл середовища + 1,0 мл розчину Б - розведення 1,0 мкг/мл;

2) розведення - 195 мл середовища + 5,0 мл розчину Б - розведення 5,0 мкг/мл;

3) контрольна пробірка із середовищем без реактиву.

Досліджуване і контрольне середовище розлити в пробірки по 5,0 мл, згортати за температури 85 -°C протягом 30 хв.

По 0,2 мл культури в стандартному розведенні засівається на поверхню середовища. Інкубація за температури 37 -°C. Перегляд росту культур через 3-4 тижні. Визначення чутливості мікобактерій до ТСН проводиться одночасно з визначенням їх стійкості до медикаментозних препаратів.

Метод використовується для диференціації мікобактерій туберкульозного комплексу. М. tuberculosis стійкі до всіх концентрацій ТСН, M. bovis чутливі до ТСН у концентрації 1,0 і 5,0 мкг/мл (слід пам’ятати, що M. bovis іноді дають слабкий ріст на середовищі з концентрацією 1,0 мкг/мл, але ніколи не ростуть на середовищі з 5,0 мкг/мл). M. bovis-BCG чутливі до всіх досліджуваних концентрацій.

7. M. tuberculosis чутливі до нікотинаміду. M. bovis і вакцинний штам M. bovis-BCG мають природну резистентність до нікотинаміду. На цій властивості заснована диференціація M. tuberculosis complex.

Реактиви:

середовище Левенштейна-Єнсена (до згортання);

нікотинамід.

Для приготування основного розчину нікотинаміду потрібно наважку нікотинаміду 1 000 мг розчинити в 10,0 мл стерильної дистильованої води, стерилізувати через бактерійний фільтр або кип’ятінням на водяній бані за температури 100 -°C протягом 30 хв.

Розчин А: до 4,0 мл дистильованої води додати 1,0 мл основного розчину. Розведення - 20,0 мг/мл.

Розчин Б: до 3,0 мл дистильованої води додати 2,0 мл основного розчину. Розведення - 40,0 мг/мл.

Приготування середовища з нікотинамідом:

до 95,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена додати 5,0 мл робочого розчину А; кінцева концентрація - 1,0 мг/мл;

до 95,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена додати 5,0 мл робочого розчину Б; кінцева концентрація - 2,0 мг/мл;

одночасно приготувати 100 мл контрольного середовища Левенштейна-Єнсена.

Досліджуване і контрольне середовища розлити в пробірки по 5,0 мл, згортати за температури +85 -°C протягом 30 хв.

По 0,2 мл досліджуваної культури в стандартному розведенні засівається на приготовані середовища; інкубація - за температури +37 -°C протягом трьох тижнів.

У всіх штамів M. bovis-BCG спостерігається стійкість до 30,0-50,0 мкг/мл циклосерину. Ця біологічна особливість вакцинного штаму BCG є важливим діагностичним тестом у його ідентифікації.

Реактиви:

середовище Левенштейна-Єнсена (200 мл до згортання);

циклосерин.

Наважку циклосерину 20,0 мг потрібно розчинити в 5,0 мл дистильованої води, розведення - 4 000 мкг/мл.

До 99,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена додати 1,0 мл приготованого розчину. Кінцева концентрація препарату - 40,0 мкг/мл.

Одночасно приготувати 100 мл контрольного середовища.

Досліджуване і контрольне середовища розлити в пробірки по 5,0 мл, згортати за температури +85 -°C протягом 45 хв.

По 0,2 мл досліджуваної культури в стандартному розведенні засівається на приготовані середовища; інкубація - за температури 37 -°C протягом трьох тижнів.

8. M. tuberculosis і M. bovis чутливі до циклосерину, а вакцинний штам BCG росте на середовищі із циклосерином.

В окисно-відновних процесах мікробної клітини активну участь беруть такі ферменти, як каталаза і пероксидаза. У М. tuberculosis і М. bovis, чутливих до препаратів групи ГІНК, спостерігається активність обох ферментів паралельно. При цьому в чутливих культур спостерігається швидке активне виділення пухирців кисню, обумовлене діяльністю каталази, і забарвлення колоній у темно-коричневий колір, обумовлене діяльністю пероксидази. Поява коричневого пігменту пояснюється переходом пірогалолу в пурпурогалін за наявності перекису водню під впливом пероксидази. У культур М. tuberculosis, стійких до препаратів групи ГІНК, активність цих ферментів різко знижена, під час визначення каталазної активності пухирці кисню виділяються в невеликій кількості, повільно або майже відсутні, а в разі визначення активності пероксидази колонії або ледь забарвлюються, або (за високого ступеня стійкості до ізоніазиду) залишаються безбарвними. На відміну від М. tuberculosis, у НТМБ, незалежно від стійкості до ГІНК, каталазна активність завжди різко позитивна, пероксидазної зазвичай не спостерігається.

9. Принцип каталазної реакції полягає в розщеплені перекису водню ферментом каталази на воду й атомарний кисень, що супроводжується виділенням пухирців кисню та переходом пірогалолу в пурпурогалін за наявності перекису водню під впливом пероксидази.

Реактиви:

0,5 % пірогалол: 50,0 мг чистого пірогалолу розчинити в 10,0 мл дистильованої води;

2,0 % пергідроль: 0,2 мл пергідролю розвести в 10,0 мл дистильованої води.

Обидва розчини готують безпосередньо перед дослідом, змішуючи й наливаючи отриману суміш у пробірку так, щоб покрити культуру.

Обидва розчини зливають у колбу в рівній кількості і наливають по 6,0-8,0 мл суміші у пробірку з культурою. Залежно від кількості культур, що перевіряють, об’єм розчинів, які готують, відповідно збільшують.

Облік реакції активності каталази проводять через 5 хв після активного виділення пухирців кисню. Реакцію на пероксидазу враховують через 1,5-2 год після забарвлення колоній у темно-коричневий колір.

Ступінь активності каталази оцінюють за трибальною системою:

(3+) - рясне виділення пухирців кисню в першу хвилину;

(2+) - помірне виділення пухирців кисню;

(1+) - поодинокі пухирці.

За відсутності пухирців реакція вважається негативною (–).

Активність пероксидази також оцінюється за трибальною системою:

(3+) - темно-коричневе забарвлення колоній;

(2+ ) - коричневе забарвлення колоній;

(1+) - блідо-коричневе забарвлення колоній.

У разі негативної реакції колір колоній не змінюється.

Цінною реакцією для відрізнення М. tuberculosis від нетуберкульозних мікобактерій є проба на термостабільність каталази.

Каталаза у кислотостійких мікобактерій різна. У вірулентних мікобактерій вона швидко й легко руйнується під час нагрівання до температури 65-68 -°C. У НТМБ і кислотостійких сапрофітів вона термостабільна.

Готують 3,0 мл густої зависі мікобактерій. 1,5 мл зависі переносять до центрифужної пробірки, яку нагрівають на водяній бані за температури +68 -°C протягом 10 хв. Потім пробірку охолоджують і наносять на предметне скло по 1 краплі зависі: на один кінець - непрогріту (слугує контролем), а на другу - завись після нагрівання. До цих двох зависів додають по 1 краплі пергідролю. Утворення пухирців свідчить про активність ферменту, а відсутність - про пригнічення.

На підставі цієї реакції легко відрізнити М. tuberculosis, у яких каталаза завжди термолабільна, від більшості НТМБ і кислотостійких сапрофітів із різко термостабільною каталазою.

Термостабiльнiсть каталази, так само як і її активність, оцінюють за трибальною системою.

10. Важливою реакцією для ідентифікації мікобактерій всередині і груп (за Раньоном) є реакція гiдролiзу твiну-80. Твiн-80 зв’язує нейтральний червоний, а суміш до реакції має солом’яно-жовтий колір.

Принцип реакції - в ензимному гідролізі твiну-80. Під час цьому відбувається звільнення нейтрального червоного і забарвлення відновлюється від рожевого до червоного.

Позитивна реакція спостерігається у М. aquae (на відміну від М. scrofulaceum, у яких реакція негативна), а з групи вона позитивна тільки у М. terrae.

Реактиви:

1 : 15 М фосфатний буфер (рН-7) - 100,0 мл;

твiн-80 - 0,5 мл;

0,1 % основний нейтральний червоний - 2,0 мл.

Краще розчинити 0,1 г нейтраль-рот не в 100,0, а у 85,0 мл дистильованої води.

Змішати усі три реагенти. Розлити по 4,0 мл у пробірки й автоклавувати за температури +120 -°C 15 хв. Протягом доби перевіряють на стерильність у термостаті і зберігають у холодильнику. Стабільність розчину - не більше двох тижнів.

Емульгують три бактеріологічні лопатки культури в пробірках із підготованим субстратом (твiн-80 із нейтральним червоним). Пробірки поміщають у термостат. Реакцію перевіряють через 4 год на п’яту й десяту добу. Тест вважають позитивним, якщо рожево-червоне забарвлення з’явилося до десятої доби, а негативним - якщо забарвлення не з’явилося (модифікована методика Вайна). Контролем є пробірка із середовищем без реактивів.

Усі перелічені тести не повинні використовуватися в лабораторії одночасно. З іншого боку, не можна зупиняти свій вибір на застосуванні тільки одного з диференціально-діагностичних тестів, оскільки жоден тест не має 100 % чутливості й специфічності. Тільки поєднання кількох тестів дає можливість провести чітку ідентифікацію мікобактерій.

У практичних лабораторіях для ідентифікації M. tuberculosis широке застосування одержали визначення здатності росту мікобактерій на середовищі з ТСН і визначення активності нітратредуктази. Можна також використовувати в комплексі визначення активності нітратредуктази й ніацинового тесту.

У випадках, коли ідентифікації не відбулося (один з тестів позитивний, а інший - негативний), слід пересіяти культуру, дочекатися отримання пишного росту й поставити обидва тести знову. Для отримання правильного результату ідентифікації можна додати ще один (третій із перелічених) тест.

Зважаючи на появу випадків БЦЖ-ускладнень у дітей, потрібно проводити диференційну діагностику між M. tuberculosis і M. bovis-BCG. Із цією метою рекомендують використовувати три тести: на визначення нітратредуктази, ніацину і на здатність до росту на середовищі з нікотинамідом або циклосерином. Культури M. bovis-BCG не мають ніацину, не відновлюють нітратів і дають ріст на середовищі із вищезазначеними реактивами.

Культури, що не піддаються ідентифікації в умовах лабораторії протитуберкульозного диспансеру, рекомендують направляти до Центральої референс-лабораторії для проведення поглибленої ідентифікації.

Біохімічні властивості є основою визначення виду культур, виділених із патологічного матеріалу.

Остаточну біохімічну ідентифікацію із застосуванням складних біохімічних досліджень проводять у лабораторіях III рівня.

11. Під час диференціації мікобактерій, крім використання комплексу тестів, застосованих під час вивчення НТМБ культур, потрібно користуватися обов’язковими ключови тестами для диференціації окремих видів мікобактерій (додаток 4), проведення яких полегшує ідентифікацію культур.

Для клініки особливе значення мають такі види НТМБ: M. kansasii, M. marinum, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. avium, M. intracellularae, M. fortuitum.

Для НТМБ, крім зазначених особливостей (швидкості росту, пігментоутворення, морфології колоній і паличок, температурного оптимуму), характерними є негативна ніацинова проба, відсутність пероксидазної активності в разі високої активності каталази, виражена термостабільність каталази у більшості мікобактерій, ріст на живильних середовищах із ПНБК і саліциловокислим натрієм, відсутність у більшості випадків корд-фактора. Характерною для НТМБ також є первинна стійкість до більшості ПТП. Для диференціації M. tuberculosis і M. bovis від НТМБ, відмінності їх один від одного, а також для розрізнення НТМБ всередині груп є основні тести для відрізнення M. tuberculosis, M. bovis від інших мікобактерій (додаток 5).

З усіх наведених методик дослідження жодна сама собою не може відповісти на запитання про належність штаму до одного із видів. Тільки їх комплексне застосування дає можливість правильно ідентифікувати виділені культури. Під час ідентифікації бактеріологи повинні дати відповідь на питання, чи є виділені мікроорганізми мікобактеріями, а якщо так,- до якого виду вони належать.

12. Для забезпечення якості досліджень потрібно регулярно контролювати якість і придатність реактивів та обладнання, правильність реєстрації результатів.

Під час проведення процедур ВКЯ досліджень водночас із діагностичними пробами потрібно тестувати контрольні культури M. tuberculosis H37Rv, M. bovis і M. fortuitum або M. gordonae. У зв’язку із цим потрібно вести музей таких культур.

Слід звернути увагу на те, що M. fortuitum, так само, як і M. tuberculosis, дає позитивну нітратредуктазну реакцію.

13. Біохімічні, імунологічні й молекулярно-біологічні дослідження M. tuberculosis привели до виявлення декількох антигенів, які виявилися корисними для розробки досконаліших методів і комерційних тестів ідентифікації M. tuberculosis.

M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti), як відомо, продукують, тобто виділяють в живильне середовище, більше ніж 30 різних білків, де один із переважаючих - MPT64 (MPB64). Було встановлено, що НТМБ не продукують цього білка, тому виявлення MPT64 (MPB64) у пробі свідчить про належність дослідного штаму до комплексу M. tuberculosis.

Імунохроматографію можна віднести до групи реакцій із міченими антитілами. У реакції використовують моноклональні антитіла до шуканого антигена, адсорбовані на мікрочастках (забарвлений латекс або частки колоїдного золота), і моноклональні антитіла до того самого антигена, імобілізовані у вигляді смуги на хроматографічному папері. Крім того, у цій реакції є внутрішній контроль (антивидові антитіла, також закріплені у вигляді смуги на хроматографічному папері).

Тест-системи, що базуються на цьому принципі, мають високу специфічність. Такий метод може бути використано для швидкої ідентифікації комплексу M. tuberculosis, отриманих із рідких і твердих живильних середовищ.

Підготовлений дослідний матеріал (суспензія мікобактерій або позитивна рідка культура) у невеликій кількості (100 мкл) вноситься в стартове вікно тест-системи. Тут відбувається взаємодія антигена з антитілами, адсорбованими на частках, і починається рух комплексів, що утворилися, за рахунок капілярності паперу. Дійшовши до антитіл, розміщених на папері у вікні обліку результату, ці комплекси зв’язуються. При цьому частки латексу або колоїдного золота проявляються у вигляді лінії блакитного (латекс) або коричневого кольору.

Наявність смуги у вікні обліку результату свідчить про належність дослідного штаму до комплексу M. tuberculosis, а відсутність - про належність дослідного штаму мікобактерій до НТМБ. Оскільки частки, навантажені антитілами, беруться в надлишку, частина їх рухається далі і зв’язується у вікні внутрішнього контролю реакції. Смуга в цьому вікні свідчить про правильну роботу тест-системи. У разі відсутності смуги внутрішнього контролю реакції результатів інтерпретувати не можна. Інтерпретація результатів тесту проводиться через 15 хв після внесення суспензії мікобактерій у стартове вікно. Виконувати дослідження слід відповідно до інструкції виробника.

Відразу ж після отримання нової партії тестів має бути проведене тестування свідомо позитивних і негативних проб для того, щоб перевірити, чи не сталося пошкодження тестів у ході транспортування.

Внутрішній контроль якості досліджень проводиться щоразу під час проведення тестування.

Як позитивний контроль може бути використано:

музейний штам H37Rv або клінічний ізолят M. tuberculosis;

суспензію 1,0 мкл (еквівалент 1 петлі діаметром 1,0 мм) колоній M. bovis BCG в 0,2 мл 10 ммоль/л фосфатно-сольового буфера, що містить 0,1 % твіну-80;

рідку культуру M. bovis BCG (McFarland 1 (3-6 x 10-7 КУО/мл), вирощену в рідкому середовищі.

Слід мати на увазі, що деякі штами M. bovis BCG (Glaxo, пастерівський, тайський) не експресують MPT64 або MPB64. Тому тільки бразильський, японський (Токіо), російський, шведський штами M. bovis BCG можна використовувати як позитивний контроль.

Як негативний контроль може бути використано:

незасіяне рідке середовище;

10,0 ммоль/л фосфатно-сольового буфера, що містить 0,1 % твіну-80;

будь-яку НТМБ, наприклад, М. smegmatis або М. gordonae.

14. Диференціацію M. tuberculosis complex (M. tuberculosis M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti) й ідентифікацію НТМБ рекомендують проводити з використанням молекулярно-генетичних методів дослідження.

Використання молекулярно-генетичних методів для ідентифікації мікобактерій базується на гібридизації ДНК дослідного штаму зі специфічними для виду мікобактерій ДНК-зондами. Застосування молекулярно-генетичних методів дозволяє проводити ідентифікацію мікобактерій упродовж декількох робочих днів.

14. Найбільш ефективними визнано молекулярно-генетичні методи, що базуються на гібридизації з ДНК-зондами (Line Probe Assay, LPA), зокрема GenoType Mycobacterium CM/AS, GenoType MTBC, INNO-LiPA Mycobactera. Технологія проведення досліджень із використанням цих методів включає такі етапи:

виділення ДНК з культур мікобактерій;

ПЛР для ампліфікації фрагментів генів мікобактерій;

гібридизацію ПЛР-продуктів із ДНК-зондами, які іммобілізовані на смужці;

візуалізацію результатів гібридизації (при цьому визначається належність мікобактерій до певного виду).

Тест GenoType Mycobacterium CM (Common Mycobacteria) ґрунтується на технології DNA-STRIP, що дає змогу ідентифікувати такі види мікобактерій: M. avium ssp., M. chelone, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. ulcerans, комплекс M. tuberculosis та M. xenopi.

Процедура проведення тесту складається з таких етапів:

виділення ДНК із культур, що виросли на щільному або рідкому поживному середовищі;

мультиплексна ампліфікація з біотинильованими праймерами;

реверс-гібридизація.

Гібридизація охоплює такі етапи:

хімічна денатурація продуктів ампліфікації;

гібридизація одноланцюгових ампліконів, які помічені біотином, на мембранозв’язаних зондах;

ретельне промивання;

додавання кон’югату стрептавідину / лужної фосфатази (реакція забарвлення).

Вихідним матеріалом для тесту виділення ДНК можуть бути бактерії, які виросли на щільному живильному середовищі (наприклад, Левенштейна-Єнсена) або на рідкому середовищі (наприклад, у системі BACTEC).

Тест не підходить для детекції мікобактерій із прямого матеріалу пацієнтів.

Методика виконання:

під час роботи з бактеріями, які виросли на щільному середовищі, потрібно зняти колонії аплікатором і перенести їх до 300 мкл деіонізованої води до пробірки з кришкою, що загвинчується;

під час роботи з бактеріями, які виросли в рідкому середовищі, потрібно відібрати 1 мл, центрифугувати протягом 15 хв за 10 000 g у центрифузі з аерозоль-непроникним ротором. Супернатант злити, а осад із бактеріями ресуспендувати на вортексі в 300 мкл деіонізованої води в пробірці з кришкою, що загвинчується;

інкубувати пробірки з бактеріями на водяній бані 20 хв за температури +95 -°С;

обробляти пробу в ультразвуковій бані протягом 15 хв;

центрифугувати пробу на максимальній швидкості 5 хв, а для ПЛР використовувати 5,0 мкл супернатанту. Якщо передбачається більш тривале зберігання, розчин ДНК потрібно перенести до нової пробірки.

Можна використовувати інші методи виділення ДНК, які дають змогу отримати з бактерій ДНК для ампліфікації.

Готувати ампліфікаційну суміш (по 45,0 мкл) потрібно в чистій від ДНК кімнаті. Зразки ДНК треба вносити до пробірки із сумішшю також в окремому приміщенні.

Мікс на одну пробірку:

35,0 мкл PNM;

5,0 мкл 10-кратного полімеразного буфера для інкубації;

х мкл розчину MgCl2;

1-2 одиниці термостабільної ДНК-полімерази;

у мкл води для доведення об’єму до 45,0 мкл;

для отримання кінцевого об’єму 50,0 мкл додати 5,0 мкл розчину ДНК (20,0-100 нг ДНК).

Залежно від системи фермент/буфер, що використовується, оптимальна концентрація MgCl2 може коливатися між 1,5 та 2,5 мМ (деякі інкубаційні буфери вже містять MgCl2).

Під час використання HotStar ДНК-полімерази від Qiagen для одного зразка потрібно взяти такі реагенти:

35,0 мкл PNM;

5,0 мкл 10-кратного ПЛР буфера для HotStar Tag (містить 15 мМ MgCl2);

2,0 мкл 25 мМ розчину MgCl2;

0,2 мкл (1,0 од) HotStar Tag;

3,0 мкл води (для молекулярно-біологічних досліджень);

5,0 мкл розчину ДНК.

Кінцева концентрація MgCl2 у цій ампліфікаційній суміші становить 2,5 мМ.

Визначають кількість зразків для ампліфікації (кількість дослідних проб + контрольні зразки). Проба контролю контамінації (негативний контроль) містить 5,0 мкл води замість розчину ДНК. Підготовляють мастер-мікс, що містить усі реагенти, за винятком розчину ДНК, і добре перемішують (не на вортексі!).

Аліквотують по 45 мкл до кожної підготовленої ПЛР-пробірки.

Програма ампліфікації:

15 хв 95 -°C 1 цикл

30 с 95 -°C ) 10 циклів

2 хв 58 -°C )

25 с 95 -°C )

40 с 53 -°C ) 20 циклів

40 с 70 -°C )

8 хв 70 -°C 1 цикл

Продукти ампліфікації можуть зберігатися за температури від +8 -°C до +20 -°C.

Процедура виконання гібридизації: