З метою виконання заходів національної програми боротьби із захворюванням на туберкульоз на 2002 - 2005 роки, затвердженої указом Президента України від 20 серпня 2001 року N 643/2001, щодо поліпшення мікробіологічної діагностіки туберкульозу в Україні

1. Затвердити Інструкцію з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції (додається).

2. Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Севастопольської міської державних адміністрацій та головного управління Київської міської державної адміністрації довести зазначену Інструкцію до керівників закладів охорони здоров'я і забезпечити її дотримання.

3. Головному фтизіатру МОЗ України (Фещенко Ю.І.) та директору Референс-Центру з мікробіологічної діагностики туберкульозу МОЗ України (Журило О.О.) надати пропозиції щодо проведення семінару з мікробіологічної діагностики туберкульозу для головних спеціалістів управлінь охорони здоров'я з питань лабораторної діагностики та завідуючих лабораторій протитуберкульозних закладів.

4. Наказ МОЗ СРСР від 8 червня 1978 року N 558 "Об унификации микробиологических методов исследования при туберкульозе" вважати таким, що не застосовується на території України.

5. Контроль за виконанням цього наказу покласти на першого заступника Державного секретаря Бобильову О.О.

* Складена під керівництвом Головного фтизіатра і пульмонолога України, академіка АМН України, професора Ю.І.Фещенка співробітниками Інституту фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г.Яновського АМН України д.м.н. О.А.Журило, к.м.н. М.Т.Клименко, к.м.н. А.І.Барбовою, м.н.с. П.С.Трофімовою за участю д.б.н. В.В.Власенка.

В умовах широкого застосування різноманітних антимікобактеріальних препаратів змінилася біологія збудника туберкульозу. Зміни стосуються як морфології мікобактерій, так і їхньої ферментативної активності і біологічних властивостей. У зв'язку з цим значно ускладнилася мікробіологічна діагностика туберкульозу. З'явилися також деякі додаткові труднощі, пов'язані з виділенням у ряді випадків із патологічного матеріалу хворих атипових мікобактерій, діагностика яких можлива тільки з застосуванням комплексного дослідження, що включає мікробіологічні, біохімічні і біологічні методи. Таке комплексне різнобічне дослідження можливе у добре оснащених бактеріологічних лабораторіях із висококваліфікованим персоналом. За останні роки в ряді областей України створені лабораторії, що виконують усі види мікробіологічних досліджень.

Функцію Центральної референс-лабораторії України з діагностики туберкульозу виконує Референс-Центр МОЗ України, розташований на базі Інституту фтизіатрії і пульмонології ім.Ф.Г.Яновського, що співпрацює з ВООЗ з питань діагностики туберкульозу. Референс-Центр виконує весь спектр мікробіологічних досліджень з діагностики туберкульозу, розроблює, апробує й впроваджує нові методи та методики діагностики туберкульозу, здійснює спостереження за етиологічною структурою туберкульозної інфекції, циркуляцією збудників туберкульозу серед населення з метою зниження захворюваності на туберкульоз шляхом профілактичних і протиепідемічних заходів. Референс-Центр є організаційно-методичним центром, що здійснює контроль за якістю всіх досліджень, які проводяться в регіональних лабораторіях протитуберкульозних закладів країни і надає їм методичну допомогу.

Лабораторії обласних протитуберкульозних диспансерів є лабораторіями III рівня і проводять усі види бактеріологічних досліджень, що включають: 1) бактеріоскопію, 2) посів патологічного матеріалу на яєчні середовища, 3) типування виділених мікобактерій і їх таксономічну ідентифікацію, 4) визначення чутливості культур M.tuberculosis (МБТ) до антимікобактеріальних препаратів, 5) біологічну пробу: зараження лабораторних тварин з метою виявлення мікобактерій туберкульозу (при наявності віварію).

Спектр мікробіологічних досліджень, які виконуються з діагностики туберкульозу в міських та районних протитуберкульозних закладах, визначається рівнем технічного оснащення бактеріологічних лабораторій в даних закладах.

Інші лабораторії проводять бактеріоскопію досліджуваного матеріалу, посів його для виділення чистої культури M.tuberculosis (лабораторії II рівня). Периферійні лабораторії, які виконують лише бактеріоскопію харкотиння є лабораторіями I рівня (пункти мікроскопії).

Погіршення епідеміологічної ситуації в країні потребує систематичного перегляду форм і методів профілактики і виявлення туберкульозу серед населення з метою зниження інфікованості, захворюваності та зменшення резервуару туберкульозної інфекції. У більшості виявлених хворих при зверненні туберкульоз діагностується несвоєчасно. Виявлення хворих з занедбаними формами туберкульозу знижує ефективність лікування навіть при застосуванні сучасних методів хіміотерапії. Хворі-бактеріовиділювачі, які тривалий час невідомі протитуберкульозним диспансерам з причин пізньої діагностики, становлять велику епідеміологічну небезпеку для оточуючих, особливо дітей.

Під час епідемії туберкульозу в країні одним із пріоритетних напрямків в системі протитуберкульозних заходів є підвищення рівня знань лікарів з питань клініки та своєчасної діагностики перш за все заразних форм туберкульозу у хворих, які звертаються за медичною допомогою.

Стратегічним пріоритетом в системі виявлення туберкульозу за звертанням повинно бути встановлення етиологічного діагнозу на основі клінічного обстеження, рентгенологічної діагностики органів грудної клітки та мікроскопії мазка харкотиння на мікобактерії туберкульозу.

Мікроскопічному дослідженню мазка харкотиння підлягають хворі:

- з наявністю кашлю з харкотинням, або без нього, більше 3-х тижнів;

- з кровохарканням або легеневою кровотечею;

- з симптомами запалення бронхо-легеневої системи;

- з болями в грудній клітці, які пов'язані з диханням або кашлем;

- з рентгенологічними змінами в легенях з підозрою на туберкульоз;

- особи, що контактують з хворими-бактеріовиділювачами, які мають симптоми інтоксикаційного, або бронхо-плевро-легеневого синдромів.

1.1 Харкотиння

Дослідження харкотиння методом мікроскопії мазка необхідно здійснювати у всіх бактеріологічних лабораторіях протитуберкульозних закладів і клініко-діагностичних лабораторіях загальнолікувальної мережі. Хворих, у яких виявлені кислотостійкі мікобактерії, слід направляти в протитуберкульозний диспансер за місцем проживання для подальшого обстеження, підтвердження етиологічного діагнозу туберкульозу, лікування та диспансеризації.

Для одержання коректного результату важливо правильно організувати збирання харкотиння, яке слід проводити без сторонніх людей на відкритому повітрі на території закладу, де аерозолі, які містять МБТ, розсіюються, а збудники туберкульозу гинуть під впливом прямого сонячного світла, або на веранді, або в добре провітрюваній кімнаті, яка повинна кварцуватися і добре оброблятися дезинфектантами. Медичний працівник повинен детально пояснити пацієнту, як слід відкашляти харкотиння з глибоких нижніх дихальних шляхів. З цією метою слід попросити хворого зробити декілька глибоких вдихів і тільки потім похаркати в посуд з послідуючою перевіркою наявності в посуді харкотиння. Якщо харкотиння немає, або хворий не може його відхаркати, матеріал для дослідження треба одержати за допомогою подразнюючих інгаляцій.

Для запобігання зараження туберкульозом при збиранні харкотиння медичний працівник зобов'язаний бути у шапочці, масці, клейончатому фартусі та гумових рукавичках та повинен стояти позаду пацієнта.

Для виявлення кислотостійких мікобактерій в амбулаторних умовах необхідно досліджувати як мінімум 3 мазки харкотиння методом мікроскопії за Цілем-Нільсеном. Першу пробу харкотиння беруть у хворого в день звертання за медичною допомогою в присутності медперсоналу, потім йому дають посуд для збирання ранкового харкотиння (збирає самостійно) і останню (третю) пробу збирають в присутності медперсоналу в день здачі другої проби.

В стаціонарних умовах доцільно проводити дослідження харкотиння 3 доби підряд в ранкові години вище приведеним методом. Харкотиння збирається в скляні ємкості з широким горлом з кришками, а потім передається в лабораторію для дослідження.

При зберіганні та доставці харкотиння в лабораторію на дослідження необхідно також додержуватись заходів по запобіганню зараження туберкульозом. Для зберігання та перевозки використовують спеціальні контейнери або металеві бікси.

Якщо перший мазок виявився позитивним, а хворий не прийшов повторно до лікаря, хворого слід терміново розшукати і сповістити в районний протитуберкульозний диспансер, а також в заклад санітарно-епідеміологічного нагляду, з тим щоб викликати його для подальшого обстеження, встановлення діагнозу і направлення на лікування.

У хворих, що виділяють невелику кількість харкотиння, його варто збирати протягом доби за умови, що воно буде зберігатися в холодному місці (краще в холодильнику), а потім разом із ранковою порцією буде доставлене в лабораторію.

Якщо у хворого харкотиння виділяється епізодично в невеликій кількості, то треба напередодні і ранком дати відхаркувальне або застосувати метод подразнюючої аерозольної інгаляції, що підсилює секрецію бронхів і кашель.

Якщо хоча б 2 зразки харкотиння з трьох показали позитивний результат при проведенні бактеріоскопії на присутність кислотостійких паличок (КСП), то пацієнт відноситься до хворих з позитивним мазком КСП+; він своєчасно повинен бути направлений в районний або міський тубдиспансер на госпіталізацію та лікування.

Якщо з трьох зразків харкотиння, які були досліджені, 1 позитивний на КСП (КСП+), то пацієнта направляють до фтизіатра на дообстеження й вирішення питання про призначення відповідного лікування.

Якщо всі 3 мазки дали негативний результат, але симптоми хвороби стійкі й на рентгенограмі є відповідні зміни, які характерні для туберкульозного процесу, то хворому ставлять діагноз туберкульозу легень з негативним мазком КСП- й прописується відповідний лікувальний режим.

Якщо в 3-х мазках харкотиння при бактеріоскопії КСП не виявлено, але є симптоми захворювання без відповідних змін на рентгенограмі, то хворий лікується по схемі лікування гострих пневмоній.

Якщо через 2 тижні захворювання на тлі неспецифічної антибактеріальної терапії не помітно позитивних клініко-рентгенологічних змін, то у хворого повторно збирають 3 проби харкотиння 3 доби підряд для дослідження мазків методом мікроскопії за Цілем-Нільсеном. При виявленні кислотостійких мікобактерій, хоч в одному з мазків харкотиння, хворий направляється в спеціалізований стаціонар для дообстеження та лікування.

В лабораторії позитивні мазки на КСП зберігаються 6 місяців й при необхідності можуть бути консультовані або передані для ідентифікації в протитуберкульозний диспансер.

Окрім мікроскопії мазка харкотиння, пофарбованого за Цілем-Нільсеном, можливе дослідження матеріалу методом люмінесцентної мікроскопії.

Подразнюючі інгаляції.

Якщо у хворого харкотиння виділяється у невеликій кількості, то напередодні і ранком йому дають відхаркувальні препарати чи застосовується подразнювальна аерозольна інгаляція портативним інгалятором. Як інгаляційна суміш рекомендується 15,0 % розчин хлориду натрію в 2,0 - 3,0 % розчині харчової соди. Склад гіпертонічного розчину та його приготування: беруть 1,0 літр дистильованої води, добавляють 150,0 г кухонної солі, 20,0-30,0 г харчової соди, стерилізують і зберігають до 30 діб. Для провокації харкотиння необхідно інгалювання від 30,0 мл до 60,0 мл суміші, підігрітої до (42 - 45) град. Цельсію, і вдихати її не менше 10 - 15 хвилин. У зв'язку з тим, що інгаляційний розчин викликає посилену салівацію ще до появи кашлю з харкотинням, хворий повинен видалити слину в приготовлений лаборантом посуд із хлораміном і тільки після цього зібрати харкотиння для мікробіологічного дослідження. Гіперсекреція бронхіального вмісту у більшості хворих спостерігається ще протягом доби після інгаляції гіпертонічного розчину, що повинно бути використане з метою виявлення мікобактерій. Через що хворому рекомендується зібрати харкотиння для повторного дослідження протягом доби після інгаляції.

Консервування харкотиння.

При неможливості доставки в мікробіологічну лабораторію харкотиння, зібраного для мікробіологічної діагностики туберкульозу, протягом 2 - 8 годин після збору, його необхідно консервувати одним з існуючих консервантів (10,0 % водний розчин трьохзаміщеного фосфорнокислого натрію, 5,0 - 10,0 % розчин гліцерину, 10,0 % розчин натрію хлориду, 2,0 - 3,0 % розчин борної кислоти) шляхом заливання зібраного харкотиння консервантом. Останній консервант найбільш зручний в умовах спекотного клімату.

Харкотиння, зібране в скляну плювальницю, заливають консервантом у співвідношенні 1:1, герметично закривають кришкою, встановлюють у дерев'яний ящик із гніздами і пересилають разом із направленням, в якому вказане прізвище хворого й адреса, у бактеріологічну лабораторію.

1.2 Промивні води бронхів

Правила відбору і доставки промивних вод бронхів.

При відсутності у хворих харкотиння досліджують промивні води бронхів. Промивні води бронхів є матеріалом, з якого значно частіше, ніж із промивних вод шлунка, висіваються мікобактерії туберкульозу при легеневих процесах. Проте, промивання бронхів проводиться лікарем-отоларингологом, тому ця процедура доступна тільки в тих лікувальних закладах, де є такий фахівець.

Промивні води бронхів збирають в стерильний посуд, що закривається, і відразу ж доставляють в мікробіологічну лабораторію (Диагностический бронхоальвеолярный лаваж: Методические рекомендации / А.Г.Хоменко, В.П.Филиппов, К.М.Лебедев и соавт. - М., 1986.- 20 с).

Діагностичний бронхоальвеолярний лаваж (БАЛ) - безпечний метод, що забезпечує прижиттєве дослідження не респіраторних функцій легень. Дослідження бронхоальвеолярного змиву (БАЗ) істотно підвищує ефективність мікробіологічної діагностики туберкульозу. Крім того, метод дозволяє встановити визначені тенденції в зміні життєздатності клітин легень, їх функціональної активності і порушення співвідношень між окремими елементами при різних патологічних процесах. Інформативність БАЗ може бути прирівняна до біопсійних маніпуляцій, і БАЛ необхідно вважати діагностичною процедурою.

Хворому декілька разів підчас вдиху вводять шприцем у трахею 5,0-7,0 мл стерильного ізотонічного розчину, що викликає кашльовий рефлекс. При цьому разом з ізотонічним розчином відкашлюється секрет із глибоких відділів бронхіального дерева.

У хворих із вираженим рвотним рефлексом вказану процедуру виконують після попередньої анестезії надгортанника, гортані і задньої стінки глотки.

Більш доцільно проводити бактеріологічне дослідження відділку бронхів, отриманого на наступний день або через день після проведення бронхоскопії, коли у хворого з'являється самостійний продуктивний кашель з глибинних відділів бронхіального дерева.

1.3 Промивні води шлунка

Іншим методом одержання діагностичного матеріалу від хворих, що не виділяють харкотиння, є промивання шлунка. Найбільш широко цей метод застосовується в клініці дитячого туберкульозу.

M.tuberculosis потрапляють у шлунок при заковтуванні невеликих кількостей харкотиння, яке не відхаркується хворими. Промивні води шлунка беруть натщесерце. Останній прийом їжі хворим повинен бути не менше, ніж за 12 годин до взяття промивних вод шлунка. Для одержання промивних вод шлунка хворому дають випити склянку (200,0 мл) дистильованої води, тому що у водопровідній воді можуть міститися кислотостійкі сапрофіти. Після цього вводять шлунковий зонд і збирають вміст шлунка в стерильну склянку. Матеріал доставляють у лабораторію негайно.

1.4 Сеча

Для дослідження сечі використовують ранкову порцію, отриману після ретельного туалету зовнішніх статевих органів. Отриману сечу центрифугують. Якщо в осаді сечі патологічних елементів нема (кислотостійких паличок), то для дослідження на туберкульоз використовують добову порцію сечі, повторюючи дослідження 2-3 доби підряд.

1.5 Пунктати з закритих порожнин

(спинномозкова рідина, ексудати і трансудати з плевральної і черевної порожнин)

Беруть стерильним шприцем у стерильний посуд і відразу доставляють у лабораторію. У стерильному посуді також негайно доставляють у бактеріологічну лабораторію тканину, отриману шляхом біопсії або під час операції.

1.6 Гній із свищів, виділення ран, менструальна кров і виділення з відкритих порожнин

Беруть стерильним шприцем або стерильним ватним тампоном у стерильний посуд і доставляють у лабораторію негайно.

2.1 Деякі біологічні особливості роду Mycobacterium

(21 group Berge'ss Manual Determinative Bacteriology, Ninth Edition)

Мікробіологічні дослідження є одним з найбільш важливих діагностичних тестів при захворюваннях органів дихання, що сприяють своєчасній діагностиці збудника інфекційного процесу, визначають особливості клінічної симптоматики, дозволяють орієнтувати лікаря на ймовірний діагноз і перебіг хвороби, диктують вибір препарату для проведення адекватної антибактеріальної хіміотерапії.

До складу роду Micobacterium сімейства Micobacteriaceae включені кислото- і спиртостійкі (ознака особливо виражена у патогенних видів) аеробні нерухомі грампозитивні прямі чи вигнуті паличкоподібні бактерії. Іноді вони утворюють нитковидні чи міцеліальні структури, які фрагментуються при легкому механічному впливі, на палички чи кокоподібні елементи. Для них характерним є високий вміст ліпідів і восків (до 60,0 %) у клітинних стінках, утворених пептидогликано-арабіногалактановим комплексом; деякі види утворюють каратиноїдні пігменти, що не дифундують. Каталазо - і арилсульфатазопозитивні, резистентні до дії лізоциму. Ростуть повільно, чи дуже повільно (сапрофітні види значно швидше). Мікобактерії широко поширені в навколишньому середовищі - воді, ґрунті, у рослин і тварин. Незважаючи на те, що в даний час ідентифіковано близько 50 видів, рід нараховує близько 200 видів; типовий вид - Mycobacterium tuberculosis. За ознакою патогенності виділяють власне патогенні, що спричиняють конкретні захворювання, і атипові мікобактерії, серед яких є умовно-патогенні і сапрофітні. Для систематики атипових мікобактерій запропоновані різні класифікації, засновані на генетичній спорідненості з M. tuberculosis чи спорідненості з сапрофітними видами; серед запропонованих варіантів найбільше поширення знайшла класифікація Раньона (1959), в основу якої покладені дві властивості - колір колоній і швидкість росту. Відповідно вона виділяє 4 групи атипових мікроорганізмів.

У лабораторній практиці основними методами індикації й ідентифікації різних мікобактерій є бактеріоскопічний метод дослідження (пряма мікроскопія, мікроскопія після збагачення, люмінесцентна мікроскопія, фазовоконтрастна мікроскопія), культуральний метод (швидкість росту, форми колоній і мікроколоній, здатність до утворення пігменту, ріст при різних температурах, здатність до росту на МПА, толерантність до NaCl і деякі біохімічні особливості, що представлені нижче) і біологічний метод. Мікроскопія і бактеріологічний метод проводяться одночасно.

M.tuberculosis - тонкі, прямі чи злегка вигнуті палички розмірами 1,0 - 10,0 х 0,2-0,6 мкм, зі злегка закругленими кінцями, у цитоплазмі містять зернисті утворення (2-10). Морфологія істотно варіює в залежності від віку культури й умов культивування - в молодих культурах палички довші, а в старих схильні до простого розгалуження. Іноді утворюють коковидні структури і L-форми, що зберігають патогенність, а також фільтрівні форми, патогенна роль яких залишається недостатньо вивченою.

Нерухомі, спор не утворюють, позбавлені капсул, але мають мікрокапсулу, яка відокремлена від клітинної стінки осмієфобною зоною.

Кислотостійкі, що обумовлено високим вмістом ліпідів і міколової кислоти в клітинній стінці, а також утворюють кислотолабільні гранули, які переважно складаються з метафосфату (зерна Муха), розташовуються вільно або в цитоплазмі паличок. Грампозитивні, анілінові фарби сприймають погано; за Цілем-Нільсеном забарвлюються в яскраво-червоний колір; за Мухом-Вайссом - у фіолетовий (йодофільність); гранули забарвлюються у відповідний колір.

Аероби, але здатні рости у факультативно анаеробних умовах; 5,0 - 10,0 % вмісту СО2 сприяє більш швидкому росту. Розмножуються повільно, в середньому 14-18 годин. Температурний оптимум 37 - 38 град. Цельсію; потреба в рН 7,0-7,2 (але можуть рости в межах 4,5-8,0). Для росту мають потребу в присутності білкового субстрату і гліцерину, а також вуглецю, хлору, сірки, фосфору, азоту, факторів росту (біотину, нікотинової кислоти, рибофлавіну й ін.), іонів (Mg++, K+, Na+, Fe++). Для вирощування найчастіше використовують щільні яєчні середовища (Льовенштайна-Єнсена, Фінна-2 й ін.). На рідких середовищах ріст спостерігають на 5-7 добу у вигляді сухої зморшкуватої плівки (R - форма), що підіймається на стінки пробірки; середовище залишається прозорим. У середовищах, що містять детергент (твін-80), дають рівномірний ріст по товщі середовища (особливо при періодичному струшуванні). На рідких середовищах і при внутрішньоклітинному розвитку добре виявляється характерний корд-фактор (тригалоза-6,6-димиколат), що обумовлює зближення бактеріальних клітин у мікроколоніях, їх ріст у вигляді серпантиноподібних утворень ("кіс") і має відношення до вірулентності збудника. На щільних середовищах відзначають ріст у вигляді сухого зморшкуватого нальоту кремового кольору; колонії з піднятим центром, що нагадують цвітну капусту, крихкуваті, погано змочуються водою. Колонії легко знімаються з середовища, а при прожарюванні тріскотять. Під впливом антибактеріальних препаратів можуть дисоціювати з утворенням м'яких вологих S - колоній або рости у вигляді гладких чи пігментованих колоній. Відмінна риса M.tuberculosis - здатність до синтезу значної кількості нікотинової кислоти (ніацину), це використовують для її диференціальної діагностики з іншими мікобактеріями (ніациновий тест); одна з умов - необхідність посіву на середовище Льовенштайна-Єнсена, що не містить малахітового зеленого (тому що барвник вступає в реакцію з реагентами, що використані). На середовищах з жовчю утворюють сіруватий маслянистий наліт, обумовлений подовженими паличками.

Проведення широкого комплексу мікробіологічних досліджень обумовлено зміною епідеміологічної ситуації, патоморфозом туберкульозу, зміною ряду властивостей збудника, що утруднюють мікробіологічну діагностику туберкульозу.

До числа їх належить:

- олігобацилярність хворих, що виражається як невеликим числом мікобактерій у діагностичному матеріалі, так і епізодичністю бактеріовиділення. У зв'язку з цим достовірна діагностика бактеріовиділення повинна грунтуватися на серії мікробіологічних досліджень;

- зміна культуральних властивостей мікобактерій, втрата ними здатності до росту на деяких штучних живильних середовищах. Тому посів діагностичного матеріалу необхідно проводити не менш, ніж на два різні живильні середовища, чи використовувати попереднє підрощення на рідких живильних середовищах;

- зміна тинкторіальних властивостей збудника, втрата мікобактеріями кислотостійкості і пов'язана з цим недостатня інформативність бактеріоскопічних методів дослідження при фарбуванні за Цілем-Нільсеном. Додаткове використання люмінесцентної мікроскопії і комплексність мікробіологічного дослідження дозволяють виключити цю проблему;

- збільшення ролі неспецифічної мікрофлори у виникненні супутніх захворювань і ускладнень при туберкульозі. У ряді випадків, особливо у хворих з неясною етиологією захворювання, мікробіологічна ідентифікація збудника повинна проводиться за життєвими показаннями, інтервал між одержанням матеріалу від хворого і посівом його на відповідні живильні середовища має бути максимально коротким і не перевищувати 2 години.

З метою встановлення бактеріовиділення чи його відсутності кожен хворий повинен бути комплексно обстежений: дослідження харкотиння (промивних вод бронхів, трахеї, шлунку чи ін.) не менше трьох разів методом бактеріоскопії, трьохразовий посів перед початком лікування у вперше виявленого хворого, або при загостреннях і рецидивах процесу.

В період лікування зазначені дослідження (бактеріоскопія мазка і посів досліджуваного матеріалу) проводяться за схемою 2.1 до закінчення основного курсу хіміотерапії.

Примітки:

БС - бактеріоскопія;

* - якщо наприкінці 2-го місяця лікування результати бактеріоскопії мазка КСП+ (в мазку наявні КСП), є необхідним проведення бактеріоскопії наприкінці 3-го місяця лікування;

** - якщо наприкінці 6-го місяця лікування результати бактеріоскопії мазка КСП+ (в мазку наявні КСП), є необхідним проведення бактеріоскопії наприкінці 8-го місяця лікування.

В період лікування обстеження проводится після дводенної перерви в прийомі антимікобактеріальних препаратів.

2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу

Бактеріоскопічний метод дослідження залишається одним з основних. Перевага цього методу - в його швидкості. Але можливості його обмежені: при прямій бактеріоскопії мазка, забарвленого за Цілем-Нільсеном, мікобактерії туберкульозу можуть бути виявлені тільки при дуже великій їх кількості - 5 000 - 10 000 бактеріальних клітин і більше в 1,0 мл патологічного матеріалу. Хворі, особливо в процесі антибактеріальної терапії, часто виділяють мікобактерії в значно меншій кількості, тоді цей метод може виявитися недостатньо чутливим для їхнього виявлення. У таких випадках застосовують методи "збагачення" патологічного матеріалу.

Приводимо методику прямої мікроскопії мазка за Цілем-Нільсеном (п.2.2.1). Метод прямої мікроскопії мазка за Цілем-Нільсеном доцільно використовувати як попереднє дослідження, однак у світовій практиці і за рекомендаціями ВООЗ у даний час досліджується осад патологічного матеріалу, який отримується після попередньої гомогенізації матеріалу з наступним його центрифугуванням (метод збагачення).

2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном

Принцип методу грунтується на здатності M.tuberculosis після забарвлення їх фуксином при прогріванні утримувати барвник навіть після тривалого знебарвлення в сірчаній кислоті або в солянокислому спирті.

Реактиви

1. 1,0 % розчин основного фуксину (1,0 г основного фуксину розтирають із 2-3 краплями гліцерину, додають по краплі 10,0 мл 96 % етилового спирту і 90,0 мл 5,0 % розчину фенолу (5,0 г кристалічного фенолу або карболової кислоти в 100,0 мл дистильованої води)). Розчин лишають на добу, потім фільтрують через паперовий фільтр. Зберігають у темному місці при кімнатній температурі в добре закритому посуді.

2. Знебарвлюючі розчини: 20,0 % сірчана кислота (20,0 мл концентрованої H2SO4 додають до 80,0 мл стерильної дистильованої води); 3,0 % солянокислий спирт (3,0 мл концентрованої соляної кислои додають до 97,0 мл 70 % етилового спирту).

3. Дофарбовуючий розчин: 0,25 % метиленового синього (0,25 г метиленового синього на 1,0 л дистильованої води).

4. Фільтрувальний папір.

Всі розчини маркуються і зберігаються в посуді з темного скла при кімнатній температурі протягом 6-12 місяців.

Спеціальне обладнання

Мікроскоп з імерсійним об'єктивом

Газовий або спиртовий пальник

Предметні скельця

Дерев'яна паличка

Хід дослідження

Приготування мазка харкотиння:

Фіксуйте препарати, використовуючи один із наступних методів:

- Проведіть скельце (мазком догори) через полум'я 3-4 рази. Не перегрівайте мазок. Перед забарвленням мазок необхідно охолодити.

- Фіксуйте мазки не менше 2 годин на електронагрівачі для сушки предметних скелець (при температурі + (65 - 75) град. Цельсію).

Цінність мазків при дослідженні іншого біологічного матеріалу (не з легень)

Так як туберкульозні бактерії можуть вражати майже будь-які органи, лабораторія може отримувати для дослідження різноманітний матеріал, наприклад, біологічні рідини, тканини, гній та сечу. Результати бактеріоскопічного дослідження цих матеріалів мають обмежене значення, тому в таких випадках рекомендується використовувати культуральний метод дослідження.

Промивні води шлунка. Не слід використовувати проби промивних вод шлунка для приготування мазків, так як при цьому можуть бути отримані некоректні результати. Кислотостійкі сапрофітні бактерії нерідко присутні у воді та в харчових продуктах, з якими вони можуть потрапити в шлунок. При бактеріоскопічному дослідженні неможливо віддиференціювати такі мікроорганізми від туберкульозних бактерій.

Мазок з гортані. Мікроскопія мазків з гортані не представляє цінності. Негативні результати нічого не значать, тому краще зберегти такий матеріал для культурального дослідження.

Гній та густий аспірат. Мазки з такого матеріалу повинні бути дуже тонкими. Товсті мазки звичайно змиваються з предметних скелець, а якщо вони й зберігаються на склі, то все одно після забарвлення дуже важко віддиференціювати кислотостікі бактерії. Труднощі можуть виникнути й при наявності в мазку великої кількості крові, так як іноді елементи крові можуть бути причиною утворення кислотостійких артефактів.

Плевральна рідина. Матеріал з плевральної рідини повинен бути відцентрифугований, після чого для приготування тонкого мазку використовують осад.

Спиномозкова рідина. Мікроскопія мазків із спиномозкової рідини рідко дає позитивні результати, а осад концентрованої рідини краще використовувати для посіву.

Сеча. Мікроскопія мазків із осаду відцентрифугованої сечі не дозволяє отримати достовірні результати, тому бактеріоскопічне дослідження сечі проводити недоцільно.

Фарбування мазків.

Примітка: Для запобігання отримання хибнопозитивних результатів бактеріоскопії рекомендується знебарвлюючі та дофарбовуючі розчини наносити безпосередньо на мазок. Слід відмовитися від занурення скелець з мазками в посуд із знебарвлюючими та дофарбовуючими розчинами.

Оцінка результатів. Препарат мікроскопують під імерсією. На перегляд препарату звичайно потрібно біля 15 хвилин. Цього часу достатньо, щоб виявити поодинокі мікобактерії в препараті. В цьому випадку необхідно переглянути не менш 300 полів зору.

В останній час при мікроскопії можна спостерігати морфологічні і тінкторіальні зміни M.tuberculosis під впливом антимікобактеріальних препаратів, що приводить до утруднення диференціації їх від атипових і сапрофітних мікобактерій. Відомо, що М.tuberculosis можуть частково змінювати кислотостійкість, набувати кокоподібної, сегментоподібної форми, а також подвійних коків, розташованих бобоподібно, як всередині лейкоцитів, так і самостійно. Це ускладнює їх диференціацію.

Кількість мікобактерій в мазку (або колоній в пробірці при культуральному методі дослідження) в процесі антимікобактеріальної терапії є орієнтовним показником її ефективності або непрямим свідченням розвитку стійкості мікобактерій до антимікобактеріальних препаратів. Якщо в процесі лікування кількість мікобактерій у препараті не зменшується в порівнянні з початковим - терапію хворого варто змінити.

Дуже важливо визначити живі чи неживі мікобактерії, оскільки вирішити це питання неможливо шляхом фарбування мазка за Цілем-Нільсеном. З цією метою приготований мазок фіксують над полум'ям, фарбують 1,0 % розчином малахітового зеленого протягом 5 - 10 хвилин, підігріваючи мазок до появи парів. Після цього фарбу зливають, мазок промивають водою і забарвлюють карболовим фуксином (в розведенні 1:5) протягом 5 хвилин. При цьому живі мікобактерії фарбуються в зелений колір, а нежиттєздатні - в червоний. Цитохімічний метод визначення життєздатності мікобактерій застосовують для проб з великою кількістю мікобактерій.

Предметні скельця використовуються лише нові. Мазки з позитивними результатами знищують в установленому порядку, так як на скельцях можуть зберігатися мікобактерії попередніх аналізів.

2.2.2 Метод збагачення

У випадку відсутності мікобактерій при прямому мікроскопічному дослідженні та при наявності клінічних ознак туберкульозу застосовують різні методи обробки досліджуваного матеріалу з метою концентрації збудника - методи збагачення.

Наводимо найбільш поширену та найменш трудомістку методику збагачення досліджуваного матеріалу.

Кип'ятіння з содовим розчином

Харкотиння хворого збирають у кишенькову плювальницю в кількості 10 - 20 мл. Туди додають рівний об'єм стерильного 5,0 % розчину харчової соди (бікарбонату натрію), ставлять на водяну баню і кип'ятять протягом 45 хвилин з моменту закипання води. Далі після охолодження вміст виливають в центрифужні пробірки, центрифугують при 3500 об/хв. протягом 25 - 30 хвилин, надосадову рідину зливають, а з осаду роблять тонкі мазки, фіксують їх, фарбують за Цілем-Нільсеном і мікроскопують під імерсійною системою світлового мікроскопу.

Кип'ятіння з содовим розчином широко використовується в даний час, завдяки його простоті, ефективності, доступності та безпечності.

Оцінка результатів світлової мікроскопії.

Для запобігання отримання хибнопозитивних результатів при проведенні бактеріоскопії необхідно:

- імерсійне масло наносити на скельце піпеткою, не торкаючись поверхні мазка;

- об'єктив не повинен торкатися поверхні мазка, а легко стикатися з верхнім меніском імерсійного масла.

Перегляд мазків треба робити за певною системою, це вимагає стандартизації, що гарантує перегляд найбільш репрезентативних полів у мазку. Для того, щоб переконатися в однократності проглядання полів зору, необхідно дотримуватися визначеного порядку і керуватися наступними рекомендаціями:

- перегляд мазків, забарвлених за Цілем-Нільсеном, завжди проводиться під 100 кратним об'єктивом з імерсією;

- обов'язково включати позитивний і негативний контролі. Позитивний контроль гарантує придатність розчинів до фарбування і правильність методу. Негативний контроль підтверджує відсутність у розчинах і барвниках кислотостійких артефактів;

- техніка перегляду мазка: мазок проглядається кілька разів по довжині зигзагоподібно;

- мазок можна кваліфікувати як негативний після перегляду не менше 300 полів зору. У досвідченого мікроскопіста на цю роботу піде 15 хвилин. У мазку площею 1,0 х 2,0 см кількість мікроскопічних полів зору від краю до краю буде відповідати 100. У випадку, якщо мазок явно позитивний, немає необхідності переглядати весь мазок і перегляд декількох полів (20-50) достатній для оцінки його як позитивного.

Мікроскопічне дослідження повинне показати, чи присутні в мазку кислотостійкі палички, і, якщо присутні, необхідно дати їх кількісну оцінку в полі зору. При прямій бактеріоскопії у повноцінному полі зору повинен бути присутнім один з наступних елементів бронхіального секрету: лейкоцити, еластичні волокна і миготливий епітелій. Після збагачення цих елементів немає, бо вони зникають під впливом обробки матеріалу. Результати повинні бути представлені в кількісному вираженні. При фарбуванні мазків за методом Ціля-Нільсена рекомендується наступний порядок видачі результатів:

Примітки: КСП - кислостійкі палички; п/зору - поле зору.

2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія

Люмінесцентна мікроскопія має більш високу чутливість у виявленні мікобактерій. Метод може бути використаний при різних видах обробки біологічного матеріалу. Цей метод значно збільшує діагностичну ефективність мікроскопічних досліджень. Швидкість виявлення мікобактерій, простота флюорохромування робить його широко доступним для практичних лабораторій. Перевагою методу люмінесцентної мікроскопії є те, що він дозволяє проводити дослідження при менших збільшеннях мікроскопа і, отже, переглядати в короткий термін значно більше полей зору, ніж при звичайній мікроскопії з імерсійною системою. Застосовуючи малі збільшення, вдається швидше виявити мікобактерії туберкульозу. Люмінесцентна мікроскопія дозволяє збільшити знахідки у порівнянні з прямою бактеріоскопією мазка. Цей метод крім того найбільш економічний з усіх бактеріоскопічних методів дослідження і рекомендується як основний метод в обласних протитуберкульозних диспансерах для проведення скринінгових досліджень із розрахунку 1 люмінесцентний мікроскоп на 500 тис. - 1 млн. населення.

Даний метод мікроскопії грунтується на здатності мікобактерій сприймати люмінесцентні барвники і потім світитися при опроміненні ультрафіолетовими променями. При цьому в залежності від застосовуваних барвників мікобактерії дають яскраво-червоне світіння на зеленому, чи золотаво-жовте на темно-зеленому тлі поля зору.

Існує ряд методик забарвлення препаратів для люмінесцентної мікроскопії: акридиновим жовтогарячим; аураміном і родаміном за Боєм; аураміном за Хагеманом; аураміном за Хагеманом в модифікації Набонна.

Для забарвлення препаратів акридиновим жовтогарячим необхідні наступні реактиви: акрединовий жовтогарячий, 3,0 % солянокислий спирт, метиловий спирт, 10,0 % розчин аміаку. З акрединового жовтогарячого готується основний розчин шляхом розчинення 1,0 г барвника в 100,0 мл дистильованої води. З основного розчину готується робочий розчин шляхом додавання 10,0 мл основного розчину до 990,0 мл дистильованої води. Сюди ж додається 3 - 6 крапель 10,0 % розчину аміаку, рН має бути не менше 9,0. Мазки готують з осаду, отриманого при обробці матеріалу для посіву, краплю якого наносять на скельце звичайним способом. Препарати фіксуються метиловим спиртом протягом 3 - 5 хвилин. Скельця для препаратів повинні бути новими, тонкими і без подряпин. Забарвлення препаратів здійснюють шляхом занурення фіксованих мазків у робочий розчин акридинового жовтогарячого на 24 години без підігріву. Потім мазки двічі по 10 хвилин знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом, промивають дистильованою водою, висушують у термостаті і мікроскопують.

Для забарвлення препаратів аураміном і родаміном за Боєм необхідні наступні реактиви: аурамін 00, родамін С, 3,0 % солянокислий спирт, 0,25 % водний розчин метиленової синьки. Родамін С можна заміняти подвійною кількістю родаміу 6 Ж. Робочий розчин аураміну і родаміну готується шляхом додавання 1,0 г аураміну і 0,1 г родаміну до 1000,0 мл дистильованої води. Фіксований над полум'ям пальника мазок забарвлюють протягом 10 хвилин робочим розчином при легкому підігріванні, потім мазок промивають водою, знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом і знову промивають водою. Гасіння тла роблять шляхом забарвлення препарату 0,25 % розчином метиленового синього, після чого препарат промивають водою, висушують на повітрі і мікроскопують.

Методика забарвлення препарату за Хагеманом в модифікації Набонна (аураміновий метод): на фіксований мазок наливають розчин аураміну 00 на 15 хвилин (не нагрівають мазки й не використовують стрічки фільтровального папірця), потім препарат ретельно промивають водою, знебарвлюють солянокислим спиртом 3 - 5 хвилин, промивають водою, дофарбовують розчином кислого фуксину протягом 2 хвилин, ретельно промивають водою, висушують і мікроскопують. Забарвлені препарати мають малиново-червоний колір. При люмінесцентній мікроскопії клітини мікобактерій світяться золотаво-зеленим кольором на темному чи бурувато-червоному тлі.

Методика забарвлення препаратів за Боєм в модифікації Полякової: фіксовані препарати забарвлюють розчином, що містить аурамін (1:1000) і родамін С (1:1000) протягом 20 хвилин. Потім препарат промивають водопровідною водою і знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом протягом 3 - 5 хвилин. Потім цей препарат знову промивають водою і після гасіння тла 0,25 % розчином метиленової синьки протягом 1 - 2 хвилин, промивання водою і висушування, він готовий до мікроскопії. При даному методі забарвлення в препаратах при люмінесцентній мікроскопії клітини мікобактерій мають золотаво-жовтогарячий колір.

При люмінесцентній мікроскопії необхідно правильно (відповідно до інструкцій) користуватися освітлювальною апаратурою. Позитивна відповідь дається при виявленні не менше 3-х клітин мікобактерій у препараті. Кількість клітин мікобактерій оцінюється так само, як і в методиці світлової мікроскопії препаратів, пофарбованих за Цілем-Нільсеном.

Люмінесцентний метод мікроскопії підвищує результативність досліджень по виявленню клітин мікобактерій у досліджуваному матеріалі на 18,0 - 20,0 % у порівнянні зі світловою мікроскопією препаратів з нативного матеріалу і на 8,0 - 10,0 % - препаратів з матеріалу після збагачення. Слід зазначити, що люмінесцентна та пряма мікроскопія не дає можливості диференціювати M.tuberculosis від сапрофітних та умовно-патогенних мікобактерій.

Приготування барвників і реактивів для люмінесцентної мікроскопії

Розчин аураміну 00 і родаміну С (для забарвлення за Боєм):

1,0 г аураміну і 0,1 г родаміну С розчиняють у 1000,0 мл дистильованої води (для цього розчину можна застосовувати родамін 6 Ж в кількості 0,2 г на 1000,0 мл дистильованої води).

3,0 % солянокислий спирт (для забарвлення за Боєм): 3,0 мл соляної кислоти додається до 97,0 мл 70 % спирту.

Розчин аураміну 00 (для забарвлення за Хагеманом): 1,0 г аураміну 00 розчиняють у 1000,0 мл дистильованої води. У фарбу додають 5,0 мл 5,0 % розчину карболової кислоти. Водний розчин аураміну 00 не повинен давати пластівців при додаванні в нього карболової кислоти.

Кислий фуксин (для забарвлення за Хагеманом): 1,0 г кислого фуксину розчиняється в 390,0 мл дистильованої води. До цього розчину додається 10,0 мл концентрованої оцтової кислоти.

Солянокислий спирт (для знебарвлення препаратів при забарвленні за Хагеманом): до 90,0 мл спирту-ректифікату, налитого в градуйовану посудину, доливається 4,0 мл концентрованої соляної кислоти, що димить, і висипається 4,0 г хімічно чистої кухонної солі. Потім доливається дистильована вода до мітки 100,0 мл (частина нерозчиненої кухонної солі залишається в осаді).

0,25 % розчин метиленової синьки: до 100,0 мл дистильованої води додається 0,25 г метиленового синього.

Основні розчини флюорохромів можуть зберігатися в темряві багато місяців у темних флаконах, закритих скляними притертими корками чи гумовими корками, обгорненими алюмінієвою фольгою. Робочі розчини не повинні зберігатися більше 6 - 7 діб. Фільтрувальний папір застосовувати не можна. Якщо барвник розчинений не цілком і є осад, флакон з розчином на кілька годин можна помістити в термостат при 37 град. Цельсію.

Оцінка результатів люмінесцентної мікроскопії.

Мазки, пофарбовані для люмінесцентної мікроскопії, якщо неможливо переглянути відразу після приготування, слід зберігати в темному місці, переважно в холодильнику, максимум протягом доби, оскільки з часом інтенсивність світіння флюорохромів може знижуватися.

При люмінесцентній мікроскопії мазків, як правило, використовується менше збільшення (250-630), у порівнянні зі збільшенням, використовуваним при перегляді мазків, пофарбованих за методом Ціля-Нільсена (1000). Поле зору в люмінесцентному мікроскопі охоплює більшу частину мазка, ніж при світловій мікроскопії. Представлена нижче схема дозволяє порівнювати результати, отримані в різних лабораторіях, незалежно від використаного методу мікроскопії і збільшення:

Примітка: КСП - кислотостійкі палички.

Приклад: При перегляді мазка методом люмінесцентної мікроскопії виявлено 20 КСП у полі зору при збільшенні 450. Ділимо це число на коефіцієнт, приведений у схемі: 4, одержуємо порівнянний результат з результатом світлової мікроскопії - 5 КСП в полі зору, що може бути оцінене як 2 +, але не як 3 +.

Після перегляду препаратів методом люмінесцентної мікроскопії при необхідності можна забарвити ці ж самі препарати за Цілем-Нільсеном та досліджувати їх в світловому мікроскопі.

2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія

Фазовоконтрастна мікроскопія є єдиним мікроскопічним методом дослідження, що дозволяє спостерігати клітини мікобактерій і їх біологічно змінені форми в живому стані. Для її здійснення до звичайного світлового мікроскопу застосовується спеціальне фазовоконтрастне пристосування КФ-4.

З методів фазовоконтрастної мікроскопії найбільше широко застосовується методика дослідження препаратів, приготовлених по типу препарату, що одержав назву "роздавлена крапля". Для готування даного препарату беруть чисте знежирене предметне скельце. На поверхню його бактеріологічною петлею чи піпеткою наносять краплю рідкої суспензії досліджуваних мікобактерій чи їх біологічно змінених форм, покривають краплю чистим і фламбірованим над полум'ям пальника покривним скельцем так, щоб між предметним і покривним скельцем не було пухирців повітря. Препарат поміщають на предметний столик мікроскопа і відповідно до правил здійснюють фазовоконтрастну мікроскопію. При цьому в полі зору мікроскопа стають помітними живі клітини мікобактерій чи їх біологічно змінені форми. Для фазовоконтрастної мікроскопії імерсійним методом на поверхню покривного скельця наносять краплю імерсійної олії, занурюють у неї імерсійний об'єктив і здійснюють мікроскопію. При цьому у полі зору спостерігають живі клітини мікобактерій і їх біологічно змінені форми, окремі деталі їх структури.

2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу

Бактеріологічний метод виявлення мікобактерій має великі переваги перед методом бактеріоскопії. Він дозволяє виявити M.tuberculosis в досліджуваному матеріалі, якщо їх міститься біля 100 в 1 мл. Зрілі культури можуть бути ретельно досліджені й ідентифіковані, у них може бути визначена чутливість до антимікобактеріальних препаратів, вивчена вірулентность та інші властивості. Виділення мікобактерій бактеріологічним методом свідчить про високу життєздатність мікобактерій і вегетування їх в організмі хворого.

2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище

Бактеріологічному дослідженню піддається самий різноманітний матеріал: харкотиння, промивні води бронхів, шлунка, ексудат, виділення ран, сеча, ліквор, біопсійний і секційний матеріал і ін. Матеріал повинен доставлятися в лабораторію в стерильному, добре закритому посуді.

Для знищення супутньої мікрофлори досліджуваний матеріал піддають спеціальній обробці. Для обробки патологічного матеріалу використовують різні речовини. Основні вимоги, що пред'являють до таких реактивів, це, з одного боку, повне зберігання життєздатності M.tuberculosis, а з іншого, пригнічення росту неспецифічної мікрофлори, яка може бути в досліджуваному матеріалі. Для практики можуть бути рекомендовані наступні методи обробки патологічного матеріалу.

Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислим натрієм

Цей метод є найбільш зручним і поширеним.

Принцип. Трьохзаміщений фосфат натрію є реактивом, який не впливає на життєздатність туберкульозних паличок. Цей метод лужної обробки допускає навіть тривалу експозицію патологічного матеріалу з фосфатом натрію без порушення життєздатності M.tuberculosis (2-3 доби). Це особливо цінно в тих випадках, коли доставка матеріалу в лабораторію утруднена. Крім того, трьохзаміщений фосфат натрію добре пригнічує супутню мікрофлору і гомогенізує матеріал. Обробці трьохзаміщеним фосфорнокислим натрієм піддають харкотиння, промивні води бронхів, ексудати і будь-які інші матеріали.

Реактиви

12,0 % стерильний водний розчин Na3PO4 (автоклавування при 121 град. Цельсію 1-2 хв.).

Обробка полягає в додаванні до досліджуваного матеріалу рівної за об'ємом кількості 12,0 % розчину трьохзаміщеного фосфату натрію й інкубації цієї суміші при 37 град. Цельсію у термостаті протягом доби. Після інкубації матеріал центрифугують 15 хвилин при 3500 об/хв., надосадну рідину зливають, до осаду додають 1,0 мл фізіологічного розчину і засівають по 0,2 мл на 2 пробірки щільного яєчного середовища.

Обробка фосфатом натрію зручна і тоді, коли харкотиння для посіву треба доставляти в лабораторію здалека. У цьому випадку хворий протягом доби збирає харкотиння в стерильну кишенькову плювальницю з 10,0 мл 12,0 % розчину фосфату натрію, який служить консервантом. При доставці харкотиння в лабораторію вміст плювальниці переливають у стерильні пробірки, центрифугують, надосадну рідину зливають, а осад засівають звичайним способом.

Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями ВООЗ)

Реагенти:

4,0 % гідроксид натрію (NaOH):

Гідроксид натрію (хімічно чистий) - 4,0 г.

Дистильована вода - 100,0 мл.

Розчинити NaOH в дистильованій воді й стерилізувати автоклавуванням при 121 град. Цельсію протягом 15 хв.

Стерильний розчин NaOH можна зберігати протягом декількох тижнів. Зберігати в пластиковому посуді.

Стерильний ізотонічний розчин хлориду натрію:

Хлорид натрію (хімічно чистий) - 0,85 г.

Дистильована вода - 100,0 мл.

Розчинити NaCl в дистильованій воді і стерилізувати автоклавуванням при 121 град. Цельсію протягом 15 хв.

Методика.

Гідроксид натрію є токсичним по відношенню як до контамінантних мікроорганізмів, так і до туберкульозних бактерій. Тому при використанні даного методу необхідно чітко додержуватися вказаної тривалості кожного етапу обробки.

Обробка досліджуваних проб методом NALC-OH - N-ацетил-L-цистеїном з гідроксидом натрію

Більш щадящим методом обробки матеріалу є метод з використанням N-ацетил-L-цистеїну і гідроокису натрія (NALC-OH).

Застосування муколітичного препарату NALC (який використовується для швидкого розрідження харкотиння) дозволяє знизити концентрацію деконтамінуючого субстрату (NaOH) до 1,0 %. Цитрат натрію, який включений до літичної суміші, є необхідним для зв'язування йонів важких металів, які можуть бути присутніми в пробі та інактивовувати дію ацетилцистеїну.

Обробка досліджуваних проб методом NALC-OH переслідує 3 мети:

- деконтамінація;

- гомогенізація;

- збагачення.

Даний метод обробки проб є найбільш щадящим. Час експозиції після внесення NALC-OH 20 хвилин і температурний режим (20 град. Цельсію) дозволяє зберегти життєздатність 85,0 % клітин мікобактеріальної популяції, що знаходиться в досліджуваному матеріалі.

Приготування розчинів.

Розчин 1: - 40,0 г NaOH розчинити в 1000,0 мл дистильованої води.

Розчин 2: - 32,5 г Na-цитрату розчинити в 1000,0 мл дистильованої води.

Розчини 1 і 2 автоклавують 20 хвилин при 121 град. Цельсію.

- 50,0 мл розчину 1;

Розчин 3: - 50,0 мл розчину 2;

- 0,5 г N-ацетил-L-цистеїну.

Розчин 3 готувати кожного дня!!!

Фосфатний буфер - рН 6,8: - 11,64 г Na2HPO4 х 2H2О;

- 9,26 г KH2PO4

Розчинити в 2000,0 мл дистильованої води, встановити рН, автоклавувати при 121 град. Цельсію 20 хвилин

Хід дослідження

- 10,0 мл досліджуваної проби змішати з розчином 3 в рівних кількостях;

- змішувати, струшуючи протягом 20 хвилин при кімнатній температурі;

- додати фосфатний буфер до 50,0 мл, перемішати;

- центрифугувати при 3500 об/ хв 20 хвилин;

- надосад злити;

- до осаду додати 1,0 мл фосфатного буфера, струсити, негайно посіяти.

Особливості обробки сечі методом NALC-OH

Для дослідження використовують ранкову порцію сечі в кількості 50,0 мл.

Готують суміш: - 50,0 мл сечі;

- 0,5 мл плазми;

- 3 краплі 20,0 % сульфосаліцилової кислоти;

- 1 краплю 1,0 % твіну-80.

Обережно перемішують.

Для осадження білку залишають на 2 години в холодильнику (при + 4 град. Цельсію). Потім пробу центрифугують при 3500 об/хв 20 хвилин і зливають надосадну рідину.

Осад обробляють за методом NALC-OH.

Обробка досліджуваних проб харкотиння методом Necal - BX (модифікований)

(Necal-BX - диізобутилнафталансульфонат)

Приготування розчинів.

- 0,1 г Necal-BX (сухий порошок);

Розчин 1: - 5,0 г твердого кристалічного NaOH;

- розчинити в стерильній дистильованій воді, довести об'єм суміші до 1000 мл.

- 2,0 г CaCl2 x 2H2O (CaCl2 без води - 1,5 г);

Розчин 2: - 4,0 г BaCl2 x H2O;

- розчинити в стерильній дистильованій воді, довести об'єм суміші до 100 мл.

Розчини 1 і 2 не потребують автоклавування. Зберігають стабільність при 4-25 град. Цельсію протягом 4 тижнів.

Хід дослідження

1 частину (приблизно 2,0 мл) досліджуваного матеріалу (наприклад, харкотиння) ретельно змішують з 5 частинами (приблизно 10,0 мл) розчину 1 і 2 краплями розчину 2. Інкубують до 20 годин при кімнатній температурі. Після цього негайно центрифугують при 3500 об/хв, зливають надосадну рідину, осад засівають на живильне середовище Льовенштайна-Єнсена.

Обробка кислотою

Для обробки патологічного матеріалу можна користуватися сірчаною кислотою. Цей метод зручний для обробки матеріалу в той же день, наприклад, перед вихідним днем. У залежності від забрудненості матеріалу використовують кислоту різної концентрації. Харкотиння, гнійні ексудати, тампони з ран, пунктати лімфатичних вузлів, промивні води шлунка, бронхів, операційний матеріал обробляють 3,0 %, сечу - 6,0 %, секційний матеріал - 10,0 % сірчаною кислотою. Стерильно взяту спинномозкову рідину, серозні ексудати можна засівати без обробки.

Досліджуваний матеріал поміщають у банку з скляними кульками або битим склом, додають рівний об'єм відповідного розчину сірчаної кислоти і старанно, протягом 10 хвилин струшують. Потім оброблений кислотою матеріал 10 хвилин центрифугують. Час контакту матеріалу з кислотою не повинен перевищувати 20 хвилин від початку обробки. Після центрифугування надосадну рідину зливають, до осаду додають фізіологічний розчин, ще раз центрифугують і зливають, відмиваючи кислоту. Осад засівають на яєчне середовище по 0,2 мл. Варто пам'ятати, що при будь-якому методі обробки промивні води шлунка сіють відразу ж, тому що шлунковий сік згубно діє на мікобактерії туберкульозу, і при тривалому стоянні частина паличок гине. Якщо патологічний матеріал доставлений у великій кількості (промивні води шлунка, сеча і т.п.), то спочатку його центрифугують, збирають осад, який потім обробляють і засівають. При всіх способах обробки матеріалу посів роблять мінімум на 2 пробірки яєчного середовища. Для підвищення виходу мікобактерій доцільно робити посів патологічного матеріалу на два яєчних середовища - Льовенштайна-Єнсена і Фінна-2.

Посіви переглядають кожного тижня. Ріст M.tuberculosis з'являється на З - 6 тиждень у вигляді сухих безпігментних або блідо-кремових R-колоній. Після курсу антимікобактеріальної терапії від хворих можуть виділятися культури з гладким вологим ростом (S-колонії). Позитивну відповідь дають тільки після мікроскопії культур.

Результат посіву повинен відображати не тільки якісну характеристику (позитивний чи негативний), але і кількісну оцінку (число колоній). Рекомендується керуватися табл. 2.1 (Національна протитуберкульозна програма, 2000):

Більшість посівів дає ріст M.tuberculosis протягом двох місяців. Тому достатньо інкубувати посіви до двох з половиною місяців. При відсутності росту до цього часу посів вважається негативним, і пробірки видаляють.

2.3.2 Живильні середовища

Для посіву патологічного матеріалу використовують наступні яєчні середовища: Льовенштайна-Єнсена, Фінна-2 та ін.

Середовище Льовенштайна-Єнсена рекомендоване ВООЗ для всіх координаційних лабораторій. Цим середовищем користується більшість лабораторій України.

Заслуговує уваги середовище Фінна-2. Воно відрізняється від середовища Льовенштайна-Єнсена тим, що не містить дорогого L-аспарагіну. На цьому середовищі ріст мікобактерій, як правило, з'являється на декілька днів раніше, ніж на середовищі Льовенштайна-Єнсена. Використання двох середовищ одночасно підвищує відсоток виділення M.tuberculosis з патологічного матеріалу і є обов'язковим. Однак треба пам'ятати, що середовище Фінна-2 можна використовувати лише для первинного виділення мікобактерій з патологічного матеріалу.

2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ Середовище Льовенштайна-Єнсена (без крохмалю).

Сольовий розчин: однозаміщений фосфорнокислий калій - 2,4 г, магній сірчанокислий - 0,24 г, магній лимоннокислий - 0,6 г, L-аспарагін - 3,6 г, гліцерин - 12,0 мл, вода дистильована - 600,0 мл.

Реактиви розчиняють у воді у вказаній вище послідовності при слабкому нагріванні, розливають у флакони і стерилізують при 121 град. Цельсію протягом 30 хвилин.

Сольова основа може бути приготована заздалегідь і зберігатися до 1 місяця.

Яєчна маса: 10 - 12 (в залежності від величини) свіжих дієтичних яєць миють проточною теплою водою щіткою з милом, занурюють на 30 хвилин у 70 % спирт, або оброблюють 1 - 2 хвилини 5,0 % йодною настоянкою, а потім над полум'ям пальника розбивають стерильним пінцетом у колбу з битим склом, добре струшують після кожного яйця, до отриманої однорідної яєчної маси додають 10,0 мл стерильного 2,0 % розчину малахітової зелені і 300,0 мл сольового розчину. Суміш фільтрують через марлевий фільтр і розливають у пробірки приблизно по 5,0 мл. Згортають в скошеному вигляді при 85 град. Цельсію протягом 30 хвилин в апараті для згортання сироватки крові.

В даний час для виділення та культивування МБТ використовують сухі комерційні середовища для приготування сольової основи середовища Льовенштайна-Єнсена (фірма MERCK (Німеччина), а також виробництва Державного експериментального заводу медичних препаратів (м. Київ, Україна).

Середовище Фінна-2.

Сольовий розчин: магній сірчанокислий - 0,5 г, натрій лимоннокислий - 1,0 г, квасці залізоаміачні - 0,05 г, калій фосфорнокислий однозаміщений - 20,0 г, амоній лимоннокислий однозаміщений - 5,0 г, натрій глутаміновокислий однозаміщений - 10,0 г, гліцерин - 20,0 мл, вода дистильована - до 1,0 л.

Інгредієнти розчиняють у вказаному вище порядку в теплій дистильованій воді.

рН (не корегувати) - 6,3-6,5.

Розливають у флакони і стерилізують при 121 град. Цельсію - 20 хвилин.

Далі чинять так само, як і при приготуванні середовища Льовенштайна-Єнсена.

Для приготування яєчних живильних середовищ використовують свіжі курячі яйця (не більше тижня), з цілою, незабрудненою шкарлупою.

Готове яєчне середовище з малахітовим зеленим повинно бути світло-зеленого кольору, без дрібних поглиблень та пухирців на поверхні, досить щільним. Знебарвлення готового середовища вказує на його надлишкову температурну обробку.

Після згортування (коагуляції) необхідно залишити всі пробірки (або вибіркові екземпляри) при 35-37 град. Цельсію на 24 години для перевірки стерильності.

2.3.2.2. Рідкі живильні середовища

Кров'яне середовище.

Для прискореного виявлення в патологічному матеріалі M.tuberculosis в виключних випадках використовують метод Прайса, оснований на мікрокультивуванні мікобактерій на предметних скельцях, а також в глибині рідкого середовища (в модифікації Є.А.Школьнікової). Цей метод дає можливість виявити мікроколонії M.tuberculosis уже через 2 - 10 діб після посіву.

Досліджуваний матеріал після обробки переносять піпеткою в центрифужну пробірку і центрифугують 1-2 хвилини. З осаду готують мазки на стерильних вузьких скельцях, які отримують, розрізуючи предметне скло вздовж на 2 частини. Можна робити мазки безпосередньо з грудочок харкотиння. Мазки роблять на 1/3 частини скельця, яке укладають в стерильну кювету, підсушують в термостаті при 37 град. Цельсію протягом кількох годин, потім заливають на 1-2 хвилини 3,0 % розчином сірчаної кислоти для деконтамінації і фіксації. Після зливання кислоти мазки тричі відмивають стерильною водою і занурюють у пробірки з живильним середовищем. Як живильне середовище використовується свіжа цитратна гемолізована донорська кров, термін придатності якої для росту мікобактерій - не більше 10 діб. Кров від донора збирається в стерильну колбу з 5,0 % розчином цитрату натрію (на 100,0 мл крові 10,0 мл цитрату). Цитратна кров гемолізується стерильною дистильованою водою в співвідношенні 1:10 - 1:5 (в залежності від дати взяття крові). Гемолізована кров над полум'ям пальника розливається по 5,0 мл у стерильні пробірки.

Облік результатів проводиться через 8 - 10 діб інкубації в термостаті при 37 град. Цельсію. Після закінчення цього терміну пробірки з мазками автоклавують, обережно відмивають водою від крові, підсушують, фіксують над полум'ям, забарвлюють за Цілем-Нільсеном і мікроскопують під малим збільшенням мікроскопа. При позитивному результаті в мазках одержують характерні мікроколонії, що представляють собою забарвлені в червоний колір переплетені джгути, так звані "коси", які складаються з великої кількості щільно притиснутих одна до одної клітин, їх можна побачити, перевівши об'єктив на імерсійну систему. Корд-фактор (тригалоза-6,6-диміколат), що забезпечує зближення бактеріальних клітин у мікроколоніях, забезпечує ріст у вигляді серпантиновидних "кіс" і має відношення до вірулентності збудника. Слід зазначити, що предметне скельце повинно бути лише новим, без подряпин, добре відмитим, обезжиреним в суміші Нікіфорова і простерилізованим.

Напівсинтетичне середовище Школьнікової.

Застосовується для мікрокультивування M.tuberculosis в глибині рідкого середовища.

Склад. Сольовий розчин: калій фосфорнокислий однозаміщений - 1,5 г, натрій фосфорнокислий двозаміщений - 2,5 г, магній сірчанокислий - 0,5 г, натрій лимоннокислий - 1,5 г, лимоннокислоаміачне залізо - 0,05 г, L-аспарагін - 1,0 г, гліцерин - 30,0 мл, вода дистильована до 1000,0 мл. Нативна бичача сироватка. Пеніцилін.

Техніка приготування. Солі у вказаному порядку додають у дистильовану воду при легкому нагріванні на водяній бані (кожну із солей додають після того, як повністю розчиниться попередня). Середовище фільтрують через паперовий фільтр і розливають у колби, стерилізують в автоклаві при 0,5 атм. протягом 30 хвилин. В такому стані можна зберігати в холодильнику кілька місяців.

Для посіву сольовий розчин розливають у пробірки по 2,0 мл, знову автоклавують і безпосередньо перед посівом у кожну пробірку додають по 0,2 мл нативної бичачої сироватки і пеніцилін із розрахунку 10 - 20 ОД на 1,0 мл середовища.

Середовище ВКГ (розроблено В.В.Власенко) (середовище зі стимулятором росту для прискореного виявлення мікобактерій туберкульозу).

Середовище ВКГ призначене для прискореного виявлення M.tuberculosis: стимулятор - для прискорення росту, живильне середовище - для культивування мікобактерій. Стимулятор росту - стерильна, прозора, безбарвна рідина (допускається жовтуватий відтінок).

До 5,0 мл стимулятору росту додають в асептичних умовах за допомогою стерильного шприця 1,0-1,5 мл підготовленого патологічного матеріалу (відбір і підготовка матеріалу здійснюється за загальноприйнятою методикою бактеріологічних досліджень та чинної методичної НД). Отриману суспензію інкубують у термостаті при температурі (37,0 + - 1,0) град. Цельсію протягом 24 - 48 годин і висівають на живильне середовище.

Живильне середовище (дрібнодисперсний, гігроскопічний порошок кремового кольору) у кількості, зазначеній на етикетці, розмішують в 1,0 л стерильної дистильованої води, кип'ятять 2-3 хвилини до повного розплавлення агару, фільтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають у відповідний посуд, стерилізують у автоклаві при (121,0 + - 1,0) град. Цельсію протягом 15 хвилин.

Готове середовище жовтого забарвлення з рН 7,2 + - 0,2, використовують протягом 1 місяця за умови зберігання його при (6,0 + - 2,0) град. Цельсію.

Перед посівом живильне середовище розплавляють на водяній бані і розливають в асептичних умовах у стерильні чашки Петрі шаром 6-8 мм. В чашку Петрі зі свіжорозплавленим живильним середовищем вносять 1,5 мл суспензії (досліджуваного матеріалу у стимуляторі росту), рівномірно розподіляючи її по всій поверхні. Чашки Петрі не перевертають!!!, герметизують прозорою липкою стрічкою та інкубують при (37,0 + - 1,0) град. Цельсію протягом 10 діб. Посіви продивляються щоденно. Візуально можна виявити характерний ріст мікобактерій уже через 24 - 48 годин.

2.4 Біологічний метод дослідження

Зараження морських свинок варто проводити в діагностичних випадках для підтвердження туберкульозної етиології захворювання у нелікованих хворих, а також для встановлення бактеріовиділення у хворих, що приймали нетривалий час антимікобактеріальні препарати. Особливу цінність представляє біологічна проба при дослідженні матеріалів від хворих, що страждають урогенітальним туберкульозом.

Доцільно проводити одночасно зараження морських свинок і посів. Сполучення обох методів дає більше можливостей виявити мікобактерії в патологічному матеріалі.

Обробка матеріалу для зараження морських свинок.

Для зараження морських свинок використовують різноманітний матеріал: харкотиння, сечу, промивні води бронхів, шлунка, ексудати, виділення ран, операційний матеріал і ін. Досліджуваний матеріал обробляють 3,0 % сірчаною кислотою так само, як для посіву. Після обробки кислотою його двічі відмивають стерильним ізотонічним розчином хлористого натрію, щоб не залишилося кислоти, тому що при попаданні кислоти морській свинці під шкіру може виникнути виразка. До отриманого осаду додають 1,0 мл стерильного ізотонічного розчину хлористого натрію і вводять шприцем морській свинці під шкіру правої пахвинної області.

Якщо є можливість, то краще заражати двох свинок. При цьому одну морську свинку забивають через 1,5, другу - через 3 місяці. За свинками проводять систематичне спостереження, перевіряючи появу місцевого інфільтрату, стан регіонарних лімфатичних вузлів і т.п. Міра макроскопічних змін може бути різноманітною. Вона залежить від кількості і вірулентності мікобактерій туберкульозу в патологічному матеріалі.

Щомісяця перевіряють чутливість до туберкуліну, вводячи підшкірно в попередньо вищипану або поголену середню частину черевця 0,1 мл туберкуліну (100 ТО PPD-L). Реакцію оцінюють через 24 і 48 годин. Позитивною вважається реакція у вигляді інфільтрату більше 5 мм. Він спостерігається у свинок, інфікованих M.tuberculosis. При наявності в патологічному матеріалі достатньої кількості вірулентних мікобактерій уже через 2 тижні на місці зараження може з'явитися інфільтрат або виразка. Через місяць збільшуються регіонарні лімфатичні вузли.

При забої морських свинок через 1,5 місяця відмічають інфільтрат, часто з розпадом, у місці введення патологічного матеріалу, збільшення регіонарних лімфатичних вузлів, одиничні туберкульозні вогнища в легенях, в селезінці. При забої морських свинок через 3 місяці виявляється збільшення лімфатичних вузлів, як регіонарних, так і віддалених, ураження спостерігаються в такій послідовності: селезінка, печінка і легені.

При зараженні морських свинок у яєчко вводять тільки 0,4 мл матеріалу, обробленого вказаним вище способом. Для зараження в яєчко використовують добре гомогенізований матеріал: сечу, харкотиння або промивні води бронхів. При зараженні двох морських свинок їх також доцільно забивати через 1,5 і 3 місяці. По наявності специфічних змін (збільшення, ущільнення і наявність вогнищ у яєчку та у внутрішніх органах) судять про наявність мікобактерій у патологічному матеріалі.

Іноді при обстеженні олігобацилярних хворих - при посівах харкотиння або іншого матеріалу мікобактерії не висіваються, а при зараженні свинки можуть визначатися незначні зміни в регіонарному лімфатичному вузлі або в органах. У таких випадках варто зробити посів з органів морської свинки для одержання культури і її подальшого вивчення. Посів з органів свинки необхідно робити також в усіх сумнівних випадках.

У сучасній бактеріології ідентифікація мікобактерій представляє великі труднощі. З одного боку, в результаті інтенсивної і тривалої хіміотерапії туберкульозу змінилася морфологія збудника. З іншого боку, частішими стали випадки виділення з патологічного матеріалу атипових мікобактерій. У практичних лабораторіях для диференціації M.tuberculosis від інших кислотостійких мікобактерій необхідно застосовувати найбільш прості і доступні тести, що включають бактеріологічні і біохімічні дослідження.

За останнім виданням Берджі (9 видання), група 21(мікобактерії) включає 45 видів, із яких більшість являється сапрофітами, не патогенними для людини. Поряд із цим, ряд видів може викликати ураження легень, лімфатичних вузлів і інших органів. Найбільш патогенними для людини є M.tuberculosis і M.bovis. Для правильної оцінки виділених мікобактерій - ідентифікації і визначення їх ролі в захворюванні людини необхідно провести диференціацію виділених культур із використанням спеціальних методик. Комплекс цих тестів різноманітний, в залежності від кваліфікації лабораторних робітників, обсягу досліджень, що проводяться, і умов роботи лабораторії.

3.1 Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження

При культуральному методі дослідження варто враховувати ріст на яєчних, агарових і рідких живильних середовищах. Враховується також швидкість росту, температурний оптимум росту, морфологія колоній, їх колір (табл.3.1).

Позначення: * Н - нефотохромогенні, С - скотохромогенні, Ф - фотохромогенні;

** швидкість росту на щільних середовищах: повільна - протягом 4 - 6 тижнів; помірна - протягом 2-3 тижнів; швидка - протягом 2 - 7 діб.

M.tuberculosis - збудник туберкульозу у людей. Ці мікобактерії дають первинний ріст при посіві патологічного матеріалу від 3-х тижнів до 2-х місяців, рідко - до 2,5 місяців. Пасажні культури ростуть швидше. Ріст на щільному яєчному середовищі, що містить гліцерин, пишний: культури ростуть у виді шорстких r-колоній, але можуть бути гладенькими, що зливаються між собою (s-варіант), мають кремовий відтінок. На рідкому живильному середовищі мікобактерії туберкульозу утворюють плівку на поверхні, в молодих культурах - тонку, в старих - зморшкувату, грубу, а іноді навіть дають придонний крихкуватий ріст. Температурний оптимум 37-38 град. Цельсію. При 22 град. Цельсію і 45 град. Цельсію не ростуть. Морфолог(чно в мазку, забарвленому за Цілем-Нільсеном, M.tuberculosis, що виросли на яєчних середовищах, представляються вигляді поліморфних тонких спирто-, лугокислотостійких паличок, часто зігнутих, що лежать під кутом одна до одної, а іноді можна навіть бачити невеликі скупчення у вигляді так званих "кіс" (часточки від мікроколоній).

М.bovis - мікобактерії, що викликають туберкульоз у великої рогатої худоби, рідко у людей, трохи коротші, з менш вираженою схильністю до розгалуження, морфологічні відмінності від М.tuberculosis не виражені. Культуральні властивості також подібні, однак на штучних середовищах ростуть повільніше і тільки при температурі 37 - 38 град. Цельсію. У первинних культурах і на середовищах, що не містять пірувату, відзначають бідний ріст; колонії дрібні, плоскі, шорсткуваті. Концентрація гліцерину в середовищі більше ніж 0,75 % впливає негативно на швидкість розмноження M.bovis. Колонії не мають пігменту, вони - білого або сірого кольору. Бактеріоскопічно відрізнити їх від M.tuberculosis не представляється можливим. Морфологічно і культурально подібні з M.africanum i BCG - "M.bovis complex" (M.bovis, BCG, M.africanum).

M.africanum - основний збудник туберкульозу в Африці. Справжне поширення збудника визначити складно, тому що в багатьох лабораторіях його не ідентифікують, або плутають з M.bovis.

Атипові мікобактерії

В даний час атипові мікобактерії привертають все більшу увагу бактеріологів і клініцистів. Зростаюча роль атипових мікобактерій в патології людини деякою мірою пов'язана з неправильним застосуванням антибіотиків, атипові мікобактерії характеризуються широким спектром медикаментозної стійкості і потенційною патогенністю для людини і тварин.

При виділенні з патологічного матеріалу хворих атипових мікобактерій важливо встановити значення їх у патології. Особливої уваги заслуговують випадки повторного виділення з патологічного матеріалу атипових культур при відсутності в досліджуваному матеріалі M.tuberculosis. Атипові мікобактерії відрізняються від M.tuberculosis рядом ознак в залежності від їх таксономічної належності. Для систематизації атипових мікобактерій користуються угрупуванням Раньона, заснованим, головним чином, на двох ознаках - швидкості росту і пігментоутворенні. За цим угрупуванням всі атипові мікобактерії розділені на 4 групи. Представники перших 3-х груп ростуть повільно. 4-ї групи ростуть швидко. Найбільш патогенні для людини мікобактерії I і III груп.

I група - фотохромогенні мікобактерії: М. kansasii, M.marinum (М.balnei), М. simiae, M.szulgai. Кислотостійкі палички; при культивуванні звичайно утворюють жовто-жовтогарячий пігмент; колонії виростають протягом 2 тижнів при температурі 37 град. Цельсію і протягом 3 тижнів - при кімнатній температурі. При культивуванні на світлі пігментоутворюючі штами дають більш інтенсивне червоно-жовтогаряче забарвлення колоній. Молоді клітини довгі і порівняно широкі, розташовуються стрічками; утворюють S- і R-колонії. Типовий вид - M.kansasii.

М. kansasii. Утворюють пігмент (кристали b-каротину) тільки при рості на світлі. По ступеню шорсткості колоній штами варіюють від SR до RS, але можуть бути повністю шорсткуватими (R). Для ідентифікації кристалів каротину рекомендується вивчення колоній під малим збільшенням (30-100), їхня наявність - чітка ознака, що відокремлює М.kansasii (а також M.marinum) від інших видів. У людини викликають туберкульозоподібні ураження легень, найбільш часто спостерігають шийні лімфаденіти (скрофули) і ураження шкіри, рідше, особливо в ослаблених пацієнтів, дисеміновані ураження.

M.marinum. Частіше утворюють S-колонії, відмінна риса - прискорений ріст при температурі 30-33 град. Цельсію і повна його відсутність при 37-40 град. Цельсію. Швидкість росту у різних штамів варіює від 5 до 15 діб. До 30,0 % штамів дають слабо позитивний ніациновий тест. У людини найбільш часто викликає ураження верхніх і нижніх кінцівок.

II група - скотохромогенні мікобактерії: M. scrofulaceum; M.aquae (М.gordonae) - M.aquae I типу - "водопровідні мікобактерії", M.aquae II типу - M.gordonae; M.flavescens. Варіабельні кислотостійкі палички, частіше утворюють S-колонії, плоскі чи з гострою верхівкою, у пігментоутворюючих штамів колонії забарвлені в жовто-жовтогарячі тони, незалежно від культивування на світлі чи в темряві (забарвлення на світлі більш інтенсивне).

M. scrofulaceum. Умовно-патогенні мікобактеріі, що повільно ростуть, через 2 тижні утворюють жовті колонії. Мікроколонії округлі, утворені безладно розташованими паличками (як купка висипаних сірників). Викликають у дітей ураження лімфовузлів і легень. За характером росту і морфологією нагадують сапрофіти M.aquae (М.gordonae) і M.flavescens. Для їхньої диференціальної діагностики звичайно використовують тести стійкості до 5,0 % розчину NaCl, гідролізу твін-80 і відновлення нітратів, а також амідазний тест, що диференціює M.aquae I типу ("водопровідні" мікобактерії) і M.aquae II типу (M.gordonae).

III група - нефотохромогенні мікобактерії: М.avium, M.intracellulare, M.xenopi, M.haemophilum.

Видимий ріст культур виявляється вже через 5 - 10 діб і більше, звичайно утворюють кремові, іноді напівпрозорі, гладенькі S-колонії, що добре емульгуються у воді. При старінні культур колонії деяких штамів можуть набувати жовтогарячого забарвлення (пігментація не залежить від експозиції на світлі). Ніациновий тест негативний.

М.avium. Викликає до 3,0 % захворювань на туберкульоз людини. Морфологічно і культурально аналогічна M.intracellulare і утворює з нею комплекс avium-intracellulare. Морфологічно представлені тонкими, слабо гіллястими паличками, мікроколонії зірчасті, що трансформуються в округлі утворення з безладно розташованими бактеріями. В умовах лабораторії диференціювати М.avium і М.intracellulare важко. Перша добре росте при температурі 45 град. Цельсію, а друга не дає росту протягом 3 тижнів. Від сапрофітних видів їх диференціюють по стійкості до 5,0 % розчину NaCl і нездатності гідролізувати твін-80. Лікування уражень, викликаних комплексом avium-intracellulare, представляє велику проблему, у порівнянні з іншими туберкульозоподібними ураженнями, тому що збудники виявляють множинну хіміорезистентність.

M. xenopi. Молоді культури ростуть у вигляді непігментованих колоній, пізніше з'являється пігмент жовтого кольору. Морфологічно - довгі ниткоподібні палички. Ростуть при 40-45 град. Цельсію, умовно-патогенні для людини.

M.haemophilum. Виявляє унікальну для мікобактерій здатність до росту на 5,0 % кров'яному агарі (також на середовищі Льовенштайна-Єнсена, доповненому 2,0 % цитратом амонійного заліза). Викликає рідкі випадки гнійних лімфаденітів у дорослих осіб з імунодефіцитами та у дітей без імунодефіциту.

IV група - мікобактерії, що швидко ростуть: M.phlei, M.smegmatis, M.malmoense, M.chelonae (M.abscessus), M. fortuitum (M.minetti), M.friedmanii і ін. - сапрофітні види, клінічне значення мають лише два останніх види.

Ростуть у вигляді пігментних або безпігментних колоній, частіше в R-формі. Гарний ріст дають протягом 2-5 днів при 25 град. Цельсію. Найважливіша диференціальна ознака - здатність рости при температурі 45 град. Цельсію і вище та прискорювати свій ріст при температурному оптимумі.

Непігментовані колонії виростають при посіві малих кількостей матеріалу. Пігментоутворення, як відмінна ознака класифікації Раньона, у даної групи мікобактерій непридатне, тому що на утворення пігменту впливає склад середовища, вік культури, повторні пасажі, є природні пігментоутворюючі варіанти.

M. fortuitum (M.minetti). Ріст у субкультурах на яєчному середовищі з'являється на 2-4 добу у вигляді "розетки". Морфологічно - короткі палички. На середовищі Льовенштайна-Єнсена можуть поглинати фарбу й забарвлюватися в зелений колір. Потенційно-патогенні для людини.

3.2 Диференціація мікобактерій

3.2.1 Культуральні тести

Принцип. Для диференціювання M.tuberculosis і M.bovis від інших мікобактерій можна використовувати здатність атипових і сапрофітних мікобактерій до росту на середовищі Льовенштайна-Єнсена з 500,0 мкг/мл саліциловокислого натрію або паранітробензойної кислоти, доданої до середовища в тій же концентрації, а також ріст на середовищі з 10,0 мкг/мл тіоацетазону (тібону). Ці речовини інгібують ріст М.tuberculosis та M.bovis, на відміну від інших мікобактерій, що ростуть добре в їх присутності. Контролем служить середовище без препаратів.

3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм

Інгредієнти.

1. Натрій саліциловокислий.

2. Етиловий спирт 96 %.

2. Середовище Льовенштайна-Єнсена - 100,0 мл (до згортання).

Середовище з саліциловокислим натрієм готують так: наважку 50,0 мг препарату висипають в пробірку, заливають 1,0 мл етилового спирту для дезинфекції, додають 2,0 мл стерильної дистильованої води і виливають в 97,0 мл середовища Льовенштайна-Єнсена (до згортання). Ретельно розмішують. Тепер середовище містить 0,5 мг препарату в 1,0 мл, тобто 500,0 мкг/мл. Розливають у пробірки приблизно по 5,0 мл. Згортають в скошеному вигляді при 85 град. Цельсію протягом 30 хвилин в апараті для згортання сироватки крові.

3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою

Інгредієнти:

1. Паранітробензойна кислота.

2. Етиловий спирт 96 %.

3. Їдкий натр.

4. Соляна кислота.

5. Середовище Льовенштайна-Єнсена - 100,0 мл (до згортання).

50,0 мг паранітробензойної кислоти добре розтирають у ступці

товкачиком, додають 1,0 мл етилового спирту, 4,0 мл дистильованої води і 20-24 краплі 4,0 % NaOH до рН - 8,0 (по індикаторному папірцю). Після цього додають 1-2 краплі 10,0 % HCl до рН - 7,0. Усе це додають до 95,0 мл яєчного середовища, попередньо профільтрованого. Одержують концентрацію паранітробензойної кислоти 500,0 мкг/мл. Розливають у пробірки приблизно по 5,0 мл. Згортають в скошеному вигляді при 85 град. Цельсію протягом 20-30 хвилин в апараті для згортання сироватки крові.

3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)

Принцип. Тіоацетазон (тіосемікарбазон пара-ацетамінобензальдегід), протитуберкульозний препарат. М.tuberculosis та M.bovis чутливі до цього препарату, тоді як інші мікобактерії, за винятком M. kansasii, до нього стійкі.

Інгредієнти.

1. Тіоацетазон (тібон).

2. Етиловий спирт 96 %.

3. Середовище Льовенштайна-Єнсена - 100,0 мл (до згортання).

Готують розчин тіоацетазону, що містить 1000,0 мкг/мл препарату. Для цього до наважки 10,0 мг тібону, висипаної в пробірку, додають 1,0 мл етилового спирту і 9,0 мл стерильної дистильованої води, отримують розведення 1,0 мг/мл (1000,0 мкг/мл). 1,0 мл цього розведення додають до 99,0 мл яєчної маси - одержують концентрацію тібону 10,0 мкг/мл і розливають у пробірки по 5,0 мл. Середовище в пробірках згортають в скошеному вигляді в апараті для згортання сироватки крові при 85 град. Цельсію протягом 30 хвилин.

Всі три описані тести (здатність росту на середовищах із саліциловокислим натрієм та паранітробензойною кислотою, а також тібоном) служать для відрізнення М.tuberculosis та M.bovis від атипових мікобактерій.

Варто згадати ще про один простий тест, що у комплексі з вказаними вище дозволяє диференціювати збудників туберкульозу від атипових мікобактерій - це толерантність деяких видів мікобактерій до NaCl.

3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NaCl

Принцип. Метод грунтується на здатності атипових мікобактерій ІУ групи рости на середовищі з 5 % NaCl. Крім цієї групи, на даному середовищі ростуть тільки M.terrae complex (включає M.triviale, M.terrae, M.nonchromogenicum (III група) і M.flavescens (II група), а також деякі мікобактерії I групи (M.marinum). Всі інші мікобактерії, у тому числі M.tuberculosis і M.bovis, на цьому середовищі не ростуть.

Інгредієнти.

1. Натрій хлористий (хімічно чистий).

2. Сольова основа середовища Льовенштайна-Єнсена.

3. Яєчна суміш середовища Льовенштайна-Єнсена.

До сольової основи середовища Льовенштайна-Єнсена додають хлористий натрій із розрахунку 5,0 г на 100,0 мл сольової основи (5,0 %). Отриманий розчин стерилізують при 121 град. Цельсію 20 хвилин. Далі готують середовище, як указано в рецепті приготування середовища Льовенштайна-Єнсена.

На всі вказані вище середовища засівають по 0,2 мл зависі досліджуваної культури.

3.2.1.5 Виявлення корд-фактора

Крім росту на цих середовищах, використовують здатність мікобактерій по-різному рости на рідких живильних середовищах. Атипові мікобактерій ростуть дифузно у вигляді кучок, на відміну від істинних туберкульозних мікобактерій, що ростуть плівкою, або придонно, мають корд-фактор і ростуть у вигляді "кіс", "джгутів", "вусів" у тісному переплетенні окремих паличок одна з одною. Це може служити диференціальною ознакою. Проте, стійкі до препаратів групи ГІНК мікобактерії туберкульозу цілком або частково втрачають корд-фактор. Тому для диференціації туберкульозних культур від атипових визначення корд-фактору треба використовувати в комплексі з іншими тестами. Для відрізнення M.tuberculosis від інших мікобактерій (М.bovis і атипових мікобактерій) використовують різноманітні біохімічні методи, що у комплексі з біологічним методом дозволяють ідентифікувати культури.

3.2.2 Біохімічні методи дослідження

Для відрізнення M.tuberculosis від інших мікобактерій, а також для розрізнення М.tuberculosis від М.bovis проводять наступні визначення: 1) вміст ніацину, 2) нікотинамідазної активності, 3) нітратредуктазної активності, 4) каталазної і пероксидазної активності.

3.2.2.1 Ніациновий тест

Є одним з основних. Він дає можливість відрізнити M.tuberculosis від інших мікобактерій.

Принцип. Відомо, що M.tuberculosis синтезують нікотинову кислоту (ніацин) у 10 разів більше, ніж M.bovis або атипові. На цій підставі були запропоновані хімічні методи визначення нікотинової кислоти за допомогою ціанистих сполук, з якими нікотинова кислота дає яскраво-жовте забарвлення. Цей тест одержав назву ніацинового.

Порівняльне вивчення різноманітних методів визначення ніацину показало, що найбільш результативним із них є модифікований метод Беніні і Лиюбоа, дещо модифікований і описаний Є.І.Тюрі і М.Є.Тюрі (Лабораторное дело. - 1964. - N 7).

Вказаний метод визначення ніацину вимагає для роботи застосування ціанистого калію, робота з яким повинна проводитися під витяжною шафою і вимагає певних умов, що обмежує широке застосування цього тесту. У зв'язку з цим, особливої уваги заслуговує метод визначення ніацину паперовими смужками, запропонований Кубика і Кильбурн, у модифікації Бараускене (Проблемы туберкулеза. - 1973).

Визначення ніацину паперовими смужками.

Перевага цього методу - у використанні замість ціанистого калію роданистого калію - речовини нелеткої і більш доступної для бактеріологічних лабораторій, а також у швидкості реакції, що дозволяє через 3-4 години дати відповідь про належність культури, що виросла на щільному середовищі, до M.tuberculosis або до інших мікобактерій.

Принцип методу полягає в екстракції ніацину з мікобактерій дистильованою водою і визначення його за допомогою паперових смужок, просочених реактивами.

Приготування реактивів.

1. 20,0 % розчин ПАСК. У пробірку наливають 1,75 мл 95% спирту, 0,25 мл диметилсульфоксиду (димексиду) і додають 400,0 мг ПАСК. Суміш підігрівають на водяній бані при 56 град. Цельсію протягом 5-10 хвилин при періодичному струшуванні до повного розчинення ПАСК.

2. 60,0 % розчин роданистого калію. Наважку 1,5 г роданистого калію розчиняють у пробірці з 2,5 мл 8,0 % розчину лимонної кислоти (200,0 мг лимонної кислоти і 2,5 мл дистильовані води).

3. 50,0 % розчин хлораміну "Б". 3,125 г хлораміну "Б" розчиняють у 6,25 мл дистильованої води на водяній бані при температурі 56 - 60 град. Цельсію при струшуванні. Гарячий розчин капають на смужки.

4. Індикаторні смужки готують із фільтрувального паперу Filtrak 11. Один кінець смужки, розміром 60 x 8 мм, відзначають простим олівцем. Відтягнутими пастерівськими піпетками на папір наносять по одній краплі свіжоприготованих реактивів у наступному порядку: 20,0 % розчин ПАСК - на позначений олівцем кінець, 60,0 % розчин роданистого калію - посередині смужки і 50,0 % розчин хлораміну УБФ - на інший кінець. Між краплями повинні залишатися сухі проміжки. Папірці висушують при кімнатній температурі в темряві протягом 24 годин, після чого зберігають їх у холодильнику в пробірках, закритих гумовими корками. Індикаторні смужки залишаються активними протягом 3-х місяців. Для одержання більш чіткої реакції рекомендується наносити повторно 1 краплю хлораміну "Б" на вже висохлу краплю.

Хід дослідження. Водяний екстракт мікобактерій одержують шляхом додавання в пробірку з культурою 1-1,5 мл дистильованої води і витримування пробірок у горизонтальному положенні, щоб усі колонії добре відмилися водою протягом 2-3 годин у термостаті. Потім 0,6 мл екстракту мікобактерій відсмоктують мірною піпеткою в пробірку.

Індикаторну смужку поміщають кінцем, поміченим олівцем, у пробірку з 0,6 мл досліджуваного екстракту мікобактерій. Пробірку закривають гумовою коркою і погойдують, поки уся смужка не просочиться екстрактом. При позитивному ніациновому тесті через 16-30 хвилин рідина забарвлюється в яскраво-жовтий колір. Дегазація пробірки після проведення реакції здійснюється шляхом додавання 10,0 % розчину нашатирного спирту.

Використання паперових смужок для визначення ніацину дає можливість застосовувати цей тест в усіх практичних лабораторіях.

В даний час існують комерційні набори готових папірцевих смужок для проведення ніацинового тесту, що значно його спрощує і стандартизує.

3.2.2.2 Визначення амідазної активності

Принцип визначення амідазної активності базується на дезамінуванні амідів і виділенні аміаку, що визначається спеціальними реактивами. Існує два методи визначення амідазної активності - кількісний, біохімічний (за Бьоніке), і якісний, бактеріологічний (за Таке).

Метод Бьоніке

Амідний ряд, за Бьоніке, включає 10 амідів, але в лабораторній практиці можна користуватися трьома амідами: сечовина, нікотинамід і піразинамід. За Бьоніке, розчини амідів варто готувати, виходячи з наступних кількостей аміду на 100,0 мл дистильованої води: сечовина - 9,8 мг, нікотинамід - 20,0 мг, піразинамід - 20,0 мг. Хід реакції визначення амідазної активності біохімічним методом приведений на прикладі нікотинамідазної активності.

Визначення нікотинамідазної активності

Принцип. Нікотинамідаза - це одна з ациламідаз. Вона сприяє переходові нікотинаміду в нікотинову кислоту - ніацин. При цьому звільняється аміак, що уловлюється відповідними реактивами. Наявність нікотинамідази, поряд із позитивним ніациновим тестом, свідчить про належність мікобактерій до M.tuberculosis.

Реактиви.

1. Феноловий реактив. Розчинити 25,0 г кристалічного фенолу в 10,0 мл води, додати при помішуванні 54,0 мл 25,0 % розчину NaOH (25,0 г NaOH + 75,0 мл дистильованої води) і довести об'єм до 100,0 мл. Зберігати на холоді в пляшці із темного скла.

2. Розчин гіпохлориту. Розмолоти 25,0 г хлорного вапна, просіяти і розчинити в 300,0 мл дистильованої води, додати при помішуванні 135,0 мл водного розчину вуглекислого калію (20,0 г безводної солі К2СО3 у 100,0 мл дистильованої води, попередньо прокип'яченої для видалення аміаку), старанно розмішати, швидко нагріти до 90 град. Цельсію, остудити і довести до 500,0 мл. Фільтрують невелику частину суміші і випробовують на присутність іонів кальцію. Якщо проба позитивна (розчин каламутніє), то додають ще вуглекислого калію до одержання негативної проби (розчин - прозорий). Профільтрувати суміш і зберігати розчин у холодильнику, у невеликих пляшках із темного скла. Реактив може зберігатися в холодильнику 1-2 місяці.

3. Водний розчин нікотинаміду - 200,0 мкг/мл. Для цього 20,0 мг нікотинаміду розчиняють у 100,0 мл дистильованої води.

4. 1/15 М фосфатний буфер, рН-7, 2.

5. 0,07 % MnSO4.

Хід дослідження. До 0,5 мл густої бактеріальної зависі (20,0 мг/мл змішують за допомогою струшувача типу ВОРТЕКС у 0,5 мл 1/15 М фосфатного буфера, рН-7,2), додають 0,5 мл розчину нікотинаміду. Суміш витримують у термостаті 15-16 годин. Потім визначають аміак по Расселу. Для цього до суміші додають 0,2 мл 0,07 % MnSO4, 2,0 мл фенолового реактиву в 1 мл гіпохлориту. Пробірки поміщають у водяну баню при 100 град. Цельсію на 15-20 хвилин. Поява синьо-зеленого забарвлення свідчить про наявність у середовищі аміаку, отже, про належність культури до M.tuberculosis. Контролем є пробірка з 0,5 мл нікотинаміду і 0,5 мл буферу, яку також поміщають у термостат. У контрольній пробірці реакція на аміак повинна бути негативною. У випадку появи блідо-блакитного забарвлення воно враховується при оцінці результатів у дослідній пробірці.

Метод Таке

Іншим способом визначення амідазної активності є бактеріологічний якісний тест Таке.

Принцип методу полягає в появі специфічного іржавого забарвлення при додаванні реактиву Несслера до зрілих культур МБТ, які виросли на агаровому середовищі, яке містить аміди, що і є свідченням про достатнє утворення ацетиламідази мікобактеріями в процесі їх росту.

Реактиви

1. Нікотинамід.

2. Піразинамід.

3. Сечовина.

4. Реактив Несслера.

5. Агарове середовище: пептон, натрій хлористий, глюкоза, калій фосфорнокислий однозаміщений (KH2PO4), гліцерин.

Хід дослідження. Приготування агарового середовища: 1,0 г пептону, 20,0 г агар-агару або агару Діфко, 5,0 г NaCl, 0,1 г глюкози, 2,0 г KH2PO4, 10,0 мл гліцерину розчиняють у дистильованій воді при нагріванні, доводячи кінцевий об'єм до 1,0 літра, рН - 6,9. Гаряче середовище розливають по пробірках і автоклавують при 120 град. Цельсію 30 хвилин. Після стерилізації агар у пробірках скошують. Готують розчини амідів у дистильованій воді: сечовина - 40,0 мг/мл, нікотинамід - 30,0 мг/мл, піразинамід - 20,0 мг/мл.

Розчини нікотинаміду і піразинаміду стерилізують у водяній бані при 100 град. Цельсію протягом 30 хвилин. Розчин сечовини фільтрують через бактеріальний фільтр (Зейця). Стерильний розчин амідів вносять по 0,25 мл у пробірки з живильним середовищем і лишають останні в горизонтальному становищі 2-3 доби, так, щоб розчин всмоктався в поверхню живильного середовища. (За підрахунками, кількість сечовини, нікотинаміду і піразинаміду на 1,0 кв. см поверхні середовища складає відповідно - 1000, 750 і 500 мкг/кв. см).

У пробірки з амідами засівають 0,2 мл густої зависі культури випробовуваних мікобактерій (1,0 мг/мл). Посіви інкубують при 37 град. Цельсію. Як тільки з'явиться ріст (через 2-3 тижні) додають 0,5 мл реактиву Несслера. Поява іржавого забарвлення свідчить про позитивну реакцію (про наявність у бактерій відповідної амідази). Контролем є посіви в пробірках без амідів.

Різні види мікобактерій відрізняються по ферментативній активності стосовно різних амідів. Ці розходження подані в табл. 3.2.

Позначення: + реакція позитивна, - реакція негативна,

+/- реакція може бути позитивною або негативною

Для штамів кислотостійких сапрофітів, що швидко ростуть (IV група), характерною є наявність формамідазної активності. Цей фермент відсутній у M.tuberculosis й у більшості атипових мікобактерій, які класифіковані за Раньоном.

Принцип реакції полягає в здатності формамідази розщеплювати формамід з утворенням аміаку, виділення якого уловлюється в реакції з фенолом і гіпохлоритом.

Хід дослідження (модифікована методика Дихно) аналогічний реакції на нікотинамідазу. Використовується 0,2 мл формаміду на 250,0 мл дистильованої води. Для проведення реакції необхідно мати інгредієнти високої якості.

3.2.2.3 Визначення нітратредуктазної активності

При диференціюванні мікобактерій туберкульозу користуються також реакцією відновлення нітратів у нітрити. Реакція відновлення нітратів дає можливість диференціювати M.tuberculosis, які мають нітратредуктазу, від M.bovis, M.avium і від деяких атипових, у яких цей фермент відсутній. Виняток складають фотохромогенні мікобактерії (М. kansasii) і деякі з III і IV груп.

Принцип. Активність нітратредуктази визначається по кількості відновленого з нітрату нітриту, що дає кольорову реакцію з пара-диметиламінобензальдегідом.

Реактиви.

1. 0,067 М фосфатний буфер (рН-7, 1), що містить 0,1 % нітрату натрію.

2. 2,0 % розчин (вага/об'єм) пара-диметиламінобензальдегіду в 10,0 % HCl.

3. 10,0 % розчин соляної кислоти.

Для реакції використовують 3-4-тижневі культури, вирощені на яєчному середовищі.

Хід дослідження. 50,0 мг вологої ваги 3 - 4-тижневої культури суспендують в 5,0 мл (можна суспендувати 10,0 мг культури в 1,0 мл) 0,067 М фосфатного буферу (рН - 7,1), що містить 0,1 % нітрату натрію, і інкубують при 37 град. Цельсію 15 - 16 годин. Утворення нітриту перевіряється додаванням 2 крапель 2,0 % розчину пара-диметиламінобензальдегіду в 10,0 % HCl + 1,0 мл 10,0 % HCl. Поява жовтого забарвлення свідчить про належність культури до M.tuberculosis (метод Тсукамура).

Крім активності вказаних ферментів для відрізнення M.tuberculosis від інших кислотостійких мікобактерій можна використовувати різну активність окисно-відновних ферментів.

3.2.2.4 Диференціація мікобактерій за окисно-відновними ферментами

У окисно-відновних процесах мікробної клітини активну участь приймають такі ферменти, як каталаза і пероксидаза. У M.tuberculosis і M.bovis, чутливих до препаратів групи ГІНК (гідразиду ізонікотинової кислоти), виявляється активність обох ферментів паралельно. При цьому у чутливих культур спостерігається швидке активне виділення пухирців кисню, обумовлене діяльністю каталази, і забарвлення колоній у темно-коричневий колір, обумовлене діяльністю пероксидази. Поява коричневого пігменту пояснюється переходом пірогалолу в пурпурогалин в присутності перекису водню під впливом пероксидази. У культур M.tuberculosis, стійких до препаратів групи ГІНК, активність цих ферментів різко знижена, при визначенні каталазної активності пухирці кисню виділяються в невеликій кількості, повільно або майже відсутні, а при визначенні активності пероксидази колонії або ледь забарвлюються, або (при високому ступені стійкості до ізоніазиду) залишаються безбарвними. На відміну від M.tuberculosis, у атипових мікобактерій, незалежно від стійкості до ГІНК, каталазна активність завжди різко позитивна, пероксидазна ж, як правило, не виявляється.

Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно (модифікована методика Богена)

Принцип каталазної реакції полягає в розщепленні перекису водню ферментом каталазою на воду й атомарний кисень, що супроводжується виділенням пухирців кисню і переходом пірогалолу в пурпурогалин в присутності перекису водню під впливом пероксидази.

Реактиви.

1. 0,5 % пірогалол: 50,0 мг чистого пірогалолу розчинити в 10,0 мл дистильованої води.

2. 2,0 % пергідроль. 0,2 мл пергідролю розвести в 10,0 мл дистильованої води.

Обидва розчини готують безпосередньо перед дослідом, змішують і наливають у пробірку так, щоб покрити культуру.

Хід дослідження. Обидва розчини зливають у колбу в рівній кількості і наливають по 6,0 - 8,0 мл суміші у пробірку з культурою. В залежності від кількості культур, що перевіряють, об'єм розчинів, які готуються, відповідно збільшують.

Облік реакції активності каталази проводять через 5 хвилин по активному виділенню пухирців кисню. Реакцію на пероксидазу враховують через 1,5-2 години по забарвленню колоній у темно-коричневий колір.

Ступінь активності каталази позначають по 3-бальній системі:

- +++ рясне виділення пухирців кисню в 1-шу хвилину;

- ++ помірне виділення пухирців кисню;

- + поодинокі пухирці.

При відсутності пухирців реакція вважається негативною (-).

Активність пероксидази оцінюється також по 3-бальній системі:

- +++ темно-коричневе забарвлення колоній;

- ++ коричневе забарвлення колоній;

- + блідо-коричневе забарвлення колоній.

При негативній реакції колір колоній не змінюється.

Цінною реакцією для відрізнення M.tuberculosis від атипових мікобактерій є проба на термостабільність каталази.

Термостабільність каталази

Каталаза у кислотостійких мікобактерій різна. У вірулентних мікобактерій вона швидко і легко руйнується при нагріванні до 65 - 68 град. Цельсію. У атипових мікобактерій і кислотостійких сапрофітів вона термостабільна.

Визначення активності термостабільної каталази

Готують 3,0 мл густої зависі мікобактерій. 1,5 мл зависі переносять у центрифужну пробірку, яку нагрівають на водяній бані при 68 град. Цельсію протягом 10 хвилин. Потім пробірку охолоджують і на предметне скло наносять по 1 краплі зависі: на один кінець - непрогріту (служить контролем), на другу - завись після нагрівання. До цих двох зависів додають по 1 краплі пергідролю. Утворення пухирців свідчить про активність ферменту, відсутність - про пригнічення. На підставі цієї реакції легко відрізнити M.tuberculosis, у яких каталаза завжди термолабільна, від більшості атипових і кислотостійких сапрофітів із різко термостабільною каталазою.

Термостабільність каталази, так само як і її активність, враховується по 3-бальній системі.

Співвідношення окисно-відновних ферментів у різних видів мікобактерій показане в табл.3.3.

3.2.2.5 Реакція гідролізу твіну-80

Важливою реакцією для ідентифікації мікобактерій всередині II і III груп (за Раньоном), є реакція гідролізу твіну-80. Твін-80 зв'язує нейтральний червоний, і суміш до реакції має солом'яно-жовтий колір. Принцип реакції - у ензимному гідролізі твіну-80. При цьому відбувається звільнення нейтрального червоного і забарвлення відновлюється від рожевого до червоного. Позитивна реакція відзначається у M.aquae (на відміну від M.scrofulaceum, у яких реакція негативна), а з III-ї групи вона позитивна тільки у M.terrae.

Реактиви.

1. 1/15 М фосфатний буфер (рН - 7) - 100,0 мл.

2. Твін - 80 - 0,5 мл.

3. Основний нейтральний червоний, 0,1 % - 2,0 мл. Краще розчинити 0,1 г нейтрального не в 100,0, а в 85,0 мл дистильованої води.

Змішати усі три реагенти. Розлити по 4,0 мл у пробірки й автоклавувати при 120 град. Цельсію 15 хвилин. Протягом доби перевіряють на стерильність у термостаті і зберігають у холодильнику. Стабільність розчину - не більше 2-х тижнів.

Хід дослідження. Емульгують 3 бактеріологічні лопатки культури в пробірках із приготованим субстратом (твін-80 із нейтральним червоним). Пробірки поміщають у термостат. Реакцію перевіряють через 4 години, на 5-у і 10-у добу. Тест вважається позитивним, якщо рожево-червоне забарвлення з'явилося до 10-ої доби, негативним, якщо забарвлення не з'явилося (модифікована методика Вайна). Контролем є пробірка з середовищем без реактивів.

3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій

При описанні біохімічних тестів ми зупинилися на найбільш простих пробах, що дають можливість відрізнити M.tuberculosis від атипових і розрізняти деякі види атипових мікобактерій всередині груп Раньона. При диференціації мікобактерій варто пам'ятати, що, крім використання комплексу тестів, застосованих при вивченні атипових культур, необхідно користуватися обов'язковими для кожного виду тестами (так звані ключові тести), проведення яких полегшує ідентифікацію культур. Наводимо ключові тести для окремих видів мікобактерій (табл.3.4).

Крім перерахованих тестів, для всіх безпігментних культур необхідно визначати ніацинову пробу, і якщо вона негативна, перевіряти амідазну активність. Використання описаних тестів дає можливість розділити атипові культури на патогенні для людини і випадкові супутні сапрофіти, які не впливають на захворювання.

Для клініки особливе значення мають наступні види атипових мікобактерій:

M.kansasii, M.marinum, M.scrofulaceum , M.xenopi,

M.avium, M.intracellularae, M.fortuitum

Для атипових мікобактерій, крім вказаних нами особливостей (швидкості росту, пігментоутворення, морфології колоній і паличок, температурного оптимуму) характерними являються: негативна ніацинова проба, відсутність пероксидазної активності при високій активності каталази, виражена термостабільність каталази у більшості мікобактерій, ріст на живильних середовищах із паранітробензойною кислотою і саліциловокислим натрієм, відсутність в більшості випадків корд-фактору. Характерним також для атипових мікобактерій є первинна стійкість до більшості антимікобактеріальних препаратів.

Для відрізнення М.tuberculosis і М.bovis від нетуберкульозних мікобактерій, відмінності їх один від одного, а також для розрізнення атипових мікобактерій всередині груп зручно користуватися розміщеними нижче схемами.