У відповідності до вимог статей 9 та 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення" та з метою науково-методичного забезпечення діяльності державної санітарно-епідеміологічної служби з питань застосування дезінфікуючих засобів, зокрема в осередках вірусних інфекцій для їх профілактики,

1. Затвердити тимчасові методичні рекомендації "Визначення віруліцидної активності дезінфекційних препаратів" (додаються).

2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров'я України тимчасові методичні рекомендації "Визначення віруліцидної активності дезінфекційних препаратів" довести до установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби України, міністерств, інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку.

3. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Пономаренка А.М.

У сучасний період у зв'язку з надходженням в Україну численних дезінфікуючих засобів з різних країн світу назріла нагальна необхідність у виданні методичних рекомендацій, призначених для забезпечення стандартизованого підходу до вивчення нових дезінфектантів та дослідження на сучасному рівні їх віруліцидних властивостей.

Методичні рекомендації по визначенню віруліцидної активності дезінфекційних препаратів в Україні підготовлені вперше. В їх основу було покладено методики, що використовувалися в колишньому Радянському Союзі (1, 2) та видані Міністерством охорони здоров'я республіки Бєларусь (3) з урахуванням власних модифікацій та сучасних підходів. Вони призначені для вірусологічних лабораторій, які займаються дослідженням віруліцидних властивостей препаратів, що використовуються для дезінфекції в осередках вірусних інфекцій для їх профілактики (у лікувальних закладах, лабораторіях відповідного профілю тощо).

Пошук дезінфікуючих засобів щодо вірусів, які викликають гострі, і, особливо, хронічні інфекції, є актуальною й достатньо складною проблемою. Зазначене обумовлене пріоритетним значенням вірусів в етіологічній структурі інфекційних захворювань. Понад 200 вірусів можуть спричинювати порушення з боку респіраторного тракту. Такі з них, як віруси грипу, парагрипу, респіраторно-синцитіальні, адено-, риновіруси здатні щорічно викликати

- Вірус грипу, типу A - представник слаборезистентної РНК-вмісної групи вірусів;

- Поліовірус типу 2, вакцинний штам - високорезистентний представник РНК-вмісної групи вірусів;

- Аденовірус типу 2, або вірус інфекційного гепатиту собак - високорезистентні представники ДНК-вмісної групи вірусів.

Серед методів визначення віруліцидної активності дезінфекційних засобів найбільш поширені суспензійне дослідження та різні модифікації методу тест-об'єктів. Суспензійний метод дозволяє забезпечити контакт досліджуваного дезінфектанта з концентрованим вірусовмісним матеріалом, у той час, як створення високого вірусного навантаження на тест-об'єктах є достатньо проблематичним. Перевага суспензійного методу полягає у можливості моделювання дезінфекції біологічних рідин (варіант з білковим навантаженням) та відносна безпека його виконання для персоналу, але інколи його використання неможливо у зв'язку з відсутністю прийнятних способів припинення дії дезінфектанта при завершенні експозиції з вірусовмісною рідиною. Метод тест-об'єктів дозволяє уникнути вказаних недоліків та краще змоделювати ситуацію з використанням реальних предметів, що дозволяє безпосередньо вивчати ефективність дезінфекції.

Тому нижче наводиться опис техніки виконання суспензійного методу та методу тест-об'єктів.

1.1. Культивування вірусів

Поліовірус типу 2 (вакцинний штам), аденовірус типу 2 та вірус інфекційного гепатиту собак культивують на культурі клітин HEp-2 (епідермоїдної аденокарциноми гортані людини) та Vero (перещеплювальна культура клітин нирок зелених мавп) (4). Як ростові середовища використовують поживні середовища 199 та Ігла MEM з додаванням 5-7% ембріональної сироватки великої рогатої худоби. Як підтримуюче середовище використовують середовище 199 та Ігла MEM з додаванням 2% ембріональної сироватки великої рогатої худоби. Віруси грипу культивують на перещеплювальній культурі клітин MDCK (перещеплювальна культура клітин нирок собак).

На 2-7-му добу відбувається максимальне накопичення вірусу, що супроводжується їх цитопатичною дією. Для підвищення титру вірусів виконують декілька пасажів.

1.2. Приготування вірусовмісної рідини

1.3. Приготування розчинів дезінфектантів

Дослідний препарат розводять на дистильованій воді. При розведенні необхідно враховувати, що дослідна концентрація дезінфектанта повинна міститися у суміші дезінфектанта з вірусовмісною рідиною.

1.4. Виконання суспензійного методу

Одну частку вірусовмісної рідини змішують з однією часткою дистильованої води. Потім додають 8 часток розчиненого дезінфектанта у концентраціях в 1,25 разів більшу за кінцеву (дослідну) концентрацію. Витримують необхідну експозицію. Ефективність дезінфектанта досліджують без білкового навантаження та при його наявності. Концентрації дезінфектанта та тривалість експозиції його в суміші з вірусовмісною рідиною повинні бути підібрані так, щоб результати досліду показували віруліцидний ефект дезінфектанта в залежності від концентрації та часу впливу. Після завершення експозиції до суміші вірус - дезінфектант додають рівну кількість розчину нейтралізатора на 5 хв. Після завершення заданих експозицій готують послідовні 10-кратні розведення суміші вірусовмісної рідини і дезінфектанта та інфікують пробірки з моношаром клітинної культури.

1.5. Визначення інфекційних ознак наявності вірусів

Після завершення експозиції готують 10-кратні розведення суміші вірусовмісної рідини та дезінфекційного засобу охолодженим культуральним середовищем, яким інфікують по 4 пробірки з моношаром клітинної культури.

1.5.1. Титрування мікрометодом

1.6. Вірус імунодефіциту людини, вірус гепатиту B

У паспортних даних сучасних дезінфекційних засобів містяться дані про їх віруліцидну дію на віруси імунодефіциту людини та гепатиту B. Методи дослідження цієї дії відрізняються від наведених вище.

1.6.1. Вірус імунодефіциту людини

Клітини МТ-4 культивують на мікротитрувальних панелях з плоскодонними лунками. Використовують середовище RPMI-1640, яке вміщує 10% ембріональної телячої сироватки, 0,03% L-глутаміну, 0,01M HEPES, 50 мкг/мл гентаміцину. Розведення суміші вірусу та дезінфекційного засобу додають до клітинної культури. Про ефективність дії дезінфекційного засобу судять по наявності цитопатичної дії вірусу (утворення синцитіїв), кількості живих та мертвих клітин та накопиченню позаклітинного антигену у культуральній рідині у пробах без дезінфектанта та оброблених ним. В останньому випадку використовують комерційну тест-систему для виявлення білка p24.

1.6.2. Вірус гепатиту B

Маркерами вірусу гепатиту B, який не вдалося культивувати до теперішнього часу, при вивченні віруліцидних властивостей дезінфекційних засобів, є антигени та геноми вірусу. Антигенну активність дослідних та контрольних проб оцінюють за допомогою стандартних комерційних імуноферментних тест-систем для виявлення HBs-, та HBe-антигенів вірусу гепатиту B у відповідності з інструкціями щодо їх застосування. ДНК вірусу визначають методом молекулярної гібридизації. Про ефективність дезінфекційного засобу судять по втраті або зниженні вмісту антигенів або ДНК вірусу.

1.7. Контролі

Кожний дослід супроводжують наступними контролями:

1. Контроль клітинної культури - залишають незараженими по 4 пробірки з клітинним моношаром протягом всього терміну спостереження;

2. Контроль вірусу;

3. Контроль вірусу у суміші з білковим навантаженням;

4. Контроль токсичності суміші дезінфектанта з нейтралізатором;

5. Контроль повноти нейтралізації дезінфектанта;

6. Контроль дезінфікуючої дії (референс-дезінфектант): паралельно до основного досліду виконують дослідження формальдегіду при pH 7,0 без сироватки. Концентрація останнього повинна бути 0,7 г/100 мл. Для виконання цього контролю одну частину вірусовмісної рідини змішують з 4 частками розчину Хенкса і 5 частками 1,4% розчину формальдегіду.

2.1. Підготовка батистових тест-об'єктів

Вірусовмісну рідину для контамінації тест-об'єктів готують як вказано у п. 1.2. Тест-об'єкти - це шматочки батисту розміром (1 х 0,5 см), попередньо звільненого від крохмалю. Батистові тест-об'єкти кладуть у стерильну чашку Петрі і заливають вірусовмісною рідиною з розрахунку 0,05-0,1 мл рідини на тест-об'єкт. Всі тест-об'єкти добре змочуються. Через 20 хв. тест-об'єкти висушують стерильним фільтрувальним папером, а потім підсушують у термостаті при 37 град. C або в ексикаторі з хлористим кальцієм протягом 30 хв. Готові тест-об'єкти повинні бути використані в день приготування, щоб запобігти падінню титру вірусу. Кількість вірусу на тест-об'єктах повинна бути максимально можливою, що важливо для компенсування його втрати при наступній обробці тест-об'єктів.

2.2. Виконання методу

При визначенні віруліцидних властивостей препарату готують 3-5 концентрацій розчину на дистильованій чи дехлорованій водопровідній воді з розрахунку 1,0 мл розчину на кожний тест-об'єкт (робочі розчини).

У робочі розчини занурюють інфіковані тест-об'єкти з розрахунку 5 штук на кожну експозицію. Легким погойдуванням колби з розчином досягають повного змочування всіх тест-об'єктів. Змочування тест-об'єктів вважають початком досліду. З цього моменту відраховують час експозиції. Колбу залишають при кімнатній температурі (18-20 град. C).

Після закінчення визначених експозицій стерильним охолодженим пінцетом чи петлею витягають по 5 тест-об'єктів, занурюють їх у пробірку з 5 мл стерильного розчину нейтралізатора на 5 хв. (для галоїдовміщуючих препаратів, перекисних сполук як нейтралізатор використовують 0,5-1,0% розчин гіпосульфіту натрію; для альдегідів - 0,5-1,0% розчин аміаку чи бісульфіту натрію; для кислот - 0,5% розчин їдкого натрію чи калію, або 0,5% розчин бікарбонату натрію; для лугів - 0,5-1,0% розчин оцтової кислоти; для четвертично-амонієвих сполук, амфолітів - 0,2% розчин сульфанолу в 10% розчині молока; для препаратів з невідомим нейтралізатором, а також для препаратів, що добре розчиняються у воді (фенольного ряду)), використовують дворазове промивання у воді.

Після цього стерильною петлею тести переносять у пробірку зі скляними кульками та 5 мл стерильного фізіологічного розчину. У цій пробірці струшують тест-об'єкти протягом 10 хв., потім у 4 пробірки (на кожне дослідження) з моношаром клітинних культур додають 1 мл підтримуючого середовища, 0,2 мл рідини, відмитої з тестів, вміщують у термостат, де витримують при температурі 36,5 град. C протягом періоду спостереження.

Облік результатів проводять протягом терміну спостереження, переглядаючи пробірки під мікроскопом. Якщо в клітинних культурах не відбувається типової цитопатичної дегенерації, то додатково роблять 2 пасажі. При відсутності специфічної зміни в клітинних культурах тест-віруси вважають інактивованими, дослід повторюють з меншими концентраціями препарату й експозиціями; при наявності цитопатогенної дії дослід повторюють з більшими експозиціями й концентраціями препарату.

Кожний дослід супроводжують наступними контролями:

1) контроль зараженості тест-об'єктів - 5 штук заражених тест-об'єктів занурюють у пробірку зі скляними кульками та 5 мл фізіологічного розчину. Відбивають протягом 10 хв. Відповідною дозою рідини, відмитої з тест-об'єктів, заражають 4 пробірки з моношаром клітинних культур. Для з'ясування вірусного навантаження при контамінації тест-об'єктів проводять титрування.

2) Контроль збереження життєздатності вірусу - 5 штук заражених тест-об'єктів занурюють у пробірку з розчином Хенкса, витримують максимальну експозицію, після чого переносять на 5 хв. у 5 мл нейтралізатора, а потім у 5 мл фізіологічного розчину, де струшують зі скляними кульками і заражають відповідною дозою рідини, відмитої з тестів, 4 пробірки з моношаром клітинних культур. Для з'ясування кількості збереженого вірусу проводять титрування.

3) Контроль повноти нейтралізації дезінфектанта - 5 штук незаражених тест-об'єктів занурюють на максимальну експозицію в 5 мл розчину дезінфектанта максимальної концентрації, після чого переносять тест-об'єкти на 5 хв. у 5 мл розчину нейтралізатора, потім - у 5 мл фізіологічного розчину. Відбивають зі скляними кульками протягом 10 хв. Вносять відповідну кількість рідини в 4 пробірки з моношаром клітинних культур. Висновок про повноту нейтралізації дезінфектанта роблять на підставі відсутності токсичної дії на культуру клітин протягом всього періоду досліду.

4) Для контролю клітинних культур - залишають незараженими по 4 пробірки з моношаром клітинних культур і спостерігають максимальний термін досліду. Через 24 години як у дослідних, так і в контрольних пробірках змінюють підтримуюче середовище. Упродовж спостереження підтримуюче середовище змінюють у залежності від зміни pH.

5) Контроль дезінфікуючої дії (референс-дезінфектант): паралельно основному досліду виконують дослідження формальдегіду при pH 7,0 без сироватки. Концентрація останнього повинна бути 0,7 г/100 мл. Для виконання цього контролю одну частину вірусовмісної рідини змішують з 4 частками розчину Хенкса 5 частками 1,4% розчину формальдегіду.

Після встановлення наявності віруліцидних властивостей у дезінфікуючого засобу вивчають залежність ефективності від концентрації діючої речовини, часу впливу, температури, реакції середовища. Кожен дослід повторюють не менше 3 разів.

Вплив температури на активність дезінфікуючого засобу вивчають при знезаражуванні інфікованих батистових тест-об'єктів, з використанням водяної бані.

При вивченні впливу pH середовища на активність препарату готують ряд розведень з різними значеннями pH шляхом підкислення децинормальним розчином оцтової чи іншої кислоти, чи підлужуванням децинормальним розчином лугу. Порядок проведення дослідів такий же, як з інфікованими тест-об'єктами (описано вище).