Відповідно до вимог статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення" та з метою науково-методичного забезпечення діяльності державної санітарно-епідеміологічної служби з питань застосування дезінфікуючих засобів, зокрема в осередках вірусних інфекцій для їх профілактики,

1. Затвердити методичні рекомендації "Визначення віруліцидної дії дезінфікуючих засобів" (додаються).

2. Департаменту організації санітарно-епідеміологічного нагляду МОЗ довести методичні рекомендації "Визначення віруліцидної дії дезінфікуючих засобів" до установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби України, міністерств, інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку.

3. Визнати наказ МОЗ від 26.05.2006 N 333 "Про затвердження тимчасових методичних рекомендацій "Визначення віруліцидної активності дезінфекційних препаратів" таким, що втратив чинність.

Контроль за виконанням цього наказу залишаю за собою.

Визначення віруліцидної дії дезінфікуючих засобів є основною вимогою для їх успішного і коректного практичного застосування у відповідності до призначення.

В залежності від кінцевої мети їх застосування дезінфікуючі засоби можна розподілити на три категорії:

- засоби для заключної дезінфекції медичних інструментів, коли не можливо провести їх остаточну стерилізацію сухим жаром або автоклавуванням. У цьому випадку слід застосовувати тільки дезінфектанти з віруліцидною дією;

- засоби для дезінфекції шкіри рук, коли віруліцидна дія дезінфектанту повинна узгоджуватися з його нешкідливістю для людини при місцевому застосуванні. Так як у більшості випадків на першому місці перебуває захист від вірусів, що мають оболонку, не стійких до дії зовнішніх чинників, або таких, що передаються з кров'ю і біологічними рідинами, більш доцільним є застосування засобів з "обмеженою віруліцидною дією";

- засоби для дезінфекції поверхонь. У більшості випадків вони застосовуються тоді, коли збудник відомий. При цьому, з метою повсякденної дезінфекції, може бути вибраний найбільш прийнятний засіб з урахуванням спектру його дії.

На сьогодні, у зв'язку з надходженням в Україну численних дезінфікуючих засобів з різних країн світу, виникає необхідність у виданні Методичних рекомендацій, призначених для забезпечення стандартизованого підходу до їх тестування та дослідження на сучасному рівні їх віруліцидних властивостей, тобто впливу на віруси, що знаходяться поза клітинами, на об'єктах довкілля.

Методи дослідження віруліцидної активності дезінфікуючих засобів, у значній мірі, залежать від властивостей та області застосування досліджуваних препаратів. При знезараженні різних об'єктів (вироби медичного призначення, посуд, білизна, поверхні предметів, біоматеріал) розробляють найбільш ефективні режими дезінфекції в залежності від концентрації діючої речовини та часу обробки.

Методичні рекомендації по визначенню віруліцидної активності дезінфекційних і миючих засобів в Україні підготовлені вперше. В їх основу покладено методичні матеріали, що використовувалися з аналогічною метою в колишньому Радянському Союзі [1, 2] та методичні рекомендації, видані Міністерством охорони здоров'я республіки Бєларусь [3]. У запропонованих нами методичних рекомендаціях враховано також власний набутий досвід та сучасні підходи до проведення таких досліджень провідними виробниками дезінфекційних засобів європейських країн.

Методичні рекомендації призначені для вірусологічних лабораторій, які проводять тестування віруліцидних властивостей дезінфекційних засобів, що використовуються для дезінфекції, обробки та миття предметів і поверхонь в осередках вірусних інфекцій, у лікувальних і дитячих закладах, у лабораторіях відповідного профілю, а також у закладах громадського харчування та в побуті.

Згідно з Європейським законодавством для характеристики дезінфікуючих засобів рекомендують застосовувати поняття "обмежено віруліцидний" та "віруліцидний", відповідно до їх активності по відношенню до складних і простих вірусів [8]. Це доцільно, оскільки "віруліцидної дії" досягти значно важче, ніж "обмежено віруліцидної", і це потрібно не у всіх випадках. Застосування таких широко вживаних визначень як "інактивуючий віруси", "діючий на", "активний по відношенню до", які зустрічаються при характеристиці дезінфектантів, сьогодні вважаються застарілими і не прийнятними.

Дослідження віруліцидних властивостей дезінфікуючих засобів повинно проводитись у сертифікованих лабораторіях, які мають дозвіл на роботу з вірусами визначеної групи патогенності.

Визначення віруліцидної активності дезінфікуючих засобів здійснюється з обов'язковим використанням моделей простих і складних вірусів. Прості віруси (поліовіруси, віруси Коксакі A, B, ECHO, віруси гепатиту A, адено-, ротавіруси тощо) не мають суперкапсидної оболонки, тому вони надзвичайно стійкі до дії зовнішніх чинників фізичної та хімічної природи, у тому числі і до кислот, лугів, більшості детергентів, четвертинних амонієвих солей, дезінфекційних засобів.

Складні віруси (віруси грипу, парагрипу, кору, краснухи, герпесу, ВІЛ тощо) мають багату на ліпіди суперкапсидну оболонку, тому вони швидко інактивуються під впливом різноманітних фізико-хімічних факторів, органічних розчинників, дезінфікуючих засобів.

При великій кількості відомих збудників вірусних інфекцій (див. додаток 1), а також у зв'язку з методичними обмеженнями (неможливість адаптації багатьох вірусів до умов культивування in vitro або їх велику небезпеку для дослідника) не доцільно проводити прямі випробування ефективності дезінфікуючих засобів при їх дії на віруси всіх родин. Так, дослідження віруліцидної дії дезінфектантів по відношенню до ВІЛ передбачає проведення випробувань при культивуванні інфекційне активного вірусу в клітинних системах. Однак у зв'язку з небезпекою ВІЛ (другий ступінь захисту) проведення прямих випробувань можливо тільки у лабораторіях з особливим режимом роботи. Незаперечним є те, що у світі не існує клітинної системи для культивування вірусу гепатиту B, і тому немає прямих методів випробування його інфекційної активності і відповідно валідованої системи для визначення віруліцидної дії дезінфектантів по відношенню до цього вірусу. Тому, аналогічно з дослідженням бактерицидності, для прийняття аргументованих рішень про ефективність віруліцидної активності дезінфікуючих засобів необхідно відбирати репрезентативні тест віруси з характерними властивостями.

Модельні віруси або тест-віруси повинні відповідати наступним вимогам:

бути адаптованими до культивування в культурі клітин в умовах вірусологічної лабораторії;

викликати характерну тканинну ЦПД у культурі клітин;

мати високий інфекційний титр при культивуванні в чутливій культурі;

бути відносно безпечними для персоналу лабораторії. Тому, як тест-віруси використовують:

Вірус грипу типу A - складний РНК-геномний вірус, представник родини ортоміксовірусів, відносно чутливий до дії зовнішніх чинників.

Поліовірус типу 1, вакцинний штам LSc2ab - РНК-геномний вірус, представник родини пікорнавірусів, високорезистентний вірус, інактивація якого гарантує аналогічний ефект по відношенню до збудників вірусних гепатитів, ротавірусних гастроентеритів, до вірусів ECHO, Коксакі та інших вірусних патогенів [9];

Аденовірус типу 2, - простий ДНК-геномний вірус, представник родини аденовірусів, стійкий до дії зовнішніх чинників;

Ротавірус мавп штам SA-11 - простий РНК-геномний вірус, представник родини реовірусів, роду Ротавірус, дуже стійкий до дії зовнішніх чинників.

З метою стандартизації досліджень віруліцидної дії дезінфекційних засобів повинні використовуватись живильні середовища, сироватки, сольові розчини, які одержують від виробника (постачальника) з сертифікатом відповідності та вказаним терміном придатності. Використання не сертифікованих середовищ, сироваток і сольових розчинів, а також зазначених препаратів після закінчення терміну їх придатності при проведенні випробувань не дозволяється.

Чутливі до тест-вірусів перещеплювальні культури клітин (клітинні лінії) одержують із Банку клітинних культур або спеціалізованих лабораторій з відповідним паспортом, в якому вказані її основні характеристики і умови культивування. У лабораторії проводять поточне пасажування одержаних клітинних ліній стандартним методом. Клітинні лінії використовують для культивування тест-вірусів і проведення випробувань дезінфекційних засобів. Допускається використання клітинних культур, які пройшли до 15 пасажувань. Вважається, що після 15 пасажу підвищується ймовірність мутацій клітин, що впливає на їх чутливість до відповідних вірусів, та їх контамінації вірусами, мікроорганізмами, мікоплазмою, клітинами інших ліній.

При проведенні випробувань використовують такі клітинні лінії:

MDCK - перещеплювальна культура клітин нирки собаки, чутлива до тест-вірусу грипу типу A;

RD - перещеплювальна культура клітин рабдоміосаркоми людини, чутлива до тест-вірусу поліомієліту типу 1;

HEp-2 штам Cincinnati - перещеплювальна культура клітин аденокорциноми гортані людини, чутлива до поліовірусу типу 1, ротавірусу, аденовірусу типу 2;

Vero - перещеплювальна культура клітин нирки африканської зеленої мавпи, чутлива до поліовірусу типу 1, ротавірусу, аденовірусу типу 2.

5.1. Культивування та визначення інфекційного титру вірусу грипу A поліовірусу типу 1, аденовірусу типу 2

Оцінка цитопатичної дії ротавірусу мікрометодом. Чутливі до ротавірусів культури клітин (HEp-2 або Vero) культивують у лунках культурального планшета. Після формування клітинних моношарів і контролю їх якості під інвертованим мікроскопом, ростове середовище з лунок видаляють. Клітинні моношари двічі промивають розчином Хенкса для видалення залишків ростового середовища, що містить сироватку. Після промивання розчин з лунок повністю видаляють.

5.3. Метод титрування вірусів з використанням цитофлюориметричного критерію

Як критерій для виявлення вірусів можна використовувати не ЦПД, а реєстрацію вірусоспецифічних включень в препаратах клітин, пофарбованих флюорохромом акрединовим оранжевим [7]. У них легко виявляються поодинокі інфіковані клітини з вірусоспецифічними включеннями серед великої кількості неінфікованих клітин. Слід зазначити, що для виявлення вірусів при звичайному обліку за їх ЦПД (на 2+) необхідно, щоб було уражено не менше половини клітин моношару.

Завдяки цитоморфологічному критерію оцінки можна віднайти віруси при значно менших їх концентраціях у матеріалі, що досліджується, ніж за допомогою обліку за ЦПД Застосування цитоморфологічного критерію дозволяє визначати віруси за зовнішнім виглядом вірусоспецифічних включень. Ці особливості методу звільняють від необхідності проводити додаткові пасажування і значно скорочують тривалість досліджень.

Інфіковані ротавірусом SA-11 клітини мають трикутну або видовжену форму, яскраво зелене або жовте ядро з одним або кількома ядерцями, та забарвлену в інтенсивний червоний колір цитоплазму в перинуклеарній області, яка має вигляд яскравих галстуків. Не інфіковані клітини мають округлу форму з яскраво зеленим ядром та цитоплазмою, забарвленою у темно-жовтий або коричневий колір.

Інфіковані аденовірусом типу 2 клітини мають гранулярні внутрішньоядерні включення яскравого салатового або жовтувато-зеленого кольору. Від оболонки ядра ці включення відділені прозорою зеленуватою каймою. Ядерця у вигляді округлих червоних утворень диференціюються чітко і за розмірами значно менші за специфічні яскраві аденовірусні включення. Ядро клітини значно збільшене за розмірами, багатолопатевої форми, має вигляд віночка квітки.

У додатку 2 наведені приклади порівняльної оцінки виявлення інфікованих тест-вірусами клітин за ЦПД та за кількістю клітин з вірусоспецифічними включеннями після фарбування акридиновим оранжевим.

Серед методів визначення віруліцидної активності дезінфекційних засобів найбільш поширеними є суспензійний метод та різні модифікації методу тест-об'єктів. Кожний з них має свої переваги та недоліки, які обумовлюють коректність їх застосування при проведенні випробувань.

Обов'язковою умовою випробувань є їх проведення в трьох повторах. У разі обліку результатів за ЦПД при отриманні негативних результатів в основному досліді здійснюють 2 додаткових пасажування дослідного матеріалу.

Суспензійний метод:

дозволяє забезпечити контакт досліджуваного дезінфекційного засобу з концентрованим вірусовмісним матеріалом у рідкому середовищі;

надає можливість моделювання дезінфекції біологічних рідин (варіант з білковим навантаженням);

відносно безпечний при виконанні для персоналу лабораторії;

не застосовується при відсутності прийнятних способів припинення дії дезінфектанту після завершення експозиції з вірусовмісною рідиною.

Метод тест-об'єктів:

застосовується при відсутності прийнятних способів припинення дії дезінфектанту або миючого засобу;

дозволяє краще змоделювати ситуацію з використанням реальних предметів;

дозволяє безпосередньо вивчати ефективність дезінфекції;

не дозволяє створення високого вірусного навантаження на тест-об'єктах.

6.1. Приготування розчинів дезінфікуючих засобів та нейтралізаторів

При проведенні досліджень суспензійним методом досліджуваний дезінфекційний засіб розчиняють у стерильній дистильованій воді, або змішують з відповідним об'ємом води так, щоб його кінцева концентрація в розчині була в 2 рази більшою, ніж рекомендовано в інструкції по застосуванню засобу. Це обумовлено тим, що при проведенні випробувань розчин досліджуваного препарату змішується з вірусовмісною рідиною у рівних співвідношеннях, при цьому його концентрація зменшується в 2 рази, досягаючи рекомендованих для практичного застосування значень.

Для запобігання прояву цитотоксичної дії дезінфектанту на клітини культури, яка використовується для визначення залишкової інфекційної активності тест-вірусу за його цитопатичною дією, перед внесенням на моношар культури клітин дезінфекційний засіб повинен бути нейтралізований.

Для нейтралізації дезінфекційних засобів використовують такі речовини:

для галоїдовміщуючих препаратів, перекісних сполук як нейтралізатор використовують 0,5-1,0% розчин гіпосульфіту натрію;

для альдегідів - 0,5-1,0% розчин аміаку чи бісульфіту натрію;

для кислот - 0,5% розчин їдкого натрію чи калію, або 0,5% розчин бікарбонату натрію;

для лугів - 0,5-1,0% розчин оцтової кислоти;

для четвертинних амонієвих сполук, амфолітів - 0,2% розчин сульфанолу в 10% розчині молока;

для препаратів з невідомим нейтралізатором, а також для препаратів, що добре розчиняються у воді (фенольного ряду), використовують дворазове промивання у воді.

Розчини нейтралізаторів стерилізують і зберігають за відповідних умов.

6.2. Визначення віруліцидної дії дезінфікуючих засобів суспензійним методом

Контролі: кожен дослід супроводжують наступними контролями:

1. Контроль клітинної культури - залишають незараженими по 4 пробірки або 10 лунок з клітинним моношаром протягом всього терміну спостереження;

2. Контроль вірусу (замість дезінфектанту використовують стерильну дистильовану воду);

3. Контроль вірусу у суміші з білковим навантаженням;

4. Контроль токсичності суміші дезінфектанту з нейтралізатором;

5. Контроль повноти нейтралізації дезінфектанту.

Контроль дезінфікуючої дії (референс-дезінфектант): паралельно до основного досліду виконують дослідження формальдегіду при pH 7,0 без сироватки. Концентрація останнього повинна бути 0,7 г/100 мл. Для виконання цього контролю одну частину вірусовмісної рідини змішують з 4 частками розчину Хенксу і 5 частками 1,4% розчину формальдегіду

Результат. Результат випробування віруліцидної дії дезінфекційного засобу щодо відповідного тест-вірусу вважається позитивним, якщо досягається зменшення інфекційного титру тест-вірусу не менше ніж на 4,0 lg ТЦД50/мл у порівнянні з контролем.

6.3. Визначення віруліцидної дії дезінфікуючих засобів методом тест-об'єктів

6.3.1. Визначення віруліцидної дії дезінфікуючих засобів на батистових тест-об'єктах

Підготовка батистових тест-об'єктів. Тест-об'єкти - це шматочки батисту розміром (1 х 0,5 см), попередньо звільненого від крохмалю. Вірусовмісну рідину для контамінації тест-об'єктів готують як вказано у розділі 5. Батистові тест-об'єкти кладуть у стерильну чашку Петрі і контамінують вірусовмісною рідиною, додаючи її з розрахунку 0,05-0,1 мл рідини на кожний тест-об'єкт. Всі тест-об'єкти добре змочуються. Через 20 хвилин зайву рідину промокають стерильним фільтрувальним папером, а шматочки батисту підсушують у термостаті при 37 град.C або в ексикаторі з хлористим кальцієм протягом 30 хв. Готові тест-об'єкти повинні бути використані в день приготування, для запобігання зменшенню інфекційної активності вірусу під дією зовнішніх чинників. Кількість вірусу на тест-об'єктах повинна бути максимально можливою, що важливо для компенсування його втрати при наступній обробці тест-об'єктів.

Виконання дослідження. При визначенні віруліцидних властивостей препарату готують 3-5 концентрацій розчину на дистильованій воді з розрахунку 1,0 мл розчину на кожний тест-об'єкт (робочі розчини). У разі підтвердження випробувань готують робочі розчини дезінфекційного засобу в таких концентраціях: 1) кінцева концентрація дезінфектанту відповідає зазначеній в інструкції; 2) кінцева концентрація препарату в 2 рази перевищує зазначену в інструкції; 3) кінцева концентрація препарату в 2 рази нижча за вказану в інструкції.

Якщо в клітинних культурах не спостерігається цитопатичного ефекту, спричиненого тест-вірусом, то додатково роблять 2 пасажі. При відсутності специфічної зміни в клітинних культурах тест-віруси вважають повністю інактивованими. При оцінці результатів за підрахунком кількості клітин після фарбування акридиновим оранжевим, тест-вірус вважають повністю інактивованим, за умов повної відсутності інфікованих клітин в досліджуваних препаратах.

Контролі:

1. Контроль клітинної культури - залишають не зараженими по 4 пробірки (лунки) з моношаром клітинних культур і спостерігають максимальний термін досліду. Через 24 години як у дослідних, так і в контрольних пробірках змінюють підтримуюче середовище. Впродовж спостереження підтримуюче середовище змінюють у залежності від зміни pH.

2. Контроль вірусного навантаження при контамінації тест-об'єктів - 5 штук заражених тест-об'єктів занурюють у пробірку зі скляними кульками та 5 мл стерильного фізіологічного розчину. Пробірки струшують впродовж 10 хвилин. Одержану рідину використовують для інфікування клітинних культур.

3. Контроль збереження життєздатності вірусу - 5 штук заражених тест-об'єктів занурюють у пробірку з розчином Хенкса, витримують максимальну експозицію, після чого переносять на 5 хв. у 5 мл нейтралізатора, а потім у 5 мл фізіологічного розчину, де струшують зі скляними кульками 10 хв. та інфікують відповідною дозою рідини, відмитої з тестів, 4 клітинні моношари. Для з'ясування кількості збереженого вірусу проводять титрування.

4. Контроль повноти нейтралізації дезінфектанту - 5 штук незаражених тест-об'єктів занурюють на максимальну експозицію в 5 мл розчину дезінфектанту максимальної концентрації, після чого переносять тест-об'єкти на 5 хв. у 5 мл розчину нейтралізатора, потім - у 5 мл фізіологічного розчину. Струшують зі скляними кульками протягом 10 хв. Вносять відповідну кількість рідини в 4 пробірки (лунки) з моношаром клітинних культур. Висновок про повноту нейтралізації дезінфектанту роблять на підставі відсутності токсичної дії на культуру клітин протягом всього періоду спостереження.

5. Контроль дезінфікуючої дії (референс-дезінфектант): Паралельно основному досліду виконують дослідження дезінфікуючої дії 0,7% розчину формальдегіду при pH 7,0 без сироватки. Для виконання цього контролю одну частину вірусовмісної рідини змішують з 4 частками розчину Хенкса 5 частками 1,4% розчину формальдегіду.

Кожний дослід виконують тричі.

Результат. При виконанні сертифікаційних досліджень дезінфекційний засіб вважається таким, що відповідає вимогам, якщо він повністю інактивує інфекційну активність тест-вірусу при використанні його за умов, зазначених в інструкції.

При виконанні скринінгових досліджень (пошуку нових дезінфектантів) після встановлення наявності віруліцидних властивостей у дезінфікуючого засобу, вивчають залежність ефективності його дії від концентрації діючої речовини, часу впливу, температури, реакції середовища.

Вплив температури на активність дезінфікуючого засобу вивчають при знезаражуванні контамінованих батистових тест-об'єктів з використанням водяної бані.

При вивченні впливу pH середовища на активність препарату готують ряд розведень з різними значеннями pH шляхом підкислення 0,1 N розчином оцтової чи іншої кислоти, чи підлужуванням 0,1 N розчином лугу. Порядок проведення дослідів такий же, як з інфікованими тест-об'єктами (описано вище).

6.3.2. Визначення віруліцидної дії дезінфікуючих засобів при знезараженні посуду

При знезараженні посуду як тест-об'єкти використовують тарілки, склянки, емальовані кружки, виделки, ложки.

Виконання дослідження. Чистий посуд (тарілки, склянки) контамінують вірусовмісною рідиною, яку наносять піпеткою з розрахунку 0,5 мл на 100 кв.см поверхні і рівномірно розподіляють його стерильним скляним шпателем. Виделки і ложки занурюють у вірусовмісну рідину на 1-2 хв. так, щоб ручки залишалися незараженими. Заражений посуд підсушують при кімнатній температурі. Після висихання посуд повністю занурюють у дезінфікуючий розчин. Витрата розчину складає, приблизно, 2 л на комплект посуду: чашка, блюдце, 2 тарілки, ложка, вилка, ніж. Через визначені проміжки часу посуд витягають з дезінфікуючого розчину і перевіряють ефективність знезаражування. Для цього стерильними марлевими серветками розміром (3 х 3) см ретельно протирають заражену частину кожного предмету. Серветки нейтралізують у 5 мл нейтралізатора. Після чого вміщують їх у стерильну широку пробірку з розчином Хенкса та скляними кульками і відмивають струшуючи протягом 10 хв. Цією рідиною заражають по 4 пробірки (лунки) з моношаром клітинної культури.

Контролі. Контролем є аналогічно контамінований посуд, занурений на максимальну експозицію в стерильну або кип'ячену водопровідну воду. Після чого з посуду беруть пробу як і в досліді. Вірусне навантаження визначають титруванням.

Результат. При виконанні сертифікаційних досліджень дезінфекційний засіб вважається таким, що відповідає вимогам, якщо він повністю при зазначених концентраціях та експозиціях інактивує інфекційну активність тест-вірусу.

При одержанні позитивного результату знезараження чистого посуду переходять до знезараження посуду, забрудненого залишками їжі. Для цього манну кашу, зварену на молоці і заправлену вершковим маслом змішують з вірусовмісною рідиною з розрахунку 9 г каші на 1 мл суспензії вірусу і наносять рівномірно на поверхню посуду. Методика знезараження посуду і відбір проб виконуються аналогічно тим, що описана для чистого посуду. Рідину після відмивання серветок центрифугують при 1500 g протягом 10 хв., після чого надосад використовують для тестування у культурі клітин.

Контролі. Контролем є аналогічно контамінований посуд, занурений на максимальну експозицію в стерильну або кип'ячену воду. Після чого з посуду беруть пробу як і в досліді. Для з'ясування вірусного навантаження проби титрують.

Результат. При виконанні сертифікаційних досліджень дезінфекційний засіб вважається таким, що відповідає вимогам, якщо він повністю інактивує інфекційну активність тест-вірусу при визначених концентраціях та експозиціях.

Визначення віруліцидної дії дезінфікуючих засобів при знезараженні виробів медичного призначення

При знезараженні виробів медичного призначення, виготовлених з різноманітного матеріалу (скла, металу, гуми і пластмаси), штучно контамінованих вірусами, проводять дії, аналогічні щодо знезараження посуду. Як білкове навантаження використовують сироватку великої рогатої худоби. При проведенні знезараження виробів необхідно звернути увагу на важкодоступні для дезінфекційних розчинів місця обробки, що може спричинити збільшення експозиції або концентрації дезінфекційного засобу. Дезинфекцію ендоскопів проводити згідно з методичними вказівками Методичні вказівки щодо очищення, дезінфекції та стерилізації ендоскопів, а також медичного інструментарію до них (м. Київ, 2004 р.).