1988 року Всесвітня асамблея охорони здоров'я поставила завдання глобальної ліквідації поліомієліту до 2000 року. Цю ініціативу підтримали всі країни - члени ВООЗ.

З 1993 року в Західній півкулі припинено циркуляцію "диких" штамів поліовірусів і випадки захворювань на поліомієліт не реєструються.

За повідомленням ВООЗ, у Європейському регіоні 1997 року поліомієліт реєструвався лише у 2 країнах.

В Україні протягом 1991 - 1996 рр. спостерігалась висока захворюваність на поліомієліт. За цей період зареєстровано 36 випадків поліомієліту. Захворювання мали місце на 5 адміністративних територіях: Дніпропетровській, Івано-Франківській, Львівській, Чернігівській областях та м.Києві.

Особливостями поліомієліту в останні роки в Україні було зростання питомої ваги захворювань серед дорослих, тяжкий клінічний перебіг хвороби, наявність летальних випадків.

З метою зниження захворюваності на поліомієліт, припинення циркуляції "диких" штамів поліовірусів, на виконання розпорядження Президента України від 26.06.96 року N 175/96-рп "Про проведення імунізації дітей проти поліомієліту" в Україні проведено дні імунізації дітей. І в результаті досягнуто високого рівня охоплення дітей щепленнями і зниження захворюваності на поліомієліт. 1997 року випадків паралітичного поліомієліту в Україні не зареєстровано.

Для удосконалення заходів щодо попередження від поліомієліту

1. Затвердити:

1.1.

Методичні рекомендації "Організація епідеміологічного нагляду за поліомієлітом" (додається).

1.2. Методичні рекомендації "Вірусологічна діагностика поліомієліту" (додається).

1.3. Методичні рекомендації "Клінічна діагностика поліомієліту" додається).

1.4.

Склад комісії для заключної оцінки випадків гострих в'ялих паралічів (додається).

1.5.

Склад комісії по підготовці до сертифікації України як території, вільної від поліомієліту (додається).

2.

Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Київської та Севастопольської міських держадміністрацій забезпечити:

2.1. Охоплення щепленнями проти поліомієліту дітей до 14 років відповідно до діючого календаря щеплень згідно з наказом МОЗ від 25.01.96 N 14 "Про затвердження Календаря профілактичних щеплень, Переліку протипоказань до щеплень, Основних положень про організацію та проведення профілактичних щеплень, Форми подачі інформації про випадок побічної дії (ускладнення) після застосування імунобіологічних препаратів, Переліку можливих ускладнень і термінів їх виникнення після щеплень, що підлягають подальшому розслідуванню".

2.2. Облік та своєчасне якісне обстеження всіх хворих на гострі в'ялі паралічі, включаючи вірусологічні та серологічні дослідження.

2.3. Вивчення стану колективного імунітету до поліомієліту та циркуляції поліовірусів серед населення і в об'єктах довкілля.

2.4. Дотримання "холодового ланцюга" при транспортуванні, зберіганні та використанні поліомієлітної вакцини та проб для вірусологічних досліджень тощо.

2.5. Щотижневу подачу звітів лікувальними закладами про наявність або відсутність випадків гострих в'ялих паралічів до територіальної санепідстанції згідно з методичними рекомендаціями "Організація епідеміологічного нагляду за поліомієлітом".

2.6. Ретельне епідеміологічне та вірусологічне обстеження кожного випадку гострого в'ялого паралічу у дітей до 15 років.

2.7. Доставку первинного матеріалу від дітей до 15 років з гострими в'ялими паралічами, всіх ізольованих штамів ентеровірусів від хворих людей та з об'єктів довкілля разом з вихідним матеріалом в Українську референс-лабораторію з поліомієліту для подальшого дослідження.

3.

Головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва і Севастополя, на водному, залізничному, повітряному транспорті забезпечити:

3.1. Здійснення протиепідемічних заходів при поліомієліті та гострих в'ялих паралічах.

3.2. Роботу вірусологічних лабораторій з діагностики поліомієліту, вивчення стану колективного імунітету та вірусологічне обстеження об'єктів довкілля відповідно до діючих нормативних документів.

3.3. Ретельний контроль за повнотою охоплення щепленнями проти поліомієліту дітей згідно з діючим календарем щеплень.

4.

Начальнику Головного економічного управління Барановій Т.Ф. передбачити фінансування Української референс-лабораторії з поліомієліту за рахунок коштів, передбачених на фінансування Національної програми імунопрофілактики населення на 1993-2000 рр.

5.

Директору Української референс-лабораторії з поліомієліту Широбокову В.П.:

5.1. Проводити вірусологічне дослідження первинного матеріалу від дітей з гострими в'ялими паралічам та осіб, що з ними спілкувалися.

5.2. Організувати роботу по з'ясуванню природи циркулюючих поліовірусів та інших ентеровірусів.

5.3. Надавати методичну допомогу вірусологічним лабораторіям санепідстанцій.

5.4. Забезпечувати вірусологічні лабораторії обласних, міських санепідстанцій паспортизованими еталонними вакцинними штамами поліовірусів типів 1, 2 і 3 та лабораторними лініями перещеплюваних культур клітин.

5.5. Співпрацювати з Європейським регіональним бюро ВООЗ, вірусологічною лабораторією ВООЗ (Копенгаген), Регіональною референс-лабораторією (Росія) з питань лабораторної діагностики поліомієліту, розробки стратегії і тактики ліквідації поліомієліту в Україні.

6.

Директору Київського НДІ епідеміології та інфекційних хвороб Сельніковій О.П.:

6.1. Здійснювати науковий аналіз епідемічної ситуації з поліомієліту.

6.2. Надавати консультативну та методичну допомогу фахівцям санітарно-епідеміологічної служби з питань епіднагляду та профілактики поліомієліту.

6.3. Проводити наукові розробки з питань епідеміології поліомієліту на надавати обгрунтовані рекомендації щодо профілактики цієї інфекції.

6.4. Здійснювати підготовку звітності для ВООЗ з питань епідеміологічного нагляду за гострими в'ялими паралічами та поліомієлітом.

7.

Виконуючому обов'язки головного лікаря Українського центру держсанепіднагляду України Марценюку М.І.:

7.1. Здійснювати аналіз епідситуації з поліомієліту та ефективності імунопрофілактики в країні.

7.2. Надавати організаційно-методичну допомогу санепідстанціям у проведенні протиепідемічних заходів при захворюванні на поліомієліт та гострі в'ялі паралічі.

7.3. Узагальнювати щотижневу інформацію про кількість випадків поліомієліту та ГВП для подання до ВООЗ та Київського НДІ епідеміології та інфекційних хвороб.

8.

Начальнику Головного управління закладів освіти Вороненку Ю.В. забезпечити підготовку лікарів зі спеціальностей - неврологія, інфекційні хвороби, педіатрія, вірусологія, епідеміологія, з питань діагностики, лікування і профілактики поліомієліту та інших ентеровірусних інфекцій у закладах післядипломної освіти.

9.

Генеральному директору державного підприємства "Укрвакцина" Брую Г.Ф.:

9.1. Узагальнювати та аналізувати річні заявки регіонів на поліомієлітну вакцину та забезпечити закупівлю, зберігання і транспортування поліомієлітної вакцини гарантованої якості в режимі "холодового ланцюга".

10.

Вважати такими, що:

10.1. Не застосовуються на території України - "Инструкция по профилактике полиомиелита в СССР", Москва, 1984 г., наказ МОЗ СРСР від МОЗ СРСР від 21.07.89 N 430 "Об организации и проведении мероприятий по ликвидации полиомиелита в СССР".

10.2. Втратив чинність наказ МОЗ УРСР від 02.11.89 N 221 "Об осуществлении мероприятий по дальнейшему снижению заболеваемости полиомиелитом в Украинской СССР".

11. Контроль за виконанням наказу покласти на першого України Некрасову Л.С.

Поліомієліт - гостра інфекційна хвороба, яку спричиняють поліовіруси типів 1, 2, 3, з діапазоном захворювань від неспецифічних симптомів до паралічів з можливою наступною інвалідністю. Інкубаційний період становить від 2 до 35 діб. Єдиним джерелом інфекції є людина. Механізм передачі збудника поліомієліту є фекально-оральний та повітряно-крапельний.

"Підозрілим на поліомієліт" вважають гострий, тобто з швидким розвитком (протягом 1-3 днів), в'ялий параліч (ГВП), у тому числі синдром Гійєна - Барре, у дитини віком до 15 років або схоже з поліомієлітом паралітичне захворювання у людини будь-якого віку.

Якщо при епідеміологічному розслідуванні одразу виявлено очевидну причину паралічу (наприклад, травма), діагноз "підозрілий випадок" відміняють і епідеміологічне розслідування припиняють, хворий отримує відповідне лікування та проходить курс реабілітації.

Якщо при розслідуванні "підозрілого" випадку лікар-іфекціоніст, невролог та епідеміолог не можуть одразу встановити вірогідну причину паралічу, такий випадок переходить з категорії "підозрілого" до категорії "ймовірний випадок" і епідеміологічне розслідування продовжується. "

"Ймовірний випадок"- це тимчасовий діагноз, який протягом 12 тижнів від початку паралічу повинен бути замінений комісією для заключної оцінки випадків ГВП на "підтвержений поліомієліт", "поліомієлітноподібне захворювання" або відмінений.

За рекомендаціями ВООЗ з січня 1997 року в Європі введено нове стандартне визначення випадку поліомієліту, згідно з яким тільки випадок гострого в'ялого паралічу, при якому виділено поліовірус, класифікується як поліомієліт.

Класифікація інших випадків ГВП проводиться з урахуванням одного або більше наступних критеріїв:

- летальний кінець хвороби;

- залишковий в'ялий параліч після 60 днів;

- втрата спостереження за хворим;

- повнота вірусологічного обстеження (дві проби випорожнень протягом 14 днів від початку ГВП).

Враховуючи зазначені критерії, випадок ГВП класифікується як поліомієлітоподібне захворювання, якщо вірусологічне обстеження проведено не повністю, але:

- залишковий в'ялий параліч зберігається більше 60 днів,

- втрачено спостереження за хворим,

- хворий помер,

- коли комісія для заключної оцінки випадків ГВП вирішує, що випадок слід класифікувати як поліомієлітоподібне захворювання.

Всі випадки поліомієлітоподібних захворювань слід розглядати як недоліки у системі епіднагляду. Кожен з них повинен ретельно аналізуватися, що відповідає рекомендаціям ВООЗ.

Епідеміологічний нагляд за поліомієлітом та ГВП включає збір та аналіз інформації про випадки ГВП та поліомієліту, стан колективного імунітету до поліовірусів, лабораторний контроль за циркуляцією поліовірусів з метою обгрунтування і проведення необхідних профілактичних, та протиепідемічних заходів, спрямованих них на припинення циркуляції "диких" поліовірусів.

Для реалізації зазначеної мети необхідно забезпечити: своєчасне виявлення, лабораторне обстеження кожного ймовірного випадку поліомієліту для підтвердження або спростування діагнозу поліомієліту, високий рівень охоплення (98-100%) профілактичними щепленнями дітей згідно з календарем щеплень, проведення епідеміологічного аналізу з оцінкою ефективності протиепідемічних та профілактичних заходів.

Епідеміологічний нагляд здійснюється на кожній території. Роботу по виявленню випадків ГВП, їх діагностиці, лікуванню хворих, вірусологічному та серологічному обстеженню очолюють: головний педіатр, головні іфекціоністи, головні неврологи і епідеміолог. Епідеміолог санепідстанції відповідає за розробку плану заходів щодо реалізації програми епіднагляду, узагальнює та аналізує його результати, розробляє відповідні рекомендації, надає звіти.

Сертифікація України, як держави вільної від поліомієліту, неможлива без якісного спостереження за випадками ГВП у дітей віком до 15 років та їх вірусологічного обстеження.

У зв'язку з цим випадок ГВП, у тому числі синдром Гійєна-Барре, у дитини віком до 15 років повинен бути зареєстрований, відповідно обстежений і остаточно класифікований.

Підозрілим на поліомієліт слід вважати гострий в'ялий моно-, пара- і тетрапарез, що розвивається протягом 1-3 днів. Гострі неврити лицевого нерву теж підпадають під категорію підозрілого випадку при їх резистентності до терапії протягом двох тижнів і при підозрі на ураження ядра лицевого нерву.

Усі діти з ГВП госпіталізуються у встановленому порядку до інфекційного відділення дитячої центральної районної або міської лікарні, де лікар-інфекціоніст надає повідомлення про випадок ГВП до районної СЕС як по телефону, так і письмово, звідки, у свою чергу, повідомляється про випадок до обласної СЕС (додаток 1). Кожній дитині віком до 15 років, хворій на ГВП, на яку надходять повідомлення, епідеміологом обласного рівня присвоюється епідномер (додаток 2). Обласна СЕС надсилає до МОЗ України та Українського центру держсанепіднагляду (УЦДСЕН) повідомлення про випадок ГВП, а у подальшому про спростування або підтвердження діагнозу. Протягом 48 годин випадок ГВП, який вважається підозрілим на поліоміоєліт, розслідується епідеміологом (додаток 3), і разом з лікарем-інфекціоністом та неврологом вирішується питання про спростування діагнозу або переводу випадку до категорії "ймовірний". В останньому разі від хворого отримують першу пробу фекальних мас (2 флакони), а через 24-48 годин - другу (2 флакони). Всі проби доставляють з дотриманням холодового ланцюга до відповідної територіальної вірусологічної лабораторії СЕС для дослідження. Парні сироватки крові хворих відбирають з інтервалом 2-3 тижні для визначення рівнів віруснейтралізуючих антитіл до поліовірусів. У вірусологічній лабораторії СЕС досліджується по 1 флакону кожної проби фекальних мас та сироватки крові. Інші флакони фекальних мас терміново надсилають до Української референс-лабораторії з поліомієліту (УРЛП) для паралельного дослідження.

Від хворих з гострим невритом лицевого нерву, які госпіталізовані до інфекційних або неврологічних відділень, також відбирають 2 проби фекальних мас, які зберігають при температурі - 20 град.С. Якщо терапевтичні заходи не ефективні протягом 2 тижнів лікування чи виявлені ураження ядра лицевого нерву, то відібрані проби фекальних мас надсилаються до вірусологічної лабораторії. Одночасно на на такі випадки надається повідомлення. Випадку надається епідномер, але з поміткою "f" наприкінці.

В осередку "ймовірного" випадку поліомієліту проводять епідеміологічне обстеження, заключну дезінфекцію та аналіз даних профілактичних щеплень проти поліомієліту осіб, які спілкувалися з хворим. Дітям до 14 років, які не щеплені у встановлені строки у зв'язку з тимчасовими протипоказаннями, щеплення проводять за індивідуальною схемою згідно з рекомендаціями відповідних спеціалістів (Наказ МОЗ України від 25.01.96 N 14 "Основні положення про організацію та проведення профілактичних щеплень").

Щеплення проводять після відбору проб фекальних мас (по 2 флакони) від 5 дітей віком до 5 років, що спілкувались з хворим. При відсутності дітей зазначеного віку обстежують осіб інших вікових груп. Проби направляють на дослідження паралельно до УРЛП та територіальної вірусологічної лабораторії СЕС.

Для проб фекальних мас осіб, що спілкувалися з хворим, слід надавати той же самий епідномер, що і для хворого. Різниця полягає в тому. що в кінці додається номер "С1"-для позначення першої особи, "С2"-другої тощо.

Діаграма розслідування випадків ГВП у дітей, збору матеріалу та відповідних заходів наведена у додатку 4.

Спостерження останніх років свідчать про те що випадки поліомієліту мають місце і серед дорослих. З метою не пропустити захворювання на поліомієліт серед цієї категорії населення необхідним є обстеження випадків підозри на поліомієліт (ГВП та гострого невриту лицевого нерву) з клінічним перебігом, подібним тому, який визначається у дітей та при якому відсутня інша причина захворювання.

Від дорослих з ГВП матеріал відбирають за аналогічною методикою, але досліджують його лише у вірусологічних лабораторіях обл/міськ СЕС. Вихідний матеріал (проби фекальних мас та сироватки крові) зберігають у вірусологічних лабораторіях до кінця досліджень, а в разі позитивного результату (виділення вірусу, 4-х кратного зростання титрів антитіл, при виявленні високих рівнів антитіл до поліовірусу- 1:128 і вище у випадку пізнього взяття першої сироватки крові) одночасно з виділеним штамом поліо- або іншого ентеровірусу направляють до УРЛП.

Для повноти виявлення випадків поліомієліту додатковими є вірусологічні дослідження носоглоткових змивів, секційного матеріалу, при нагоді ліквору. Термін взяття матеріалу, умови його зберігання вказано у додатку 5. Наявність вірусів у зазначеному матеріалі, зростання титрів віруснейтралізуючих антитіл у сироватках крові в 4 рази і більше свідчить на користь поліовірусної етіології захворювання. Дослідження додаткового матеріалу здійснюється в вірусологічних лабораторіях санепідслужби.

Санепідстанції Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя, на водному, залізничному, повітряному транспорті не пізніше 70 днів від дня появи паралічів направляють до Головного санітарно-епідеміологічного управління МОЗ України копії карти епідеміологічного обстеження хворого на поліомієліт або ГВП, а при необхідності - копії історії хвороби.

Діагноз підтверджується або спростовується комісією для заключної оцінки випадків ГВП. На кожний випадок захворювання надається заключна класифікація (додаток 2).

Лікувально-профілактичні заклади, в які госпіталізуються діти з ГВП, повинні до 30 числа кожного місяця подати до територіальної районної СЕС відомості про кількість випадків ГВП у дітей до 15 років або про їх відсутність. Щотижнево СЕС Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя, на водному, залізничному, повітряному транспорті направляють одночасно до УЦДСЕН та Київського НДІ епідеміології та інфекційних хвороб (КНДІЕІХ) дані про випадки ГВП у дітей за схемами (додаток 6). Щотижнева інформація повинна містити відомості про всі випадки ГВП у дітей, починаючи з січня поточного року. Узагальнені матеріали щотижнево надсилаються Міністерством охорони здоров'я до ВООЗ.

При проведенні епідеміологічного нагляду за поліомієлітом слід також здійснювати перевірку повноти виявлення випадків ГВП у дітей в лікувальних та реабілітаційних закладах. З цією метою необхідно перевіряти історії хвороби амбулаторних та стаціонарних хворих, особливо в інфекційних, неврологічних, фізіотерапевтичних відділеннях лікарень, відділі медичної статистики.

З метою оцінки якості епідеміологічного нагляду за ГВП, що буде ураховуватися в подальшому при сертифікації території як вільною від поліомієліту, необхідної здійснювати оцінку своєчасності та повноти інформації про випадки ГВП у дітей, для чого на рівні району проводиться аналіз по кожному лікувально-профілактичному закладу (додатки 7, 8). Обласні СЕС здійснюють аналіз повноти та своєчасності інформації про випадки ГВП у дітей по районам області (додатки 7, 8). Показники повноти та своєчасності інформації про випадки ГВП у дітей повинні бути не менше 80%. Результати аналізу повноти та своєчасності інформації доводити до відома керівників лікувально-профілактичних закладів.

Для забезпечення оцінки епідемічної ситуації необхідно своєчасно виявляти та проводити лабораторну діагностику захворювань, етіологія яких може бути пов'язана з поліовірусами чи іншими ентеровірусами.

З метою профілактики поліомієліту в Україні проводяться щеплення поліомієлітною вакциною дітей згідно з календарем щеплень. При порушенні календаря щеплень, у зв'язку з тимчасовими протипоказаннями, щеплення проводять за індивідуальною схемою згідно з рекомендаціями відповідних спеціалістів (Наказ МОЗ України від 25.01.96 N 14 "Основні положення про організацію та проведення профілактичних щеплень").

Транспортування поліомієлітної вакцини здійснюється в холоді з використанням машин - рефрижераторів, термосів з льодом чи в сумках - холодильниках. Постійний запас вакцин повинен знаходитись у спеціальних камерах, морозильниках при температурі - 15 град.С - 25 град.С. Районні й міські санепідстанції одержують вакцину і за потребою видають її лікувально-профілактичним закладам, де вона зберігається у побутових холодильниках при +2 град.С - +8 град.С. Створювати запаси вакцини забороняється, вона повинна використовуватися протягом 30 днів.

Для оцінки ефективності імунопрофілактики населення проти поліомієліту вірусологічні лабораторії СЕС проводять відбіркові дослідження стану специфічного імунітету і щорічно надсилають відомості до КНДІЕІХ за схемою (додаток 9).

Умовно захисними титрами віруснейтралізуючих антитіл до поліовірусів вважають титри 1:8-1:16.

З метою вивчення циркуляції поліовірусів серед населення та в об'єктах довкілля вірусологічні лабораторії санепідстанцій проводять планове обстеження дітей організованих колективів (проби фекальних мас) та дослідження проб стічних вод, води відкритих водоймищ, питної води та продуктів харчування (виготовлених молокозаводами, дитячими молочними кухнями та овочів з полів зрошення).

Щоквартально вірусологічні лабораторії санепідстацій Автономної республіки Крим, областей, міст Києва і Севастополя направляють звіт до КНДІЕІХ (додаток 10).

Загальне керівництво за проведенням епідеміологічного нагляду за поліомієлітом здійснює КНДІЕІХ та УЦДСЕН.

(1) - число доз оральної поліомієлітної вакцини вакцини (ОПВ) згідно з документами про щеплення або за словами батьків;

(2) - число доз ОПВ при додаткових імунізаціях, якщо про це є відомості;

(3) - дати (день/місяць/рік);

(4) - дата останнього щеплення ОПВ;

(5) - дата народження, якщо невідомо, указати вік у роках і міс.;

(7) - дата надання даних (реєстрації) в СЕС;

(8) - дата розслідування випадку;

(9) - дата отримання першої проби фекальних мас;

(10) - дата отримання другої проби фекальних мас;

(11) - дата повторного клінічного обстеження;

(12) - підвищення температури на початку паралічу: 1 = так, 2 = ні, 9 = невідомо;

(13) - швидкий розвиток паралічу (протягом 4 днів): 1 = так, 2 = ні, 9 = невідомо;

(14) - локалізація: 0 = тільки параліч лицевого нерву, 1 = кінцівки, 2 = кінцівки та дихальні м'язи (бульбарний), 3 = тільки бульбарний, 9 = невідомо;

(15) - наявність асиметричного паралічу: 1 = так, 2 = ні, 9 = невідомо;

(16) - огляд через 60 днів: 1 = залишковий параліч, 2 = відсутність паралічу, 3 = втрачено з-під нагляду, 4 = смерть до наступного обстеження;

(17) - ізоляція поліовірусу: 1 = так, "дикий", 2 = так, вакцинний, 3 = так, вірус не типовано, 4 = суміш, "дикий" + вакцинний, 5 = не виділено, 6 = проба не оброблена;

(18) - ізоляція ентеровірусу: 1 = так, 2 = ні, 3 = проба не досліджена;

(19) - заключна класифікація: 0 = не ГВП, 1 = підтверджено, 2 = виключено, 3 = поліомієлітоподібне захворювання, 4 = можливо вакцино-асоційований, 5 = вакциноасоційований;

(20) - заключний клінічний діагноз після 60 днів від початку паралічу: 1 = полірадікулоневрит / синдром Гійєна-Барре /синдром Ландрі/, 2 = поліомієліт, 3 = травматична невропатія, 4 = пухлина, 5 = параліч лицевого нерву, 6 = інше.

Підпис відповідальної особи _____________________ Дата ______ * форми, які заповнюються в районних СЕС в останній день місяця; ** форми, які заповнюються в обласних/міських СЕС в перший день наступного місяця.

Підпис відповідальної особи ___________________ Дата ________ * форми, які заповнюються в районних СЕС в останній день місяця; ** форми, які заповнюються в обласних/міських СЕС в перший день наступного місяця.

Вірусологічні лабораторії здійснюють моніторинг за циркуляцією вірусів поліомієліту серед населення країни та в об'єктах довкілля. Лабораторні вірусологічні дослідження дають можливість диференціювати випадки паралітичного поліомієліту та гострого в'ялого паралічу (ГВП), що спричинені іншими чинниками, у тому числі і ентеровірусами. Спостереження за циркуляцією поліовірусів в навколишньому середовищі та вивчення рівня колективного імунітету важливі для оцінки епідемічної ситуації з поліомієліту в країні та ефективності профілактичних заходів.

Організація роботи вірусологічних лабораторій

Якісна робота вірусологічних лабораторій можлива за умов стандартизації методів досліджень та забезпечення вірусологічних лабораторій відповідним обладнанням, культурами клітин та середовищами для них, діагностичними препаратами, реактивами тощо. Важливим є використання досвіду вірусологічних лабораторій інших країн, дотримання рекомендацій ВООЗ щодо методики проведення вірусологічних досліджень.

Перелік необхідного обладнання:

Вірусологічний бокс, термостат (33 град. - 38 град.С), СО2 - інкубатор. Для збереження культур клітин і вірусовмісного матеріалу - холодильник побутовий, холодильні камери на 20 град.С, - 40 град.С чи - 70 град.С. Дистилятор, центрифуга, автоклав, сухожарова шафа. Посуд - флакони для культур клітин і взяття матеріалу з корками, що не мають токсичної дії, планшети 96-лункові для культур клітин, рН - метр, світловий мікроскоп, краще інвертований.

Культури клітин

При проведенні вірусологічних досліджень необхідно використовувати перещеплювані лінії клітинних культур НЕр-2 та RD, в окремих випадках, як виняток, культури Vero, Rh, Hela, інші чутливі культури людського або мавп'ячого походження. Культура клітин НЕр-2 найбільш чутлива до поліовурусів і вірусів Коксакі В, RD - до вірусів Коксакі А, вірусів поліомієліту і ЕСНО. В кожній лабораторії рекомендується створити банк клітин, в якому клітинні лінії можуть зберігатися певний час без втрати їх життєздатності. Необхідність створення банку пояснюється тим, що чутливість культур клітин до поліо- та інших ентеровірусів при пасажах може знижуватися, не виключається також і можливість їх контамінації. Тому час від часу треба перевіряти чутливість культур до еталонних штамів, вірусів поліомієліту. Небажано проводити більше 20-25 пасажів. Після зазначеної кількості пасажів, зміні чутливості чи у випадку контамінації клітинних ліній необхідно повернутися до банку клітин.

Забезпечення вірусологічних лабораторій культурами клітин НЕр-2 і RD здійснює Українська референс-лабораторія з поліомієліту (УРЛП).

Середовища для культур клітин

Робота з клітинними культурами може бути ефективною тільки за умов дотримання стерильності, якісної обробки посуду та використання поживних середовищ і збалансованих розчинів високої якості. Культивувати клітини можна на середовищах Ігла, Ігла МЕМ, 199 та інших. Якість свіжовиготовлених в лабораторії партій середовищ перевіряють при вивченні ефективності вирощування на них культур клітин, а також шляхом титрування відомого еталонного штаму вірусу в культурах клітин з таким середовищем. При відсутності токсичної дії середовища на клітини і відповідності титру вірусу відомим величинам, середовище використовують для подальших досліджень. Поживні середовища можуть бути ростовими та підтримувальними. Ростові середовища, або середовища росту, містять до 10% сироватки крові великої рогатої худоби чи ембріональної сироватки (сироватки повинні бути інактивовані і кожний флакон перевірений на стерильність та відсутність цитотоксичності). Середовища росту сприяють розмноженню клітин, їх швидкому росту і утворенню добре сформованих моношарів. Для репродукції в культурах клітин вірусів використовують середовища підтримки, які взагалі не містять сироватки, або в кількості не більше 2%. Для успішного культивування клітин необхідно дотримуватися правил асептики, створювати умови, що перешкоджають росту бактерій та цвільових грибів. З цією метою доцільно використовувати антибіотики. Застосовують пеніцилін (натрієва сіль бензилпеніциліну) та стрептоміцин (хлор-кальцієвий комплекс), які вносять в поживні середовища безпосередньо перед вживанням: 100 ОД/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину. Можна використовувати також гентаміцин (200 ОД/мл), канаміцин та лінкоміцин (100 ОД/мл), неоміцин (50 ОД/мл), ністатин (50 ОД/мл) та інші.

Культивування перещеплюваних культур клітин

Перещеплювані клітинні культури вирощують у вигляді моношару на поверхні скла у флаконах, матрацах, пробірках. Для пересівання відбирають культури з чіткими межами між клітинами, що мають типову морфологію. Наявність у полі зору великої кількості округлих клітин, поява клітин з вакуолями та іншими ознаками патології робить дану генерацію непридатною для пересівання. У таких випадках для подальшої роботи використовують клітини з банку. Невелика кількість округлих клітинних елементів, які при незначному струшуванні змиваються з поверхні моношару, не є перешкодою їх використання для вірусологічних досліджень чи для подальшого перещеплювання. Під час росту клітин (після другої - третьої доби) спостерігається зміна рН у кислий бік, при цьому іноді частина клітин відривається від поверхні скла і потрапляє в поживне середовище. Зміна рН в кислий бік, що наступила на першу - другу добу після пасажу клітин та помутніння середовища також можуть бути пов'язані з контамінацією мікроорганізмами. З такою культурою працювати не можна, слід повернутися до банку клітин. Вибрану для пересівання культуру клітин знімають з поверхні скла за допомогою трипсину (0,25%) або версену (0,02%). Після дворазового відмивання моношарів невеликою кількістю розчину трипсину чи версену їх вміщують в термостат на 10-15 хвилин, після чого до клітин додають невелику кількість середовища росту. Ним старанно змивають клітини зі скла. Одержану суспензію клітин після підрахунку в лічільній камері розводять середовищем росту до концентрації, необхідної для посіву. У флакони об'ємом 100 мл розливають по 20 мл суспензії, що містить 40 - 60 тис. клітин в 1 мл, у матраци об'ємом 1,5 л вносять по 150 мл суспензії, в 1 мл якої міститься 60-70 тис. клітин. У пробірки вносять по 180-300 тис. клітин в об'ємі 1 мл. Формування моношару відбувається за 48 год.

З метою запобігання контамінації культури клітинами іншого походження не дозволяється у культурному боксі одночасно працювати більше ніж з однією лінією клітинних культур.

Створення банку клітин

Отримані в Українській референс-лабораторії клітини тричі перещеплюють, заморожують і зберігають при t - 70 град.С, - 40 град.С або в умовах рідкого азоту, дотримуючись правил кріоконсервування.

1. Кріоконсервування (замороження) клітинних культур.

На першому етапі отримують суспензію клітин за допомогою трипсину або версену (див. вище). Далі суспензію центрифугують при 1000 - 2000 об/хв 10 хвилин, зливають надосадову рідину. Ресуспендують клітини в середовищі для заморожування так, щоб кінцева концентрація була не менша за 10 7 клітин/мл. З цією метою можна використовувати 2 типи середовищ для заморожування:

- ростове середовище + 10% ДМСО (диметилсульфоксид)

- ростове середовище + 10% стерильного гліцерину, не

токсичного для клітин.

Клітинну суспензію розливають по 1 мл в пробірки для заморожування з кришками, що загвинчуються, або в ампули, відмічають дату, тип клітин, номер пасажу та прізвище відповідальної особи. Пробірки вміщують у пенопластові контейнери, які дозволяють охолоджувати клітини з постійною швидкістю і зберігають в холодильнику при -70 град.С. Термін збереження життєздатності культур клітин при -70 град.С складає близько року, іноді й більше, хоча частина популяції клітин при цьому втрачає життєздатність. При -40 град.С можна зберігати клітини протягом 0,5 року. В рідкому азоті час зберігання клітин необмежений.

2. Поновлення заморожених культур клітин

Пробірку із замороженими клітинами вміщують у полиетиленовий пакет і швидко розморожують у водяній бані при 36 град.С протягом 3-х хвилин. Після цього протирають поверхню пробірки 70% етанолом, обережно відкривають пробірку в боксі. Для зменшення токсичної дії консервантів (ДМСО чи гліцерину) в пробірку з клітинною суспензією поступово по краплям додають 1-2 мл поживного середовища, постійно - струшуючи вміст пробірки. Після цього негайно центрифугують клітини при 1000-2000 об/хв протягом 3-4 хвилин. Зливають надосадову рідину, яка містить консервант. Відмиті клітини ресуспендують в середовищі росту до кінцевої концентраціі 40 - 60 тис. клітин/мл і заливають в порожній посуд, що призначений для культивування культур (флакон, матрац). Наступного дня, коли клітини починають формувати моношар, перевіряють їх якість і замінюють середовище росту на свіже, щоб видалити залишки консерванту і нежиттєздатні клітини.

Титрування вірусів у культурах клітин за цитопатичною дією (ЦПД)

Метод титрування вірусу за ЦПД грунтується на визначенні найбільшого розведення вірусвмісного матеріалу, в якому вірус може спричинити ЦПД у 50% інфікованих культур клітин. Ця величина називається 50% тканинною цитопатогенною дозою (ТЦД50).

Для титрування вірусів спочатку проводять звільнення внутриклітинного вірусу і очищення вірусвмісного матеріалу від клітинного детриту шляхом його заморожування та розморожування з подальшим центрифугуванням при 1000 - 2000 об/хв протягом 3-5 хв.

Для інфікування культур клітин готують десятиразові розведення досліджуваного вірусвмісного матеріалу, використовуючи стерильні сольові розчини (фізіологічний розчин, розчин Хенкса тощо). Розведення краще готувати в стерильних флаконах від пенициліну. Для отримання кожного наступного розведення слід міняти піпетки (наприклад, стерильною кінцевою піпеткою вносять у першу пробірку 1,8 мл сольового розчину і 0,2 мл вірусвмісного матеріалу - отримали розведення 10-1; другою стерильною піпеткою перемішують рідину і переносять 0,2 мл до другої пробірки - отримали розведення 10-2 і так далі).

Титрування здійснюють у чутливих культурах клітин, які сформували за добу добрий моношар на стінці пробірок або флаконів від пеніцілину. З пробірок чи флаконів з культурою клітин видаляють середовище росту і вносять по 0,1 мл вірусвмісного матеріалу на пробірку (0,2 мл на флакон). На кожне розведення вірусу використорують 4 пробірки (флакони) з культурою клітин. Починають інфікування культур з кінцевого розведення вірусу, у цьому разі зникає потреба щоразу міняти піпетки. Потім до кожного моношару клітин додають середовище підтримки. Інфіковані та контрольні культури вміщують у термостат і витримують при температурі 36 град.С. Результати визначають на 3 - 5 добу. Інтенсивність ЦПД оцінюють за системою плюсів (4+). Далі проводиться статистична обробка за методом Ріда-Менча або за формулою Кербера. Визначається ТЦД50 в об'ємі матеріалу, взятого для зараження одного моношару з культурою клітин. Роблять перерахунок по визначеню ТЦД50 на 1 мл вірусвмісного матеріалу.

Формула Кербера для визначення титру вірусу:

L - lg найменшого розведення, яке використане у титруванні;

d - інтервал у lg між двома послідовними розведеннями;

S - сума пропорцій позитивних тест-одиниць (тобто пробірок з культурою, де з'явилася ЦПД) у кожному розведенні.