В профилактическом направлении советской медицины вопросы оздоровления внешней среды приобретают особую актуальность.

С целью правильного и эффективного проведения текущего санитарного надзора необходимо осуществление лабораторного контроля на современном научном уровне с использованием как известных, регламентируемых официальными документами, тестов, так и новых методов исследования.

Достижения в области санитарной микробиологии в нашей стране дают основания для широкой рекомендации по внедрению в практическую работу лабораторий, осуществляющих плановый контроль внешней среды, этих новых методов изучения.

Совместными исследованиями, проведенными в течение ряда лет в Киевском научно-исследовательском институте общей и коммунальной гигиены, в Киевском научно-исследовательском институте эпидемиологии, микробиологии и паразитологии, установлено широкое распространение в сточных водах, водоемах, почве, а также среди детского населения энтеровирусов, патогенных эшерихий и других возбудителей кишечных инфекций. Выявлена сравнительно высокая устойчивость энтеровирусов в различных объектах внешней среды, в том числе на предметах обихода и окружающей обстановки. При этом установлено, что в условиях санитарно-бактериологического контроля за предметами обихода и оборудования, наряду с проведением колиметрии, санитарно-показательное значение имеет тест энтерококкометрии.

Выявлена повышенная устойчивость энтерококков к физико-химический факторам окружающей среды в сравнении с E. coli, что обуславливало их более длительную выживаемость на предметах обихода, стеклянных, тканевых и деревянных тестах. Это позволяет рекомендовать энтерококкометрию как более достоверный тест при контроле санитарно-гигиенического режима детских и больничных учреждений.

При применении синтетических моющих средств, которые в современных условиях широко используются для обработки белья, посуды, мебели, полов и других предметов, окружающей обстановки, энтерококки не изменяют свои основные биологические свойства и сохраняют санитарно-показательное значение, как индикаторы фекального загрязнения.

Многочисленные сведения литературы свидетельствуют о том, что при энтеровирусных инфекциях в ранний период заболевания возбудители выделяются со слизистой верхних дыхательных путей человека. В последующие периоды заболевания у реконвалесцентов и окружающего больного лиц возбудители локализуются главным образом в кишечнике. В связи с этим энтеровирусы могут попадать на предметы обихода, руки обслуживающего персонала, игрушки, оборудование и другие объекты внешней среды. Загрязненные вирусами при этом предметы могут служить фактором передачи возбудителей и способствовать их дальнейшему распространению. Последнее можно отнести также к возбудителям бактериальных кишечных инфекций, в том числе к патогенным эшерихиям, занимающих значительное место в инфекционной патологии детей.

В то же время в практике пока незаслуженно мало уделяют внимания этому вопросу, что объясняется отсутствием разработанных и доступных методических приемов, а также сравнительной оценки критериев санитарно-бактериологического и вирусологического контроля предметов обихода.

На основании изложенного можно прийти к заключению, что комплексное вирусологическое и бактериологическое исследование предметов обихода, особенно детских учреждений и больниц, необходимо с целью правильной оценки гигиенического состояния окружающей человека среды, эпидемиологической ситуации и для разработки своевременных санитарно-гигиенических и противоэпидемических мероприятий.

1. Определение задач и методов исследования.

Санитарно-бактериологической контроль предметов обихода и окружающей обстановки в детских учреждениях проводится:

1) при плановых обследованиях в порядке текущего санитарного надзора - минимальная схема контроля;

2) по эпидпоказаниям - максимальная схема контроля.

Плановые обследования, наряду с определением микробной обсемененности воздушной среды, включают исследования смывов с предметов обихода, оборудования и рук персонала. При этом предусматривается определение общей микробной обсемененности изучаемых объектов, а также наличия и степени фекального загрязнения.

Наличие фекального загрязнения определяют путем исследования объектов на бактерии группы кишечной палочки (БГКП) и энтерококки. Степень фекального загрязнения определяют путем установления коли-титра изучаемых объектов и титра энтерококков.

Максимальная схема контроля, проводимая по эпидпоказаниям, должна включать, кроме определения общей и фекальной микробной загрязненности, исследование изучаемых предметов на наличие патогенных микроорганизмов. Первостепенное значение детских учреждениях имеет определение бактерий и вирусов кишечной группы. Косвенным показателем энтеровирусного загрязнения является определение кишечных бактериофагов.

При обследовании по эпидпоказаниям смывы и отпечатки производят с чистых и бывших в употреблении предметов.

2. Выбор объектов. Комплексному санитарно-вирусологическому и бактериологическому исследованию необходимо подвергать предметы обихода, в первую очередь детских учреждении: детские инфекционные больницы, где госпитализированы больные с кишечными расстройствами, детские ясли, сады и т.д. Объектами исследования являются стены, полы, подоконники, ручки дверей, обеденные и пеленальные столы, посуда, игрушки, руки обслуживающего персонала и т.д.

Частота отбора проб при плановых обследованиях составляет не реже 1 раз в месяц, по эпидпоказаниям - до и после проведения санитарно-гигиенических мероприятий, направленных на предупреждение распространения инфекционного начала.

3. Отбор проб. В настоящее время различают несколько методов отбора проб для микробиологического исследования предметов обихода.

1) Тампонный метод: увлажненным стерильной жидкостью (физиологическим раствором, водой, питательной средой и пр.) тампоном протирают исследуемую поверхность, тампон отмывают и отжимают, после чего всю жидкость высевают в питательную среду или инкубируют в термостате вместе с тампоном, если для увлажнения его использовали питательную среду.

2) Метод смыва: исследуемый предмет погружают в стерильную жидкость, тщательно встряхивают в течение 10 минут, а затем полученную смывную жидкость высевают в питательную среду.

3) Контактный метод: (или метод отпечатков) состоит в том, что полоски фильтровальной бумаги или мембранные фильтры смачивают в расплавленных 3% агаровых средах (МПА, кровяной, сахарный агар, Эндо) и после затвердевания сред (5-6 мин.) накладывают на исследуемую поверхность, слегка прижимают стерильным пинцетом и переносят в стерильные чашки Петри без среды вверх отпечатанной поверхностью. Отпечатки инкубируют в термостате при 37 град.С в течение суток. В дальнейшем проводят учет выросших колоний и их идентификацию.

4) Метод агаровой заливки: специальную металлическую форму в виде усеченного конуса (диаметр верхней окружности - 5 см, нижней - 4 см) после прожигания спиртом и остывания накладывают пинцетом на исследуемую поверхность и заливают 6-7 мл расплавленного и охлажденного до 40-45 град.С 4% МПА (для стафилокков и общей микробной обсемененности) или средой Эндо двойной концентрации (для кишечной палочки). С целью предупреждения вытекания агара кольцо плотно прижимают к исследуемой поверхности до застывания агара (1-2 минуты). В дальнейшем кольцо со средой оставляют еще ка 5-6 минут до полного затвердения питательной среды. Кольцо со средой Эндо оставляют на 9-10 мин. Затем кольцо осторожно снимают, переворачивают и находящуюся в ней агаровую пластинку легким ударом по кольцу вытряхивают в стерильную чашку Петри. После закрывания крышкой чашку помещают в термостат для выращивания дном вниз. Метод агаровой заливки позволяет изучить качественный и количественный состав выросших микроорганизмов.

Метод отпечатков и агаровой заливки особенно эффективны при незначительной бактериальной обсемененности исследуемых объектов. Метод смывов при количестве микроорганизмов 150-200 на исследуемом участке дает отрицательный результат, при содержании от 200 до 2500 - одинаковый результат с методом агаровой заливки и при 2500-3000 - метод смыва эффективен и даже лучше метода отпечатков. Метод агаровой заливки улавливает до 5-10 микробных клеток на исследуемую поверхность.

Следует подчеркнуть, что метод агаровой заливки и контактный пока непригодны для обнаружения энтеровирусов. При комплексном санитарно-вирусологическом и бактериологическом исследовании предметов обихода нельзя считать оправданным применение разнообразных методов отбора проб. Более правильным с методических позиций является однотипный отбор проб и определение в одной и той же пробе вирусологических и бактериологических показателей.

В настоящее время известно, что как в кишечнике человека, так и в сточных водах энтеровирусы и энтерофаги находятся в значительно меньших концентрациях по сравнению с кишечной палочкой - в соотношении 1 : 3 : 6 log. В связи с этим и на поверхности окружающей обстановки вирусы могут встречаться в незначительных количествах. Все это диктует необходимость использования методов концентрации микрофлоры при санитарно-вирусологическом исследовании предметов обихода.

В настоящее время может быть рекомендована следующая поэтапная методика комплексного вирусологического и бактериологического исследования предметов обихода. В лаборатории накануне заготовляют в бумажных пакетах стерильные ватные тампоны или марлевые салфетки размером 3X3 см. Для увлажнения поверхностей можно использовать автоклавированную водопроводную воду, разлитую в пробирки по 10 мл. Водопроводная вода имеет некоторые преимущества по сравнению с дистиллированной водой и другими окрашенными жидкостями (например, среда 199 и др.). Благодаря наличию солей водопроводная вода обладает буферностью и не окрашивает белье и предметы обихода при отборе проб. Кроме того, в стерильной водопроводной воде хорошо сохраняется не только вирусная, но и бактериальная микрофлора, что необходимо учитывать при проведении комплексного санитарно-вирусологического и бактериологического контроля.

Если ставится задача по выделению только энтеровирусов с предметов обихода, в качестве увлажняющей жидкости следует применять фосфатно-буферный раствор Хэнкса с рН-8,0. В щелочной среде, как известно, энтеровирусы лучше десорбируются и сравнительно долго остаются жизнеспособными.

Важно еще раз подчеркнуть, что при плановых исследованиях с целью получения сравнимых результатов методика отбора проб должна быть одинаковой.

В местах обследования тампоны или салфетки захватывают профламбированным пинцетом, увлажняют стерильной жидкостью из пробирок и после протирания исследуемого объекта помещают в ту же пробирку, которую маркируют;

Смывы с крупного инвентаря (столы, манежи, стулья и т.д.) берут с поверхности в 100 кв.см, используя стерильный шаблон. Избранную поверхность, ограниченную шаблоном, тщательно протирают увлажненным тампоном во взаимно перпендикулярных направлениях. После отбора пробы тампон, как и в предыдущем случае, вкладывают в пробирку.

С мелких предметов (игрушки, посуда) смывы берут путем обтирания одним тампоном всей поверхности трех одноименных предметов. При исследовании чашек и тарелок протирают тампоном внутреннюю поверхность и верхний наружный край шириной в 2 см.

При однократном отборе получают по 5-10 одноименных проб, которые смешивают в лаборатории в один средний образец объемом з 30-80 мл.

Для получения смывов с рук персонала протирают увлажненным тампоном тыл кисти, ладонные поверхности обеих рук, затем межпальцевые пространства, ногти, ногтевые ложа и подногтевые пространства.

4. Предварительная обработка полученных смывов. С целью обработки материала и концентрации в нем вирусов отобранные пробы сразу же доставляют в лабораторию и в тот же день их обрабатывают. До обработки пробы можно хранить не более 1-2 часов в холодильнике при температуре +4+6 град.С. Затем смеси одноименных проб с тампонами переносят в стерильные флаконы, которые для десорбции микрофлоры встряхивают в течение 20 минут в шюттель-аппарате или вручную - 10 мин. Полученную жидкость используют без дальнейшей обработки для санитарно-бактериологических исследований (3-5 мл).

При вирусологических анализах оставшийся объем смывов подвергают концентрации путем фильтрации через колонки (бюретки) с анионитом ЭДЭ-10П(*). Предварительно анионит обрабатывают для освобождения от посторонних примесей, а также для зарядки в гидроксильную форму. С этой целью анионит помещают для набухания на сутки в насыщенный раствор поваренной соли из расчета 30 мл раствора на каждый грамм смолы. Затем насыщенный раствор сливают и прибавляют в таком же объеме 2%, раствор соляной кислоты на 3-4 часа. По истечении указанного срока раствор кислоты заменяют новой порцией и загружают колонку с анионитом из расчета 8 грамм анионита на одну колонку объемом в 100 мл. В колонке анионит дополнительно промывают 10-ю объемами дистиллированной воды, а затем обрабатывают растворами щелочи с повышающейся концентрацией (5% и 10%). В завершение анионит промывают дистиллированной водой до постоянной нейтральной реакции фильтра, определяемой колориметрическим методом (индикаторные бумажки и др.).

Фильтрацию смывов на анионите проводят со скоростью 1,5-2 мл в мин. При больших скоростях фильтрации возможно неполная адсорбция вирусов на анионите и "проскок" их в фильтрат. После фильтрации всего объема жидкости в колонку сразу добавляют 13 мл элюирующей жидкости. В качестве последней применяют 0,1 М раствор поваренной соли в 0,04 М фосфатно-буферном растворе с рН-7,4. Элюцию вирусов необходимо осуществлять с той же скоростью, что и фильтрацию. Первые 3 мл элюирующего раствора сливают, а для исследования собирают в стерильные флакончики последующие 10 мл элюата.

Работа с анионитовыми колонками должна проводиться с соблюдением правил, исключающих возможность привнесения дополнительного загрязнения и распространения патогенной микрофлоры, содержащейся в смывах.

Колонки с анионитами используют повторно в течение длительного времени - от нескольких месяцев до 1 года. С этой целью после каждого использования анионит ЭДЭ-10П регенерируют путем промывания колонок 300-500 мл 0,85%, 3% и 5% растворами поваренной соли, а затем 1% раствором едкой щелочи для восстановления ионообменной активности. Заканчивают регенерацию анионита промыванием дистиллированной водой до постоянной нейтральной реакции промывных вод.

5. Определение санитарно-вирусологических показателей (кишечных бактериофагов). Концентрированные пробы (элюаты из анионитов) исследуют на наличие кишечных, бактериофагов без предварительного обогащения в мясо-пептонном бульоне.

Как показали наши многолетние исследования (1962-76 гг.), наличие кишечных бактериофагов в сточных водах, водоемах и почве имеет санитарно-показательное значение в отношении возможного загрязнения энтеровирусами. Присутствие кишечных бактериофагов на предметах обихода детских учреждений, больниц также чаще констатируется в случаях выделения энтеровирусов.

Энтерофаги как и энтеровирусы являются более устойчивыми по сравнению с кишечными палочками к действию поверхностно-активных веществ (ПАВ) и изготовленных на их основе синтетических моющих средств (СМС). Последние широко применяются в быту, лечебных, профилактических и детских учреждениях для стирки белья, мойки и обеззараживания предметов обихода. Следовательно, в современных условиях химической обработки СМС предметов обихода и оборудования энтерофаги сохраняют санитарно-вирусологическое значение. При этом следует помнить, что такие анализы являются ориентировочными, предварительными и не исключают необходимость дальнейших исследований на наличие энтеровирусов. В то же время простота и доступность выполнения позволяет рекомендовать их для широкого использования в практических бактериологических и вирусологических лабораториях.

Определение в смывах кишечных бактериофагов можно проводить как поверхностными посевами, так и методами агаровых слоев. Первый метод является более простым, но менее четким. С этой целью накануне опыта заготовляют чашки с 2% мясо-пептонным агаром и отсевают в пробирки с мясо-пептонным бульоном культуры бактерий кишечной группы. При подборе тест-культур, по отношению к которым желают определить наличие бактериофагов, необходимо учитывать эпидситуацию населенного пункта и обследуемых детских учреждений, циркулирующие среди населения патогенные виды бактерий. В исследованиях необходимо использовать как свежевыделенные, так и музейные штаммы шигелл Зонне, Флекснера, сальмонелл, патогенных и непатогенных эшерихий.

В день опыта на предварительно подсушенные чашки с МПА наносят по 0,1 мл концентрированных смывов и 2-3 капли молодых тест-культур. Смесь шпателем распределяют по поверхности среды, чашки подсушивают в термостате под бумажными дисками и инкубируют при 37 град. в течение 5-7 часов. Сроки инкубации можно увеличить до 16-18 часов, однако это уменьшает четкость негативных колоний фага (БОЕ - бляшкообразующих единиц) за счет роста сопутствующей микрофлоры.

Для метода агаровых слоев по Грациа (М.Д.Гольфарб, 1961) накануне заготовляют чашки с 3% МПА, бульонные суточные тест-культуры энтеробактерий и 0,7% МПА во флаконе. В день опыта в стерильные пробирки вносят по 0,1 и 1 мл материала из каждой концентрированной пробы. Туда же прибавляют по 2-3 капли соответствующих тест-культур и 5-7 мл расплавленного и охлажденного 0,7% МПА. После перемешивания смесь из пробирок выливают в чашки с 3% МПА (наслаивают второй слой). После застывания чашки переносят в термостат при 37 град. Через 7-8 часов производят предварительный учет результатов, а через 16-18 часов - окончательный учет.

В обоих методах результат выражают количеством БОЕ фагов в единице объема смыва. Оценка предметов обихода по наличию энтерофагов представлена в таблице. Чистые предметы не должны в 1 мл смыва содержать БОЕ энтерофагов. При обнаружении в 1 мл смыва в 1-3 БОЕ фагов предметы обихода расцениваются как умеренно загрязненные, более 3 БОЕ фага - как сильно загрязненные, в которых могут быть и энтеровирусы. Обнаружение в одной пробе нескольких разновидностей энтерофагов увеличивает возможность загрязнения и обнаружения энтеровирусов.

6. Исследования на энтеровирусы. Пробы после определения бактериофагов обрабатывают антибиотиками и эфиром из расчета на каждый мл материала 1000 ед. пенициллина и стрептомицина, 200 ед. нистатина и 0,1 мл эфира. После встряхивания пробы выдерживают при 4-6 град.С под ватными пробками в течение суток для испарения эфира. Затем меняют ватные пробки на резиновые и засевают в пробирки с МПА и МПБ с целью контроля на бактериальное загрязнение. При наличии последнего проводят повторную обработку материала и контрольный высев. Обработанные антибиотиками и эфиром пробы хранят до заражения в замороженном состоянии при - 16-20 град.С.