Відповідно до статті 7 Закону України "Про ветеринарну медицину", Положення про Державний комітет ветеринарної медицини України, затвердженого постановою Кабінету Міністрів України від 30 серпня 2007 року N 1075, з метою забезпечення епізоотичного благополуччя в Україні

1. Затвердити Методичні вказівки з діагностики сапу, що додаються.

2. Управлінню забезпечення протиепізоотичної роботи (Мороз Д.А.) забезпечити його надсилання головним управлінням ветеринарної медицини в Автономній Республіці Крим, областях, містах Києві та Севастополі.

3. Начальникам головних управлінь ветеринарної медицини в Автономній Республіці Крим, областях, містах Києві та Севастополі довести зазначені Методичні вказівки з діагностики сапу до відома територіальних органів Державного комітету ветеринарної медицини та забезпечити контроль за їх виконанням.

4. Цей наказ набирає чинності з дня офіційного опублікування.

5. Контроль за виконанням цього наказу покласти на начальника управління забезпечення протиепізоотичної роботи Держкомветмедицини Мороза Д.А.

1.1. При проведенні клінічного огляду звертають увагу на стан шкіряного покрову, поверхневих лімфатичних вузлів і судин, слизової оболонки носової порожнини, загальний стан здоров'я тварини.

По клінічному перебігу хвороби розрізняють сап носовий, шкіряний і легеневий. Іноді всі три клінічні форми можуть бути виражені одночасно.

1.1.1. При носовому сапі на слизовій оболонці носової порожнини з'являються дрібні жовтуваті вузлики, обведені червоним колом. На їх місці утворюються характерні виразки і зірчасті рубці.

Розвиток виразок супроводжується гнійними виділеннями з носу іноді з домішками крові, а також підпуханням підщелепових лімфатичних вузлів.

1.1.2. При сапних, поверхневих ураженнях шкіри спостерігають пустули, виразки з гнійним вмістом або заповнені грануляційною тканиною.

При неглибоких ураженнях в товщі шкіри виявляють тверді вузлики з гнійно-некротичним вмістом на розрізі, виразки чи рубці, які можуть бути розміщені по ходу лімфатичних судин.

1.1.3. При ураженнях легенів спостерігають глухий кашель, швидку втомлюваність тварини, періодичні підйоми температури тіла вище 38,5 град.С.

Для алергічного дослідження на сап застосовують малеїн, що являє собою стерильний культуральний фільтрат з вузлика сапу, вирощеного на рідкому поживному середовищі.

При діагностиці хвороби застосовують очну і підшкірну малеїнові проби.

2.1. Очна малеїнова проба.

2.1.1. Протягом доби перед проведенням дослідження коні, віслюки, мули, лошаки, верблюди повинні бути звільнені від фізичного навантаження і утримуватись на прив'язі. Дослідження тварин, що мають кон'юнктивіти і інші захворювання очей, очною пробою не проводять.

За допомогою очної піпетки досліджуваним тваринам наносять 3 - 4 краплі малеїну на кон'юнктиву одного ока при відтягнутому нижньому віці. Облік реакції проводять через 3, 6, 9, 12 і 24 години шляхом огляду слизової оболонки ока.

Позитивна реакція характеризується довготривалою або короткотривалою гіперемією і опуханням кон'юнктиви різного ступеня з гнійними виділеннями з внутрішньої частини ока або накопиченням гною в кон'юнктивальному мішку.

Реакцію вважають негативною при відсутності будь-яких змін або при слабому почервонінні кон'юнктиви і сльозотечі.

2.1.2. Через 5 - 6 діб тваринам, не реагуючим на першу аплікацію алергену, препарат наносять другий раз в тій же дозі на кон'юнктиву того ж ока.

Облік реакції проводять як вказано в п. 2.1.1.

2.2. Підшкірна малеїнова проба.

2.2.1. Підшкірну малеїнову пробу застосовують не раніше 45 днів після попередньої підшкірної проби. Перед її проведенням тварин витримують на прив'язі не менше доби і поять підігрітою водою, проводять термометрію через 7 - 8, 14 - 15, 21 - 24 годин.

Дослідження тварин з короткочасним або довготривалим підвищенням температури до 39 град.С і вище підшкірною малеїновою пробою не проводять.

2.2.2. Здоровим тваринам малеїн вводять підшкірно в ділянці підгрудка в дозі 1 куб.см.

Облік температури тіла і реакцію в місці введення алергену проводять через 6 - 8, 10 - 12, 14 - 16, 20 - 24 і 30 - 36 годин. Позитивна реакція характеризується поступовим підвищенням температури до 39,6 град.С і вище та повільним її спадом з можливим повторним підвищенням через 30 - 36 годин, а також утворенням на місці введення малеїну припухлості різного ступеня вираженості.

Реакцію вважають негативною при нормальній температурі тіла або короткочасному підвищенні не вище 39,5 град.С і відсутністю змін в місці введення малеїну.

Лабораторні дослідження на сап проводять у лабораторіях, які мають дозвіл на роботу зі збудниками 2 - 4 групи патогенності.

3.1. Пластинчата реакція аглютинації (РА) з сапним кольоровим антигеном.

3.1.1. Антиген сапний кольоровий для пластинчатої РА являє собою гомогенну суспензію в буферному розчині інактивованої забарвленої культури збудника сапу. При зберіганні допускається утворення осаду, що перетворюється в гомогенну суспензію при струшуванні. Перед використанням флакони з антигеном витримують протягом 15 - 20 хвилин при температурі 18 - 30 град.С і струшують.

3.1.1.2. Досліджувана сироватка крові коней нативна або консервована.

Консервування сироватки крові проводять кристалами борної кислоти (2 - 4% до об'єму сироватки) до отримання насиченого розчину або шляхом одноразового заморожування.

Неконсервована сироватка крові придатна для дослідження протягом 5 діб з дня взяття із збереженням її при температурі 4 - 8 град.С. Сироватка, консервована борною кислотою, придатна для дослідження протягом 10 діб, заморожена сироватка - протягом 3 діб після одноразового розморожування.

Дослідженню на сап не підлягають мутні, гемолізовані сироватки крові.

3.1.1.3. Сироватка сапна для РА і РЗК (позитивна сироватка) виготовляється на біопідприємствах.

3.1.1.4. Сироватка крові коней неспецифічна неконсервована (негативна сироватка) виготовляється на біопідприємствах.

3.1.1.5. Фізіологічний розчин - 0,85% розчин хлориду натрію з pH 6,8 - 7,2. Корекцію pH проводять 10% розчином соляної кислоти або 10% розчином гідроокису натрію.

3.1.2. Постановка РА.

Реакцію проводять при температурі 18 - 30 град.С на чистих сухих металевих емальованих пластинках з лунками. На краях пластинки проти кожної лунки записують номер досліджуваної сироватки крові.

Спочатку ставлять контроль антигену з позитивною і з негативною сапними сироватками крові коней, а також контроль антигену на спонтанну аглютинацію (до 0,03 куб.см антигену додають 0,03 куб.см сироватки або фізіологічного розчину). Досліджувані сироватки крові в дозі 0,03 куб.см вносять на дно лунки за допомогою дозатора (піпетки). В кожну лунку поряд із сироваткою дозатором вносять 0,03 куб.см антигену. Потім антиген в кожній лунці змішують з сироваткою ручним змішувачем до отримання однорідної суміші, розмішуючи її по всій поверхні лунки. Пластинку з сироватками і антигеном погойдують протягом 4 хвилин обережними круговими рухами вручну або за допомогою апарату для погойдування діагностичних пластинок.

3.1.3. Облік результатів реакції проводять візуально через 4 хвилини після змішування сироватки крові з антигеном при злегка нахиленому положенні пластинки. Реакцію вважають позитивною при наявності чітко вираженої аглютинації забарвлених сапних бактерій антигену у вигляді дрібних чи великих пластівців при 75 - 100% просвітленні рідини (3 - 4 хрести). Реакцію вважають негативною при оцінці менше (3 - 4 хрестів).

++++ (4 хрести) - виражена аглютинація у вигляді великих пластівців рожевого кольору з повним просвітленням рідини;

+++ (3 хрести) - незначні пластівці з неповним (75%) просвітленням рідини;

++ (2 хрести) - аглютинат у вигляді дрібних пластівців, з неповним (50%) просвітленням рідини;

+ (1 хрест) - дрібно зернистий аглютинат, з неповним (25%) просвітленням рідини;

- (мінус) - відсутність аглютинації, суміш гомогенна, рівномірно забарвлена.

3.1.4. Після обліку реакції пластинки і змішувач дезинфікують занурюючи їх на 5 хвилин в 1% розчин хлораміну або віркону, потім миють у миючому розчині, споліскують в проточній потім в дистильованій воді, висушують і використовують повторно.

3.2. Реакція зв'язування комплементу (РЗК).

3.2.1. Компоненти реакції.

3.2.1.1. Антиген сапний для РЗК.

3.2.1.2. Досліджувана сироватка крові коней, нативна або консервована (п. 3.1.1.2).

3.2.1.3. Сироватка сапна для РА і РЗК (позитивна сироватка).

3.2.1.4. Сироватка крові коней неспецифічна, неконсервована (негативна сироватка) виготовляється на біопідприємствах.

3.2.1.5. Сироватка гемолітична для РЗК, виготовлена на біопідприємствах.

3.2.1.6. Комплемент сухий для РЗК, виготовлений на біопідприємствах.

3.2.1.7. Фізіологічний розчин (по п. 3.1.1.5).

3.2.1.8. 2,5% суспензія еритроцитів барана у фізіологічному розчині. Кров у барана беруть вранці до годівлі, з яремної вени у флакон з скляними або металевими бусами, при цьому струшують протягом 7 - 10 хвилин або консервують розчином Альсівера. Еритроцити шляхом центрифугування при 2,5 - 3 тис.об./хв. відмивають фізіологічним розчином до повного знебарвлення промивної рідини. Із осаду еритроцитів готують 2,5% суспензію у фізіологічному розчині.

3.2.2. Титрування гемолітичної сироватки (гемолізину).

Титрування гемолізину проводять один раз у три місяці, а також при використанні нової серії. Із основного розведення гемолізину 1:100 (0,1 куб.см гемолізину і 9,9 куб.см фізіологічного розчину) готують такі розведення (табл. 1).

Після чого по 0,2 куб.см кожного розведення переносять в ряд пробірок, в кожну пробірку добавляють по 0,2 куб.см комплементу в розведенні 1:20, 0,2 куб.см 2,5% суміші еритроцитів і 0,4 куб.см фізіологічного розчину. Штатив з пробірками струшують і ставлять на 10 хвилин у водяну баню при температурі 37 - 38 град.С.

Титром гемолізину вважають найбільше його розведення, при якому спостерігається повний гемоліз еритроцитів.

3.2.3. Приготування гемолітичної системи.

Гемолітичну систему готують змішуванням в рівних об'ємах: 2,5% суміші еритроцитів барана та гемолітичної сироватки (гемолізин у подвоєному титрі).

Наприклад, при титрі гемолізину 1:1000 беруть 2:1000, тобто для приготування 100 куб.см гемолізину беруть 0,2 куб.см гемолізину з ампули і розводять в 99,8 куб.см фізіологічного розчину. Отримані 100 куб.см розчину гемолізину змішують з 100 куб.см суміші еритроцитів. Гемолітичну систему поміщають на 20 хвилин у водяну баню при температурі 37 - 38 град.С для сенсибілізації еритроцитів.

3.2.4. Титрування комплементу.

Перед постановкою головного дослідження проводять титрування комплементу у бактеріолітичній системі з позитивною сапною і негативною сироватками та 1 - 2 сироватками з досліджуваної партії.

Позитивну, негативну сироватку та сироватку з партії розводять 1:10 фізіологічним розчином (1 куб.см сироватки та 9 куб.см фізіологічного розчину) та інактивують при температурі 60 - 62 град.С протягом 30 хвилин і розливають по 0,2 куб.см в два ряди по десять пробірок.

Відбирають необхідну для даного об'єму досліджень кількість ампул (флаконів) з комплементом, розчиняють препарат у фізіологічному розчині, кількість якого вказана на ампулі (флаконі), зливають в одну ємність і перемішують. Таким чином отримують основний розчин комплементу, який зберігають в холодильнику протягом постановки реакції. З цього розчину готують розведення 1:20 для титрування.

Для розведення комплементу беруть додатковий ряд пробірок, в яких готують попереднє розведення комплементу, але об'єм збільшують в 10 раз. Потім дозатором переносять по 0,2 куб.см розведеного комплементу у всі пробірки кожного ряду і вносять інші інгредієнти, як вказано в таблиці 2.