Відповідно до вимог статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення" та з метою науково-методичного забезпечення діяльності державної санітарно-епідеміологічної служби з питань проведення державного соціально-гігієнічного моніторингу

1. Затвердити методичні рекомендації "Обстеження та районування території за ступенем впливу антропогенних чинників на стан об'єктів довкілля з використанням цитогенетичних методів" (додаються).

2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров'я України довести цей наказ до відома керівників міністерств та інших центральних органів виконавчої влади, установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби.

3. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Пономаренка А.М.

1.1. У зв'язку з забрудненням навколишнього середовища речовинами, що мають мутагенні властивості (далі - мутагени), і впливом несприятливої екологічної ситуації на здоров'я населення назріла необхідність розроблення методичних рекомендацій, призначених для дослідження стану об'єктів довкілля за токсико-мутагенним фоном.

Методичні рекомендації призначені для лікарів, співробітників науково-дослідних установ, які займаються контролем забруднення довкілля, джерелами техногенної дії на навколишнє природне середовище, а також встановленням причинно-наслідкових зв'язків між станом здоров'я населення та впливом на нього факторів життєдіяльності людини.

1.2. Методичні рекомендації розроблені з метою реалізації положень постанов Кабінету Міністрів України від 30.03.98 N 391 "Про затвердження Положення про державну систему моніторингу довкілля", від 28.12.2000 N 1907 "Про моніторинг стану здоров'я населення, діяльності та ресурсного забезпечення закладів охорони здоров'я", від 22.02.2006 N 182 "Про затвердження Порядку проведення державного соціально-гігієнічного моніторингу" та наказів Міністерства охорони здоров'я України від 11.03.99 N 57 "Про реалізацію Цільової комплексної програми генетичного моніторингу", від 22.03.2006 N 144 "Про виконання постанови Кабінету Міністрів України від 22.03.2006 N 182" та інших нормативно-правових актів з питань моніторингу довкілля та стану здоров'я населення і рекомендують процедуру оцінки токсико-мутагенної активності об'єктів довкілля, за результатами якої можуть бути розроблені реабілітаційні заходи, спрямовані на поліпшення стану навколишнього середовища та здоров'я людини.

1.3. Методичні рекомендації є основою для складання програм спостережень, аналізу даних, характеристики екологічного стану природних і техногенних об'єктів довкілля за токсико-мутагенним фоном. Методи дослідження, запропоновані в методичних рекомендаціях, дозволяють за допомогою цитогенетичних методів біотестування швидко оцінити сумарну дію всієї сукупності забруднювачів біосфери, які впливають на стан довкілля і здоров'я людини, на науковій основі спрогнозувати очікувані зміни в екосистемах і соціумі та своєчасно прийняти управлінські рішення щодо покращення якості довкілля, здоров'я і генофонду нації. Крім того, можливо установити не тільки наслідки техногенезу, але й визначити ефективність заходів з екологізації технологій, які впроваджуються в промисловість та сільське господарство.

1.4. Впровадження методів, наведених в методичних рекомендаціях, в комплексний соціально-гігієнічний моніторинг України надасть можливість сформувати банк даних, необхідних для розробки екологічних карт за показниками, що характеризують загальну токсичність та мутагенність об'єктів навколишнього середовища. Наведені методи дозволяють вирішити проблеми екологічного нормування за цитогенетичними показниками біоіндикаторів, а також оцінити екологічний та генетичний ризики для біоти та людини. Аналіз результатів моніторингу стану довкілля надасть можливість на науковій основі здійснювати екологічне та соціальне управління і сприяти поступовому переходу до сталого розвитку окремих територій і держави в цілому.

1.5. У цих методичних рекомендаціях терміни і поняття вживаються у такому значенні:

Allium-тест - тест на кластогенність, у якому як матеріал використовується коренева меристема паростків ріпчастої цибулі Allium cepa L.

Аберація хромосом - зміни у структурі хромосом, викликані перекомбінацією різних ділянок однієї чи різних хромосом під впливом мутагенів.

Адаптація - сукупність особливостей організму (виду), що забезпечує можливість життя в конкретних умовах зовнішнього середовища.

Анафазні аберації - група хромосомних мутацій, пов'язаних з порушенням руху хромосом під час ділення клітин.

Біоіндикатори - група чи популяція особин одного виду, за станом або поведінкою яких визначають зміни у стані довкілля, а також про наявність та інтенсивність його забруднення.

Біоіндикація - оцінка стану довкілля за станом його біоти в природних умовах.

Екологічний ризик - вірогідність навмисних або випадкових, поступових та катастрофічних антропогенних змін існуючих природних об'єктів, факторів та екологічних ресурсів.

Забруднення екосистем - привнесення у середовище чи виникнення в ньому нових, як правило, не характерних для нього фізичних, хімічних, інформаційних чи біологічних агентів або перевищення у даний проміжок часу природного багаторічного рівня концентрації перерахованих агентів в середовищі.

Мікроядерний тест - метод визначення мутагенної активності факторів зовнішнього середовища, полягає у визначенні частоти інтерфазних клітин з мікроядрами.

Мітотичний індекс - кількість клітин, що знаходяться у фазі мітозу. Застосовується для оцінки мітотичної активності тканин, а також як з тестів при аналізі мутагенів.

Мутаген - фізичний, хімічний або біологічний фактор, який має здатність викликати спадкові зміни у структурі молекули ДНК.

Мутагенний фон - сукупність фізичних, хімічних та біологічних факторів природного чи антропогенного походження, сумарний вплив яких визначає рівень мутаційної мінливості організмів на даній території.

Мутагенність - здатність викликати мутації.

Пилок - сукупність пилкових клітин, що утворюються в мікроспорангіях.

Пилкове зерно - чоловічий гаметофіт насінної рослини, що розвивається з мікроспори.

Стерильність - нездатність або знижена здатність організму продукувати нормальні гамети.

Токсико-мутагенний фон визначають за токсичними і мутагенними проявами у клітинах біоіндикаторів, що виникають під впливом шкідливих факторів, присутніх у навколишньому середовищі.

Токсичність - здатність окремих факторів хімічної та біологічної природи чинити негативний вплив на різні організми.

Частота мутацій - кількісний показник інтенсивності мутаційного процесу.

Якість природного середовища - стан природних та трансформованих людиною екосистем, що зберігає їх здатність до постійного обміну речовин та енергії, а також відтворенню життя.

2.1. Методи визначення рівнів токсико-мутагенної активності об'єктів навколишнього середовища (води, ґрунтів, атмосферного повітря, відходів) ґрунтуються на встановленні різниці між значеннями цитогенетичних показників (стерильність пилку індикаторних рослин, мітотичний індекс та частота аберантних хромосом в кореневій меристемі, частота клітин з мікроядрами в епітеліоцитах ротової порожнини дітей дошкільного віку), у біоіндикаторів, що аналізуються (дослід), та аналогічними показниками в екологічно чистих умовах, або на воді чи ґрунті, які не містять токсичних і мутагенних речових (контроль).

2.2. Критерієм токсичності є відсоток зниження показників росту біоіндикаторів та величини мітотичного індексу в меристематичних клітинах у дослідах порівняно з контролем за 48 годин у Allium cepa L, 72 години у Rapanus sativus L. і 120 годин у Triticum durum L.

2.3. Критерієм мутагенності є збільшення частоти зустрічальності стерильних клітин пилку і клітин з аберантними хромосомами в кореневій меристемі індикаторних рослин, а також клітин з мікроядрами серед епітеліоцитів ротової порожнини у дітей дошкільного віку.

2.4. В методичних рекомендаціях пропонується структурна схема комплексного соціально-гігієнічного моніторингу довкілля, яка дозволяє оцінити стан природних об'єктів за токсико-мутагенним фоном, що є необхідним для визначення рівня загальної екологічної та генетичної небезпеки для людини та біоти (рис. 1).

Як видно із схеми, верхній структурний рівень показника включає три показника екологічного стану окремих об'єктів навколишнього середовища (атмосфери, гідросфери та педосфери) за токсико-мутагенним фоном.

Стан атмосферного повітря і території в цілому визначають за тестами: "Стерильність пилку рослин", "Мікроядерний тест" в соматичних клітинах дітей дошкільного віку, які мешкають на території дослідження, та "Ростовий фіто-тест".

Стан гідросфери та педосфери (ґрунтів) визначають за Allium-тестом та "Ростовим тестом".

2.5. Показники, що характеризують стан навколишнього середовища за токсико-мутагенним фоном, можуть бути застосовані для подальшого визначення загального екологічного та генетичного ризиків для людини та біоти, встановити еколого-оптимальні нормативи якості довкілля та здоров'я населення, розробити шляхи досягнення цих нормативів, визначити пріоритети при прийнятті вірних управлінських рішень.

Рис. 1. Структурна схема соціально-гігієнічного моніторингу об'єктів довкілля

3.1. Вибір тест-полігонів

Для проведення соціально-гігієнічного моніторингу довкілля на досліджуваній території повинні бути виділені тест-полігони. Тест-полігони вибираються таким чином, щоб в першу чергу були досліджені найбільш небезпечні та надзвичайно техногенно навантажені райони. Відбір проб проводять як в промислових зонах, так і в житлових масивах, віддалених від підприємств.

3.1.1. Загальні вимоги до відбору проб грунтів

Відбір проб здійснюється згідно ГОСТ 17.4.3.01-83 Охорона природи. хрунти. Загальні вимоги до відбору проб, та 28168-89 ґрунти. Такі методи відбору проб ґрунту застосовуються при агрохімічному обстеженні, загальному та локальному забрудненнях, навколо підприємств-забруднювачів, поблизу автомобільних трас тощо.

При загальному забрудненні ґрунтів ділянки для відбору зразків ґрунту вибирають у відповідності з координатною сіткою, указуючи номер і координати.

При локальному забрудненні ґрунтів для визначення пробних ділянок використовують систему концентричних кіл, розташованих на диференційованих відстанях від джерела забруднення, указуючи номера кіл і азимут місця відбору зразків.

При дослідженні забруднень ґрунтів проби відбирають пошарово з глибини 0-5; 0-20; 21-40; 41-60 см, в залежності від мети дослідження. Крім того, визначається необхідний розмір досліджуваної ділянки, кількість і вид проби.

Максимально допустимі розміри досліджуваних ділянок визначаються в залежності від економічних районів країни: в Поліссі - 8 га, Лісостеповій зоні - 25 га, в Степовій - 40 га. В середньому розмір ділянки в Україні дорівнює приблизно 25 га. Для визначення у ґрунтах хімічних речовин розмір ділянки для відбору зразків коливається від 1 до 5 га, де відбирають не менш однієї об'єднаної проби, маса якої не повинна бути менше 400 г.

3.1.2. Обстеження земель навколо підприємств-забруднювачів та поблизу автомобільних трас

Обстеження земель навколо підприємств-забруднювачів та поблизу автомобільних трас проводиться згідно Методики суцільного грунтово-агрохімічного моніторингу сільськогосподарських угідь України.

Навколо підприємств-забруднювачів обстеження земель проводиться за системою концентричних кіл, розташованих на відстані 0,5; 1; 1,5; 2,5; 5; 10 км від джерела забруднення з урахуванням пануючих вітрів.

В методиці відбору проб ґрунту з ділянок уздовж дорожніх смуг, розташованих поблизу автомобільних магістралей, враховується те, що газопиловий струмінь автотранспорту викидається в повітря не високо над ґрунтом, а відстань переносу викидних газів, в тому числі й аерозолів важких металів, сажі та інших речовин, не перевищує 100 м в напрямках дії пануючих вітрів.

Ділянки для відбору зразків довжиною 200-500 м розмічають на відстанях 0-10, 10-50 і 50-100 м від полотна дороги, враховуючи рельєф, ґрунтовий і рослинний покрив, гідрологічні умови місцевості. На кожній із них відбирають 20-25 індивідуальних зразків для отримання змішаного (середнього) зразка ґрунту.

3.1.3. Відбір ґрунтів для цитогенетичних досліджень

Відбір ґрунтів при проведенні цитогенетичних досліджень здійснюється згідно методичних рекомендацій "Еколого-генетичний контроль за застосуванням пестицидів-мутагенів".

На першому етапі комплексного моніторингу навколишнього природного середовища з застосуванням цитогенетичних методів оцінки рекомендується проводити крупномасштабні рекогносцирувальні дослідження. Вони повинні бути прив'язані до стаціонарних постів спостереження Держкомгідромету та санітарно-епідеміологічної служби, а також повинні включати найбільш екологічно небезпечні і чисті території (за рекомендаціями Обласних управлінь Мінприроди України та санітарно-епідеміологічної служби).

В подальшому проводиться перехід до середньо- та маломасштабних досліджень щодо оцінки стану ґрунтів та інших об'єктів навколишнього середовища за сумарним токсико-мутагенним фоном. Такі дослідження, як правило, завершуються картографуванням території за даною ознакою.

Крупномасштабне картографування дозволяє встановити орієнтовані рівні мутагенного фону, а середньо- та маломасштабне картографування - диференціювати райони усередині окремих регіонів за ступенем мутагенного впливу та виявити джерела мутагенного впливу на одиницю площі. При крупномасштабному картографуванні за одиницю площі рекомендується ділянка розміром 10 000 кв. км. При середньо- та мало-масштабному - 1 000 і 100 кв. км, відповідно. На кожній одиниці площі повинно бути не менш 10 пунктів спостереження.

У випадку характеристики впливу окремих джерел забруднень (підприємств, електростанцій та ін.) на об'єкти навколишнього середовища рекомендовано застосовувати метод концентричних кіл через кожні 500 м до 2,5 км.

При оцінці екологічного стану міста з населенням 1 млн. чоловік рекомендовано поділити його територію на 20 квадратів з виділенням у кожному від 10 до 20 пунктів спостережень в залежності від рівня екологічної напруженості. В кожному пункті проба відбирається за правилом "конверта". Сторона конверта може складати 10-100 м. Об'єднана проба ґрунту формується із 9-12 проб, вміщується у відповідну тару, складається у ящик, ставиться печатка та наклеюється етикетка. На відібрані зразки складається супровідна відомість за формою, наведеною у додатку 1.

Періодичність обстеження ґрунтів встановлюється диференційовано з урахуванням особливостей території в середньому через кожні 5 років. Вказаний строк може бути збільшений, якщо різниця між показниками за циклами обстеження неістотна.

3.1.4. Відбір проб з водних джерел

Зразки з водних джерел (річки, озера тощо) відбираються на відстані 3-5 м від берега в чисті скляні пляшки і зберігаються у холодильнику до проведення дослідів. Якщо проби відбирають зі свердловин, то зразок води беруть у пляшки після 1-2-хвилинного зливу води. На зразках водних проб пророщують біоіндикаторні рослини і проводять цитогенетичні дослідження.

3.1.5. Відбір проб пилку рослин

Відбір пилку кожного досліджуваного виду рослин проводиться одночасно в усіх точках спостереження. З кожної моніторингової точки у суху погоду збирають добре розвинуті, готові до розкриття бутони квітів від 30 рослин кожного виду, досліджують від 1 000 до 3 000 клітин пилку з визначенням кількості стерильних та фертильних клітин. У деревинних та чагарникових рослин відбирають біопроби із неушкоджених, здорових паростків середнього ярусу крони південної орієнтації, а у трав - з екземплярів, зростаючих у територіальному центрі мікропопуляції індикаторів. Рослини повинні бути добре розвинуті і не мати ознак пригноблення. Бутони фіксують у момент збору у 70% етанолі.

3.1.6. Відбір зразків клітин слизової оболонки ротової порожнини людини

Кожна серія досліджень повинна включати групу дітей в кількості від 25 до 60 чоловік із приблизно однаковим співвідношенням статі. У групу для обстеження повинні входити здорові та практично здорові діти 5-7-літнього віку, які відбираються за спеціальним анкетуванням (додаток 2). Мазки слизової оболонки ротової порожнини беруть з внутрішньої сторони правої і лівої щоки і нижньої губи за допомогою стерильного ватяного тампона на індивідуальній скіпі з послідуючим нанесенням їх на предметне скло. Фіксують мазки в суміші спирту 70% й оцтової кислоти 3:1 або у 96%-ному етанолі. Термін фіксації складає 1 годину. Потім мазки підсушують на повітрі до того моменту, поки не зникає блиск вологи. У такому стані препарати зберігаються до фарбування.

3.2. Оцінка мутагенності території за мікроядерним тестом

3.2.1. Для оцінки мутагенності території використовується тест "Частота епітеліоцитів з мікроядрами в слизовій оболонці ротової порожнини дітей дошкільного віку" (далі - МЯ-тест).

3.2.2. Чисельність клітин з мікроядрами характеризує ступінь забруднення навколишнього середовища мутагенами, тому що мікроядра утворюються як результат патологічного мітозу.

3.2.3. Для оцінки екологічної ситуації за загальним мутагенним фоном використовують результати цитогенетичного обстеження дітей дошкільного віку, тому що вони є найбільш чутливими до несприятливого впливу зовнішніх факторів.

Фарбування за Фьольгеном передбачає попередній гарячий гідроліз біооб'єктів він HCl з температурою 60 град. C протягом 6-8 хвилин та фарбування реактивом Шиффа 0,5-1,5 ч. Після забарвлення мазки проводять через три порції сірчаних вод по 5-10 хвилин у кожній, промивають у проточній воді та підсушують.

3.2.5. Мазки аналізують за допомогою біологічного мікроскопу при збільшенні 7 х 60. При визначенні частоти зустрічальності клітин з мікроядрами враховують їхню кількість і відносять до загального числа переглянутих клітин. У кожному варіанті аналізують не менше 1 000 клітин.

3.2.6. Мікроядерний індекс розраховують за частотою зустрічання клітин з мікроядрами за формулою:

де n - число клітин з мікроядрами;

m - загальна кількість досліджених клітин.

Потім обчислюють показник абсолютного розкиду даних, виходячи з величини відносної помилки, яку визначають за формулою:

де А - відносна помилка; 1,385 - коефіцієнт при чисельності вимірів більше 100.

Абсолютний розкид даних визначають за формулою:

Таким чином, кінцевий результат мікроядерного тестування має вигляд МЯ +- а.

3.3. Оцінка токсичності або потенційної мутагенності атмосферного повітря за тестом "Стерильність пилку рослин фітоіндикаторів"

3.3.1. Для визначення загальної токсичності (або потенційної мутагенності) повітряного басейну застосовується тест "Стерильність пилку рослин-фітоіндикаторів", що зростають на досліджуваних територіях. В якості індикаторів рекомендується застосовувати види рослин згідно додатка 3.

3.3.2. Встановлено, що фертильні і стерильні клітини пилку рослин відрізняються за вмістом крохмалю. Нормальний його вміст відповідає стадії завершення формування сперміїв. Фертильні пилкові зерна цілком заповнені крохмалем, а стерильні - не містять його чи мають його сліди. Забарвлення препаратів проводять за Грамом. Для приготування йодного розчину за Грамом необхідно 2 г йодистого калію розчинити в 5 мл дистильованої води при нагріванні, з наступним додаванням 1 г металевого йоду. Обсяг готового до використання розчину доводять до 300 мл і зберігають у темному посуді.

3.3.3. Фертильні пилкові зерна офарблюються у вохристо-коричневі кольори різної щільності, а стерильні - або майже зовсім не офарблюються, або офарблюються фрагментарно на 20-30%, здобуваючи слабкий, майже прозорий жовтий тон.

3.3.4. Зрілі бутони квіток змішаної проби після фіксації у 70 град. етанолі (або без неї) препарують на предметному склі. Тичинки відокремлюються від всіх елементів квітки за допомогою пінцету і препарувальної голки і переносять у краплю йодного розчину. Пильовики дрібних квітів розкривають препарувальною голкою на предметному склі в краплі йодного розчину і, видаливши зайві тканини, накривають покривним склом. При необхідності додають ще 1-2 краплі йодного розчину. Через 2-3 хвилини приготовлений препарат піддають мікроскопуванню.

3.3.5. У кожному препараті переглядають від 1 000 до 3 000 пилкових зерен. Підрахунок стерильних і фертильних пилкових зерен проводиться під мікроскопом (збільшення 7 х 20 чи 7 х 40) із застосуванням лічильника.

Стерильність пилкових зерен визначається у відсотках за формулою:

де М - рівень стерильності пилку, %;

G - кількість стерильних пилкових зерен;

N - кількість досліджених пилкових зерен.

Потім обчислюється помилка підрахунку:

при цьому повинна виконуватись умова 3 x m < М, у протилежному випадку необхідно збільшувати кількість спостережень, для того щоб зменшити помилку.

3.3.6. Оскільки індикаторні види рослин характеризуються різними рівнями спонтанної стерильності пилку, яка спостерігається у екологічно чистих - комфортних умовах (Пкомф.) і різними рівнями ушкодження гамет в критичних умовах (Пкрит.), була проведена класифікація індикаторів за п'ятьма класами: 1 - високостійкі; 2 - стійкі; 3 - середньостійкі (чутливі); 4 - чутливі та 5 - високочутливі. Характеристика цих класів необхідна для визначення умовних показників ушкодженості клітин пилку або індикаторних рослин за цитогенетичним статусом і подальшої інтегральної оцінки стану навколишнього середовища (додаток 4).

3.4. Оцінка токсико-мутагенного фону ґрунтів та водних джерел

Для визначення токсико-мутагенного фону ґрунтів та водних джерел застосовують такі високочутливі цитогенетичні тести, як "Мітотичний індекс" та "Частота аберантних хромосом" в клітинах кореневої меристеми фітоіндикаторів, а також "Ростовий тест" на паростках різних культур.

3.4.1. Оцінка токсичності ґрунтів та водних джерел за допомогою "Ростового тесту"

Метод використовують для визначення токсичності різних субстратів: ґрунтів, водних джерел, мулу, відходів та ін. Цей тест можна проводити в різних варіантах:

- пророщування насіння рослин на досліджуваних зразках субстратів;

- полив рослин досліджуваними рідинами при вирощуванні у пісковій або ґрунтовій культурах;

- водна культура рослин на природних, питних, стічних водах, витяжках з ґрунтів, відходів тощо;

- рулонна культура - насіння індикаторів розкладають на вологий папір, який скручують у рулон та ставлять у ємність з досліджуваною рідиною.

У якості тест-культур можна використовувати різні рослини: Allium cepa Z, Rapanus sativus L., Triticum durum L. та ін.

При дослідженні токсичності ґрунту в кожну з експериментальних ємностей вносять по 100 г субстрату, зволоженого до 70% від повної вологоємності, і висаджують по 15-20 пророслих насінь тест-культури. Дослідження проводять не менше ніж у трьох повтореннях.

При дослідженні якості проб води і водних витяжок лабораторні склянки заповнюють досліджуваною рідиною 250-500 мл. Насіння індикаторної культури вирощують на спеціальних кільцях, обтягнутих марлею, які плавають на поверхні, по 15-20 насінь на кожнім кільці. Для цього випадку найбільш придатні культури з крупним насінням. Досліди проводять в умовах фітотрону, в якому регулюються світлові та температурні режими.

Через 2 тижні проводяться виміри довжини кореневої і стеблової системи, визначається волога та суха маса паростків.

Тестування зразків ґрунту та води можна також проводити в умовах термостату при t град. = 25 град. C, в чашках Петрі, на фільтрувальному папері, на якому розміщують 30-50 насінин тест-культури, які заливають 5-7 мл досліджуваної рідини. Якщо досліджують ґрунт, у чашках на папері розміщують 1 г здрібненого ґрунту та заливають 5-7 мл вистояної кип'яченої водопровідної води. Найбільш зручними культурами є рослини з дрібним насінням. Через 48-96 години проводяться виміри довжини кореневої і стеблової системи, визначається волога та сира маса паростків.

де N - кількість результатів,

де S - знак суми.

Достовірність різниці середніх арифметичних (t) розраховується за критерієм Стьюдента-Фішера:

Фітотоксичний ефект визначається у відсотках щодо маси рослин, довжини кореневої або стеблової системи, кількості ушкоджених рослин або кількості сходів. Виходячи з кількості рослинної маси, що утворилася, фітотоксичний ефект розраховується за формулою:

3.4.2. Оцінка токсико-мутагенного фону ґрунтів та водних джерел за допомогою тестів "Мітотичний індекс" та "Частота аберантних хромосом" в клітинах кореневої меристеми індикаторів.

Для визначення токсичності та мутагенності ґрунтів широко застосовуються такі високочутливі цитогенетичні тести, як "Мітотичний індекс" та "Частота аберантних хромосом" в меристематичних клітинах фітоіндикаторів, серед яких найчастіше застосовують Allium cepa L.

На зразках ґрунту або водних джерел проводять пророщування насіння цибулі на фільтрувальному папері в чашках Петрі при температурі 25 град. C, в умовах термостату. В чашку Петрі на фільтрувальний папір насипають 1 грам висушеного та подрібненого ґрунту, який зволожують 5 мл дистильованої води та висаджують по 50 насінин індикаторної рослини. Через кожні шість годин проводять провітрювання. Дослід триває 72 години. В якості контролю використовується дистильована вода.

При появі первинних корінців довжиною 7-9 мм їх фіксують в ацетоалкоголі за Карнуа протягом 1 години, а потім переносять для зберігання у 70 град. етанол.

Фарбування препаратів проводять реактивом Шиффа за Фьольгеном (див. пункт 3.2.4). Цитологічні препарати готують з 1 мм кінчиків корінців (меристем), поміщених у краплю 45%-ної оцтової кислоти. Препарат накривають покривним склом, роздавлюють меристеми до отримання монослою клітин. Краї покривного скла заливають розплавленим парафіном. Приготовлений таким чином препарат використовують для мікроскопічного аналізу зі збільшенням 7 х 60.

На цитологічних препаратах ураховують усі фігури мітозу: профази, метафази, анафази, телофази, що зустрічаються серед 5-6 тисяч переглянутих меристематичних клітин.

Величину мітотичного індексу визначають як відношення кількості клітин, що діляться, до загальної кількості переглянутих меристематичних клітин та виражають у проміле:

де n - кількість досліджуваних клітин;

m - кількість клітин, що діляться.

Абсолютний розкид а визначається за формулою:

де А - відносна помилка, яка визначається за формулою 2.

Зниження мітотичного індексу в порівнянні з контролем вважається результатом загальнотоксичної дії забруднювачів грунтів та водних джерел.

На цих же препаратах враховуються клітини з аберантними (патологічними) хромосомами. Частота зустрічальності патологічних фігур мітозу виражається у відсотках від клітин, що поділяються, а частота патологічних анафаз і телофаз - від переглянутих аналогічних фаз мітозу (не менш 200).

Загальну частоту аберантних хромосом визначають у відсотках за формулою:

де G - кількість аберантних клітин;

m - кількість клітин, що діляться.

Аберантність анафаз і телофаз визначають аналогічно:

де G' - кількість аберантних ана-, телофаз;

m' - загальна кількість ана-, телофаз (не менш 200).

Помилка загальної кількості аберантних хромосом S визначається за формулою:

Аналогічно обчислюється помилка аберантності ана- та телофаз:

За зростанням кількості патологічних фігур мітозу у порівнянні з контролем судять про збільшення мутагенності ґрунтів або водних джерел.

3.4.3. Оцінка мутагенності водних джерел за "Мікроядерним тестом" в клітинах гідробіонтів

Для визначення ступеня хронічного мутагенного впливу забруднень водного середовища у натурних дослідженнях можливо застосовувати мікроядерний тест у клітинах різних тканин (клітинах крові, епітелію зябрової поверхні й ін.) організмів індикаторів.

Зручними об'єктами у цитогенетичному моніторингу екологічного стану прісноводних водойм є представники хребетних тварин: костисті риби - плотва (Rutilus rutilus L.), карась срібний (Carassius (aurata) gibilio Block), й амфібії - жаба озерна (Rana ridibunda Pall.), жаба ставкова (Rana esculenta L.), жаба гостромордна (Rana terrestris Andr.). Вони є кінцевою ланкою трофічного ланцюга водойм, акумулюють різні токсиканти у своєму організмі і постійно піддаються дії полютантів, розчинених у воді. Слід зазначити, що безхвості амфібії можуть служити для цілей моніторингу генетичних наслідків забруднення як водного, так і наземного середовища.

Відбір біопроб (мазків) здійснюється у весняно-літньо-осінній період. Мазки фіксуються в суміші Карнуа протягом однієї години, підсушуються і транспортуються в лабораторію (пункт 3.1.6). Фарбування мазків проводиться реактивом Шиффа за Фельгеном за пунктом 3.2.4.

4.1. У зв'язку з тим, що усі біоіндикаційні показники мають свої одиниці виміру, необхідно привести їх в єдину безрозмірну систему умовних показників ушкодженості (УПУ) біосистем. Це надасть можливість виконати інтегральну оцінку стану довкілля за токсико-мутагенним фоном і визначити рівні екологічної небезпеки для людини та біоти. Умовний показник ушкодженості біоіндикаторів визначають за формулою: