Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення"

1. Затвердити методичні вказівки "Медико-біологічні дослідження виробничих штамів мікроорганізмів і токсиколого-гігієнічна оцінка мікробних препаратів, визначення їх безпеки та обґрунтування гігієнічних нормативів і регламентів" (додаються).

2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров'я України методичні вказівки довести до установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби, міністерств, інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку.

3. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров'я України Бережнова С.П.

1.1. Методичні вказівки призначені для спеціалістів, які займаються обґрунтуванням гігієнічних нормативів виробничих штамів мікроорганізмів-продуцентів і готових форм препаратів, які їх вміщують, в об'єктах виробничого та навколишнього середовищ. Штам мікроорганізмів - це генетично однорідна популяція мікроорганізмів з певними стабільними специфічними морфологічними, культуральними і біохімічними властивостями.

1.2. Методичні вказівки складені з урахуванням особливостей токсиколого-гігієнічної оцінки біологічних препаратів на основі виробничих штамів мікроорганізмів. Виробничий штам - штам мікроорганізмів, який використовується в промисловості при виробництві того чи іншого продукту (біопрепарату). Патогенні мікроорганізми не допускаються до використання як виробничі. Штам-продуцент - штам мікроорганізмів, що продукує ту чи іншу речовину (антибіотик, фермент та ін.) і використовується для одержання кінцевого продукту (тобто продукту біотехнології). Біотехнологія - технологія виробництва продуктів при використання живих клітин організмів (мікроорганізмів, рослин, тварин).

1.3. До виробничих штамів мікроорганізмів належать мікроорганізми різних категорій (гриби, бактерії), що є дійовими чинниками біопрепаратів або продуцентами біологічно активних речовин, які використовуються для створення препаратів для різних галузей народного господарства та охорони здоров'я (мікробіологічні засоби захисту рослин від шкідників та хвороб, стимулятори росту рослин та мікробіологічні добрива, антибіотики, ферменти, вітаміни, амінокислоти, субстанції для лікарських препаратів, кормові білки, харчові добавки, деструктори хімічних забруднювачів і ін.).

1.4. Мікробний препарат - це препарат, що містить в своєму складі як діючий інгредієнт життєздатні мікроорганізми в нативному або висушеному стані. Мікробні препарати можуть в своєму складі мати як монокультури, так і асоціації мікроорганізмів різних груп, вони можуть містити або тільки мікроорганізми (наприклад, препарати для харчової промисловості) або, крім мікроорганізмів, продукти їх життєдіяльності, різні мінеральні та органічні наповнювачі, стабілізатори, емульгатори, консерванти, принадні продукти (наприклад, мікробні пестициди, стимулятори росту рослин, мікробіологічні добрива).

На відміну від хімічних речовин, мікроорганізми є живими об'єктами, здатними зберігати життєздатність і розмножуватись при наявності певних умов в навколишньому середовищі або в макроорганізмі. Продукти біотехнології, що містять в своєму складі виробничі штами мікроорганізмів, як правило, не токсичні для теплокровних організмів, але можуть викликати дисбіотичну, сенсибілізуючу, імуномодулюючу чи іншу специфічну дію.

Використання виробничих штамів мікроорганізмів та виробництво препаратів на основі мікробного синтезу здійснюється підприємствами мікробіологічної промисловості та територіальними біотехнологічними підприємствами різної потужності, біофабриками та біолабораторіями. Штами, зареєстровані як збудники інфекційних захворювань у людей та корисних тварин, до застосування як виробничі не дозволяються.

1.5. Мета запропонованих методичних вказівок - сприяти отриманню однорідних даних, що можна зіставити, а також вибору і проведенню оптимального обсягу досліджень, необхідних для обґрунтування гігієнічних регламентів виробничих штамів мікроорганізмів і готових форм препаратів, які їх вміщують. Передбачений цими методичними вказівками обсяг дослідження - обов'язковий мінімум для дослідників, однак він не є перешкодою для використання інших методів при умові їх обґрунтування.

Дослідження передбачають оцінку небезпеки виробничого штаму мікроорганізмів та продуктів біотехнології на їх основі при надходженні в організм лабораторних тварин шляхами, адекватними реальним умовам трудової діяльності і проживанню людини, з метою вибору лімітуючого критерію шкідливості і встановлення ГДК (гранично допустимої концентрації).

1.6. Проведення токсиколого-гігієнічних досліджень і визначення патогенних властивостей нових виробничих штамів мікроорганізмів, розробка ГДК штамів і продуктів біотехнології на основі мікроорганізмів, визначення небезпеки для здоров'я цих продуктів здійснюється лабораторіями науково-дослідних установ різних відомств, які акредитовані в установленому порядку Комітетом з питань гігієнічного регламентування МОЗ України.

Гігієнічному регламентуванню підлягають штами мікроорганізмів, що пройшли у вказаних установах первинну токсиколого-гігієнічну оцінку як діючі чинники біопрепаратів або як продуценти для мікробіологічного синтезу і отримали в установленому порядку дозвіл МОЗ України на їх використання в технологічних процесах, а також готові форми препаратів, виготовлені на основі цих мікроорганізмів або продуктів їх метаболізму.

1.7. У разі направлення на токсиколого-гігієнічні дослідження виробничого штаму (чи групи штамів) мікроорганізмів розробнику (власнику штаму) необхідно надати паспорт штаму з відомостями про його таксономічне положення, джерело виділення, культурально-морфологічні і біохімічні властивості, тести і критерії ідентифікації, умови культивування, спосіб застосування.

У разі направлення на дослідження готового біопрепарату необхідно надати відомості про склад препарату (вміст діючого інгредієнта і сторонньої мікрофлори, наповнювачів, емульгаторів та інших допоміжних речовин, агрегатний стан, призначення, спосіб виробництва).

1.8. В останні роки в зв'язку з розвитком біотехнології пропонується промислове використання генетично модифікованих мікроорганізмів. Ступінь їх небезпеки залежить не тільки від патогенних властивостей штаму-хазяїна і рекомбінантної ДНК, здатності до виживання в об'єктах виробничого і навколишнього середовища, але, особливо, від здатності до передачі генетичної інформації іншим організмам. В зв'язку з відсутністю методичних підходів до гігієнічного регламентування таких штамів і недостатністю наукових даних для розробки критеріїв оцінки їх потенційної небезпеки, викид генетично-модифікованих мікроорганізмів в процесі виробництва в повітря робочої зони і в навколишнє середовище забороняється. При отриманні необхідних даних це положення може бути переглянуте.

1.10. При проведенні досліджень з мікроорганізмами слід обов'язково дотримуватись правил техніки безпеки при роботі з мікроорганізмами з метою запобігання зараженню експериментаторів та лабораторних тварин згідно з ДСП 9.9.5-080-02 "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю".

2.1. Дослідження з токсиколого-гігієнічної оцінки мікробних препаратів включають декілька етапів:

1) дослідження небезпечної дії виробничого штаму мікроорганізму-продуценту,

2) токсикологічні дослідження готової форми мікробного препарату,

3) гігієнічні дослідження.

2.2. Вивчення дії на організм теплокровних тварин нових виробничих штамів мікроорганізмів є першим етапом досліджень при проведенні гігієнічного регламентування мікробних препаратів в об'єктах виробничого та навколишнього середовищ, спрямоване на з'ясування патогенності мікроорганізму, під якою розуміється потенційна здатність останнього викликати специфічне (інфекційне) захворювання в макроорганізмі певного виду. Патогенність є видовою генетичною ознакою мікроорганізму і визначається багатьма факторами, так званими "факторами патогенності", основними з яких є інфекційність, інвазивність та токсичність.

Інфекційність - здатність викликати інфекційний процес в природних умовах, тісно пов'язана з інвазивністю - здатністю долати захисні бар'єри організму, проникати і розмножуватись в його тканинах. Інвазивність здійснюється за допомогою певного набору засобів, до числа яких, зокрема, належить капсульна речовина мікроорганізмів, яка захищає їх від фагоцитозу, гемолізини, лейкоцидіни, коагулаза, фібринолізин і ряд інших.

Токсичність - здатність за допомогою токсичних продуктів бактеріальної клітини (екзо- та ендотоксинів) втручатись в метаболічні функції хазяїна, порушуючи сталість його внутрішнього середовища.

2.3. Багаторічний досвід вивчення виробничих штамів мікроорганізмів-продуцентів та впливу їх на стан здоров'я осіб, постійно контактуючих з ними при виробництві біотехнологічних продуктів, свідчить про можливу здатність цих об'єктів викликати також алергенну чи дисбіотичну дію.

Отже, принципова схема досліджень небезпеки виробничих мікроорганізмів включає в подальшому вивчення наступних типів дії: патогенності, імунотоксичності і дисбіотичної дії.

2.4. На другому етапі токсиколого-гігієнічних досліджень проводять вивчення готової форми мікробного препарату, що містить живі вегетативні клітини мікроорганізмів або спори).

При токсиколого-гігієнічній оцінці мікробного препарату перш за все слід враховувати чисельність мікроорганізмів і стан, в якому вони знаходяться в препараті (висушені чи нативні клітини) і від якого залежить їх патогенність. На останню можуть впливати також і інші компоненти, які входять в мікробний препарат: продукти життєдіяльності, залишки поживного середовища, різні мінеральні й органічні наповнювачі, стабілізатори, емульгатори і т. і. Кожна з цих речовин може діяти на організм як самостійно, так і в комплексі з мікроорганізмом, посилюючи дію останнього.

Тому в доповнення до досліджень, які проводяться для визначення безпеки виробничого штаму мікроорганізмів - основного діючого чинника препарату, визначають також загальнотоксичну дію препарату в гострих і субхронічних експериментах, виявляють сенсибілізуючу і дисбіотичну дію, подразнюючу дію на шкіру.

2.5. При наявності виробництва (дослідного або промислового) проводиться гігієнічне дослідження умов виробництва, мікробіологічне дослідження повітря робочої зони і атмосферного повітря.

При вивченні мікробних препаратів, які при застосуванні вносяться в навколишнє середовище (наприклад, мікробні пестициди, добрива і стимулятори росту рослин, мікробні деструктори) вивчають виживання мікроорганізмів, що входять до складу мікробного препарату, в об'єктах навколишнього середовища і вплив на процеси мікробного самоочищення води і ґрунту.

3.1. Передумови проведення досліджень

3.1.1. При проведенні робіт по дослідженню штамів мікроорганізмів необхідно використовувати свіжу культуру продуценту, яку вирощують враховуючи швидкість росту і того віку культури, при якому згідно регламенту конкретного виробництва найбільш вірогідне потрапляння штаму в повітря виробничого і навколишнього середовищ. При цьому використовують ті поживні середовища, які забезпечують оптимальний ріст досліджуваної культури.

3.1.2. Методичні вказівки включають спеціальні тести, необхідні для визначення патогенної/токсичної дії мікроорганізмів на організм теплокровних тварин. Слід зазначити, що розрахунки доз мікроорганізмів, які вводяться в організм, проводиться не так, як для хімічних речовин, коли кількість препарату виражається, як правило, в мг на кг маси тварини чи людини. При оцінці небезпеки мікроорганізмів такі розрахунки непридатні, тому що видова сприйнятливість макроорганізму до мікроорганізму має не менше значення, ніж патогенні властивості мікроорганізму, в зв'язку з чим доза мікроорганізмів, що вводиться, виражається не в мг, а по кількості мікробних клітин на весь організм, а не на його вагу. Виражається ця кількість в одиницях введених мікроорганізмів на одну експериментальну тварину: для бактерій за таку одиницю приймається утворення, що продукує одну колонієутворюючу одиницю (КУО) на відповідному твердому поживному середовищі, для грибів - окрема спора, що визначається мікроскопічно або дає одну КУО на відповідному поживному середовищі.

3.1.3. Для отримання біомаси мікроорганізмів культуру декілька разів відмивають від поживного середовища в фізіологічному розчині при повторному центрифугуванні, потім із маточної завісі за оптичним стандартом мутності готують потрібні концентрації мікроорганізмів у фізрозчині для введення лабораторним тваринам.

3.1.4. Дослідження проводять з використанням лабораторних статевозрілих тварин молодого віку: білі миші (маса тіла 16-18 г), білі щури (маса тіла 120-160 г), морські свинки (маса тіла 200-250 г), кролики (маса тіла 1500-2000 г). Вказується лінія, стать тварин, з якого розплідника отримані, харчовий раціон і інші умови, при яких проводилась кожна серія експериментів.

Умови утримання тварин повинні відповідати вимогам "Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)" (МЗ СССР, 1973) та методичних рекомендацій "Содержание лабораторных животных и уход за ними в учреждениях Минздрава УССР" (МЗ УССР, 1976).

Підбір тварин і формування з них однорідних контрольних і дослідних груп здійснюють з урахуванням однакової маси тіла (різниця не повинна перевищувати (20% середньої маси кожної статі)), відсутності різниці в поведінці, загальному стані, вмісті лейкоцитів в крові і стані нормальної мікрофлори організму. Тварини не повинні мати паразитів і патогенних мікроорганізмів. Дотримуються також загальноприйнятих правил при роботі з мікроорганізмами.

3.1.5. Мікроорганізми вводяться тваринам у вигляді гомогенної суспензії в стерильному фізіологічному розчині NaCl. При виготовленні суспензії мікроорганізми обережно в стерильних умовах гомогенізують в фізіологічному розчині. Густота суспензії залежить від природи мікроорганізму, кількості його клітинних елементів у розчині. При визначенні робочої концентрації клітин в суспензії користуються оптичним стандартом мутності або камерою Горяєва відповідно морфології і величини клітин (бактерії чи гриби).

3.1.6. Гомогенізація суспензії і асептичність є обов'язковими умовами підготовки матеріалу для експериментального зараження. Максимальний об'єм рідини, що може бути введений одноразово, залежить від виду тварини. При пероральному введенні мишам вводять культуру мікроорганізмів в об'ємі, що не повинен перебільшувати 1 мл для мишей і 5 мл для щурів. Діапазон відхилень повинен бути мінімальним. При інтраназальному зараженні суспензію мікроорганізмів вводять під легким ефірним наркозом мишам в об'ємі 0,07-0,05 куб. см і щурам - 0,05-0,2 куб. см. При внутрішньочеревинному зараженні суспензію вводять мишам в об'ємі 0,1 куб. см і щурам - 0,25 куб. см.

3.2. Визначення патогенності мікроорганізмів

3.2.2. При визначенні вірулентності досліджуваних мікроорганізмів використовують живі мікроорганізми, при визначенні токсичності - інактивовані мікроорганізми. Інактивацію слід здійснювати тим способом, який би дозволяв не руйнувати мікробну клітину. Краще всього використовувати прогрівання мікробної суспензії на водяній бані при 60-80 град. С впродовж 1 години.

3.2.3. В експерименті по визначенню інфекційності повинно бути не менше 6 дослідних тварин (по 3 тварини кожної статі). При цьому використовують суспензію живих мікроорганізмів. Контрольні тварини отримують замість мікробної суспензії відповідний об'єм фізіологічного розчину.

Спостереження за тваринами проводять впродовж 15 днів в разі зараження бактеріями і 30 днів - в разі зараження грибами. При цьому враховують зовнішній вид і поведінку тварин, проводять термометрію, визначення маси тіла, досліджують наявність мікроорганізмів в крові, внутрішніх органах і виділеннях тварин і швидкість очистки організму від них, проводять морфологічні дослідження крові. Особливу увагу слід приділяти спостереженням за появою тремору, конвульсій, проносу, сонливості, слинотечі і інших симптоматичних проявах інфекційності.

При виявленні загибелі тварин, а також після їх забою проводять бактеріологічні та морфологічні дослідження внутрішніх органів тварин.

3.2.4. Якщо в експериментальних дослідженнях не виявлено будь-яких клінічних симптомів і відхилень в загальному стані лабораторних тварин, мікроорганізми не інвазивні (тобто не здатні проникати в клітини організму) і не інфекційні, слід вважати такі мікроорганізми не патогенними. Подаються первинні дані дослідів у вигляді таблиць і результатів статистичної обробки.

3.3. Вивчення подразнюючої/запальної дії на слизову оболонку ока

В експерименті повинно бути використано не менше 6 кролів. До початку експерименту ретельно досліджуються обидва ока, тварини з будь-яким ушкодженням слизової оболонки не повинні використовуватись. Нанесення суспензії мікроорганізмів в кон'юнктивальну порожнину здійснюється після м'якого відведення нижньої повіки від очного яблука. Потім повіки зводять разом впродовж 1 сек., щоб запобігти витіканню суспензії. Спостереження за тваринами проводяться щоденно впродовж 15 днів після введення при дослідженні бактерій і 21 дня після введення грибів. При дослідженні стану ока і кон'юнктиви використовуються бінокулярна лупа, прожекторна лампа, інші оптичні засоби.

3.3.2. Оцінка пошкоджуючої дії на слизові оболонки ока кроля проводиться згідно таблиці 1 (за Majda i Chrusaielska).