Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення"

1. Затвердити методичні рекомендації "Дослідження імунотоксичної дії потенційно небезпечних хімічних речовин при їх гігієнічній регламентації", що додаються.

2. Головному санітарно-епідеміологічному управлінню Міністерства охорони здоров'я України ці методичні рекомендації довести до установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби, міністерств, інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку.

3. Контроль за виконанням наказу покласти на начальника Головного санітарно-епідеміологічного управління Міністерства охорони здоров'я України Бережнова С.П.

Токсикологія і гігієна застосування хімічних речовин у промисловості, сільському господарстві і побуті

1. Методичні рекомендації призначені для науково-дослідних установ токсиколого-гігієнічного профілю МОЗ України, що займаються гігієнічною регламентацією хімічних речовин, розроблені Проданчук М.Г. директор Інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І.Медведя МОЗ України Жмінько П.Г., Зінченко Д.В., Кузьмінський С.М., Янкевич М.В., Інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І.Медведя МОЗ України, Київ-03022, вул. Героїв Оборони, 6

Методичні рекомендації підготовлені з урахуванням нових наукових дослідженнь в галузі токсикології і імунотоксикології хімічних речовин.

1. Методичні рекомендації запропоновані Інститутом екогігієни і токсикології ім. Л.І.Медведя МОЗ України.

2. "Введено в дію вперше"

3. Методичні рекомендації - можуть бути використані при дослідженні імунотоксичної дії, встановленні безпечних рівнів хімічних речовин та розробці їх гігієнічних нормативів у об'єктах навколишнього середовища з урахуванням впливу хімічного фактору на імунну систему організму.

4.2. Клітинні реакції (клітинний імунітет)

4.3. Гуморальні реакції (гуморальний імунітет)

У працях останніх років показано, що багато хімічних речовин спроможні чинити імунодепресивну дію, переважно по Т-типу, викликати алергічні та аутоімунні захворювання, порушувати формування набутого імунітету. Зниження імунної реактивності організму під впливом хімічних речовин також сприяє росту простудних, інфекційних, алергічних і онкологічних захворювань. При дії багатьох ксенобіотиків зміна неспецифічної резистентності і імунної реактивності організму настає раніше від специфічних ознак інтоксикації та відновлюється значно пізніше. Це свідчить про те, що показники імунної системи можуть бути використані як лімітуючі при регламентації хімічних речовин, та для діагностики прихованих форм інтоксикації у людей, які професійно контактують з цими речовинами.

Досі імунологічні критерії шкідливості використовували переважно при токсиколого-гігієнічній оцінці хімічних алергенів. Це пов'язано з тим, що більшість імунологічних методів досліджень трудомісткі, складні, не завжди можуть бути відтворені у звичайних лабораторних умовах токсиколого-гігієнічного профілю, потребують використання дефіцитних імпортних реактивів. Одною із перешкод для постановки імунологічних тестів є погана розчинність більшості хімічних речовин у воді.

В зв'язку з цим розробка критеріїв оцінки імунотоксичної дії хімічних речовин та удосконалення методичних підходів до їх гігієнічної регламентації в об'єктах навколишнього середовища з урахуванням впливу їх на імунну систему є актуальною проблемою.

Дані методичні рекомендації включають загальні положення щодо структури імунної системи, ролі клітинних і гуморальних факторів в імунній відповіді. Приводяться інструкції щодо використання деяких сучасних імунологічних методик, оцінка отриманих результатів з гігієнічних позицій. Однак, Методичні рекомендації не обмежують вибору інших інформативних методів досліджень.

В кінці методичних рекомендацій подано список літератури, де науковець може знайти відомості не тільки про сучасні методи досліджень, але і про теоретичні розробки в імунології.

Дані методичні рекомендації орієнтовані на спеціалістів, що займаються гігієнічною регламентацією хімічних речовин в об'єктах навколишнього середовища.

Імунна система організму являє собою сукупність усіх лімфоїдних органів і скупчень лімфоїдних клітин. Для імунної системи характерні 3 особливості: вона генералізована по всьому тілу; її клітини постійно рециркулюють завдяки кровообігу по всьому організму; вона здатна виробляти специфічні антитіла, різноманітні своєю специфічністю для кожного антигену.

Імунітет - це засіб захисту організму від живих тіл і речовин, що несуть на собі ознаки генетично чужорідної інформації. Головне призначення імунітету - знищення клітин, що генетично відрізняються від клітин власного організму, незалежно від того, чи ці клітини є чужорідні, чи змінені в генетичному відношенні конкретного організму (Петров Р.В., 1987) /1/.

Розрізняють центральні (первинні) і периферичні (вторинні) органи імунітету. До центральних органів імунітету відносяться - вилочкова залоза (тимус) і сумка Фабриціуса у птахів. До периферичних - селезінка, лімфатичні вузли, мигдалик, периферична кров.

Центральною фігурою імунної системи є лімфоцит. Крім функції імунологічного нагляду, діяльність лімфоцитів пов'язана із забезпеченням морфологічної цілісності організму за рахунок морфо-генетичної активності і виконує загальнорегуляторну функцію (Бабаева А.Г., 1986) /2/.

Родоначальницею усіх клітин імунної системи є кровотворна стовбурна клітина. Вона генерує лімфоїдну стовбурну клітину, що дає початок 2 типам імунокомпетентних клітин - Т- і В-лімфоцитам.

Розвиток Т-лімфоцитів відбувається в тимусі і під впливом його гормонів - тимозину і тимопоетину відбувається дозрівання їх у крові. Т-лімфоцити (тимоцити), у свою чергу, генерують на 3 типи клітин: Т-хелпери (Th), Т-супресори (Ts), Т-ефектори (Te). Останнім часом виділяють ще декілька субпопуляцій Т-лімфоцитів - Т-ампліфайєри (Та), Т-диференціюючі лімфоцити (Td), контрсупресори.

Th є важливою складовою частиною кооперуючої системи. Розрізняють 2 типи Т-хелперів - Th1 і Th2. Вони включають В-лімфоцити в проліферацію і диференціювання, що забезпечує накопичення відповідного клону зрілих антитілопродуцентів - плазматичних клітин, також відіграють посилюючу роль у реакціях клітинного імунітету (Moretta et. al., 1981; Петров Р.В., 1987).

Т-еффектори - клітини, під впливом чужерідних антигенів формують клон сенсибілізованих лімфоцитів - кілерів. Вони відповідають за клітинні форми імунної відповіді (реакції ГЗТ, відторгнення трансплантанта, специфічний лізис клітин мішеней in vitro, протипухлинний і противірусний імунітет).

Т-супресори гальмують включення В-лімфоцитів у проліферацію і диференціювання, гальмують розвиток ГЗТ, формування цитотоксичних Т-лімфоцитів. Виділяють специфічні і неспецифічні Ts. Зниження їхньої функції відіграє патогенетичну роль у формуванні аутоімунних і алергічних захворювань. Підвищення функціональної активності Ts веде до розвитку імунодефіцитних станів, а також онкологічних захворювань.

Т-ампліфайери (підсилювачі) виконують роль помічників в імунологічних реакціях клітинного типу.

Т-диференціюючі лімфоцити регулюють диференціювання стовбурних клітин у мієлоїдному або лімфоїдному напрямку, а також впливають на їхню міграцію і проліферацію.

Основним маркером Т-лімфоцитів є рецептор для еритроцитів барана, що дозволяє ідентифікувати їх в тесті спонтанного Е-розеткоутворення. У нормі в периферичній крові людини - 55-60% Т-лимфоцитів. Про функціональний стан Т-лімфоцитів судять по реакції бласттрансформації лімфоцитів на вплив мітогенів (Вершигора А.Е., 1980) /3/.

Другою великою популяцією лімфоцитів у периферичній крові, яка складає 25-30%, є В-лімфоцити. В-лімфоцити у птахів розвиваються в сумці Фабриціса, у людини - під впливом невідомого чинника. Вони генерують на 3 типи клітин - що продукують антитіла IgM, IgG і IgA.

В-клітини відповідають за гуморальний імунітет. Завдяки наявності на поверхні В-лімфоцитів імуноглобулінових детермінант, рецепторів до Fe-фрагмента IgG і третьому компоненту комплементу (С3) їх можна ідентифікувати за допомогою комплементарного (ЕАС) розеткоутворення. Про функціональну активність В-лімфоцитів судять по реакції бласттрансформації на вплив мітогенів, гемагглютинації, рівню імуноглобулинів у сироватці крові.

Популяція В-лімфоцитів складається із декількох типів В-клітин. В-хелперів, що посилюють функцію деяких субпопуляцій Т-лімфоцитів і В-супресорів (категорія незрілих В-клітин), що пригнічують як клітинний, так і гуморальний імунітет. Вони гальмують синтез ДНК і проліферацію попередників антитілопродуцентів, функцію деяких субпопуляцій Т-лімфоцитів, відповідь лімфоцитів на мітогени.

Розрізняють також нульові клітини (0-лімфоцити) - лімфоцити, що не несуть маркерів, подібних до Т- і В-клітин. Нульові клітини складають 10-20% від загальної кількості лімфоцитів периферичної крові людини. Ця субпопуляція клітин не є однорідною, а містить у собі ще L- і К-лімфоцити та природні кілери (NK-клітини), які розрізняються між собою за функцією та антигенними маркерами.

NK-клітини здійснюють протипухлинний захист, лізують і елімінують бактеріальні і вірусні антигени і разом із К-клітинами відіграють важливу роль у підтримці гомеостатичної рівноваги в організмі.

Існує незначна частина лімфоцитів (Д-лімфоцити), які мають одночасно маркери Т- і В-лимфоцитів. Природа і функції їх остаточно не з'ясовані.

Для нормальної імунної відповіді необхідні макрофаги. Антиген оброблений макрофагом, розпізнається Т-хелперами. Т-хелпери за допомогою 2-х сигналів включають В-лімфоцити в антитілогенез. Кооперація макрофагів, Т- і В-лімфоцитів і їх механізм взаємодії докладно описані Петровим Р.В. (1976, 1987).

Відомо, що при впливі на організм ксенобіотиків, у реакцію включаються як клітинні й гуморальні механізми імунітету, так і неспецифічні фактори захисту організму. Неспецифічні фактори захисту виникли у філогенезі значно давніше, ніж специфічна реактивність, і включаються в знешкодження різноманітних ксенобіотиків раніше від імунологічних (специфічних) факторів. Неспецифічні фактори тісно пов'язані з механізмом імунної відповіді. Порушення процесу фагоцитозу, активності комплементу веде до порушення реагування імунної системи.

У зв'язку з цим, вивчення механізму токсичної дії хімічних речовин на імунну систему організму без урахування стану неспеціфічної резистентності буде неповним, оскільки неспецифічна резистентність та імунна система складають єдиний механізм реактивності, що включають стереотипні і специфічні реакції.

Неспецифічна реактивність організму містить у собі механічні, фізичні, клітинні і гуморальні фактори.

Механічні фактори - бар'єрна функція шкіри і слизових оболонок.

Фізичні фактори - кисле середовище шкіри і шлункового соку, бактерицидність шкіри, слини, крові.

Клітинні фактори - фагоцитоз, піноцитоз.

Гуморальні фактори - природні антитіла, лізоцим, комплемент, (бета)-лізин, лейкіни, пропердин, інтерферон та інші.

Важливе значення в імунній відповіді мають фагоцитоз і комплемент. У процесі фагоцитоза головне місце відводиться макрофагам і нейтрофілам. Макрофаги синтезують велику кількість лізосомальних ферментів, які використовуються для перетравлення фагоцитованого матеріалу і ряд інших ферментів і білків, що беруть участь у захисті організму від чужорідних агентів. Це є лізоцим, коллагеназа, еластаза, інтерферон, медіатор температурної реакції піроген, фактори комплементу С2, С3, С4 і фактор У, простагландини, а також супероксидний аніон і перекис водню, що мають бактерицидну дію (Томпсон Р.А., 1983).

Крім того, макрофаги беруть участь у підготовці антигенів і переробці їх у імуногенну форму, та у кооперації Т- і В-лімфоцитів, необхідних для ініціювання імунної відповіді.

Функція макрофагів і їхня роль в імунітеті докладно висвітлені в монографії Учителя І.Я. (1978). Про активність фагоцитів судять по спроможності до адгезії, міграції, захопленню і перетравленню бактерій.

Комплемент - це термолабільний неспецифічний фактор сироватки крові, що є сумішшю глобулінів сироватки крові і мукопротеїну. Він впливає, головним чином, не на антиген, а на комплекс антиген-антитіло. Активація системи комплемента - це важливий етап ефективного механізму гуморальних і клітинних імунних реакцій.

Призначення інших факторів неспецифічного захисту організму і методи їх дослідження описані в ряді монографій і посібників з імунології.

2.1. Схема експерименту

При прогнозуванні й оцінці сенсибілізуючої та імунотоксичної дії пестицидів і агрохімікатів необхідно додержуватися принципу етапності. Етапи гігієнічної регламентації хімічних речовин з урахуванням імунної реактивності організму подані у схемі.

Етапи досліджень

1. На основі даних про хімічну структуру і аналізу літератури прогнозують можливість алергенного і імунотоксичного ефектів у досліджуваної речовини.

2. Вивчають можливі алергенні властивості за загальноприйнятою схемою в токсикології /4-8/.

В разі виявлення сенсибілізуючих властивостей оцінюють вираженість алергенного ефекту і класифікують за ступенем алергенної небезпечності згідно СанПіН 8.8.1.002-98.

Речовини 1 класу небезпечності не допускають до застосування, 2 класу небезпечності - регламентують по алергенному ефекту, 3 і 4 класів небезпечності - регламентують з урахуванням специфічної і загальнотоксичної дії.

3. Проводять дослідження імунотоксичної і імуномоделюючої дії в гострому і субхронічному експериментах, визначають вираженість ефекта в залежності від дози.

Якщо препарат не має вказаних ефектів, то регламентацію проводять за загальноприйнятою схемою з урахуванням специфічної і загальнотоксичної дії.

4. В разі виявлення будь-яких порушень імунологічної реактивності, поряд з дослідженням специфічного і загальнотоксичного ефектів, досліджують стан неспецифічної реактивності організму, клітинного і гуморального ланцюжків імунітету, можливість розвитку аутоімунних порушень в хронічному експерименті. Визначають порогові і недіючі рівні доз (концентрацій) препарату.

5. При необхідності, проводять епідеміологічні дослідження, вивчають механізм імунотоксичної дії.

В експерименті використовують статевозрілих тварин. Різниця в масі тіла тварин в дослідних групах не повинна перевищувати 15%. Експериментальні групи складаються не менш, як з 8-10 тварин обох статей, що дозволяє провести статистичну обробку отриманих результатів.

Для дослідження імуномоделюючої дії препарату пропонуються дві опозитні (щодо імунної відповіді) лінії мишей - C57BL та СВА. Для дослідження алергенних властивостей ксенобіотиків використовують морські свинки білої масті.

В експериментах з гігієнічної регламентації препаратів використовують 2 види тварин - щурі або миші, кролики.

2.3. Дози (концентрації) і кратність введення Дози і концентрації

Вибір доз і концентрацій повинен базуватись на основних параметрах токсичності - ЛД50, ЛК50, токсичні, порогові і недіючі дози (концентрації) встановлені за інтегральними показниками.

Імуномоделюючу дію визначають в гострому і субхронічному експериментах на різних рівнях доз (концентрацій). Кількість доз (концентрацій) - не менше 3, інтервал між дозами - має становити не більше ніж 1 порядок. Встановлюють порогові і недіючі рівні доз (концентрацій) за імунологічними показниками.

Для регламентування хімічних речовин проводять хронічний експеримент. Досліджують не менше, як 3 дози препарату. Встановлюють порогові і недіючі рівні доз (концентрацій) за імунологічними показниками.

Для оцінки потенційної небезпечності пестицидів важливо дослідити імунотоксичну дію препарату на рівнях доз і концентрацій, які можуть бути в реальних умовах. Для вибору таких доз (концентрацій) слід виходити із розрахункових величин гігієнічних параметрів речовини (ГДК, МДР, ДДД).

Кратність введення і експозиція

В гострому експерименті кратність введення препарату - одноразово, підгострому - 1 місяць, субхронічному 2-3 місяці, хронічному - 1-2 роки. Експозиція при інгаляційному і дермальному надходженні препарату в організм - 4 години.

3.1. Показники стану імунної системи

Для оцінки стану імунної системи при дії хімічних речовин розроблено багато схем, які включають імунологічні показники різного рівня. Останнім часом збільшується кількість показників, які дозволяють різносторонньо оцінити функціональну активність імунної системи. Вибір показників стану імунної системи залежить від поставлених задач, імуномоделюючих властивостей речовин та інше.

При регламентуванні пестицидів в токсиколого-гігієнічних лабораторіях використовують досить інформативні і легко відтворювані тести, які дозволяють отримати мінімум інтегративних характеристик діяльності головних ланок імунної системи.

1) Показники неспецифічної резистентності організму:

- формула крові;

- фагоцитарна активність макрофагів і нейтрофілів;

- кількість NK-клітин і їх активність;

- активність комплемента сироватки крові;

- активність лізоцима сироватки крові.

2) Клітинні реакції (клітинний імунітет):

- реакція гіперчутливості повільного типу;

- реакція трансплантат проти хазяїна;

- кількість Т- і В-лімфоцитів та їх популяцій;

- бласттрансформація лімфоцитів з ФГА, Кон А, ЛПС.

3) Гуморальні реакції (гуморальний імунітет):

- рівень гетерофільних агглютининів;

- рівень гемаглютининів та гемолізинів до еритроцитів барана;

- кількість антитілоутворюючих клітин в селезінці;

- рівень Ig G, Ig M, Ig A;

- рівень циркулюючих імунних комплексів.

4) Інші показники стану імунної системи:

- маса тимуса, селезінки, лімфовузлів;

- клітинність лімфоїдних органів;

- морфологічні дослідження.

Використання наведених вище показників дає можливість оцінити імунотоксичні властивості препарату та встановити, на яку саме ланку імунної системи він впливає - гуморальний чи клітинний імунітет, або фактори неспецифічної резистентності організму. Які саме методи досліджень будуть використані в токсикологічному експерименті, вирішує дослідник, але вибір методів повинен бути адекватний поставленим задачам і дозволяти дати об'єктивну оцінку щодо дії препарату на імунну систему. Доцільніше використовувати два та більше методів, які дають можливість характеризувати стан кожної ланки імунітету. При необходності в спеціальних дослідженнях використовують складніші показники, які дозволяють дати оцінку не тільки стану ІС, але і визначити механізм імунотоксичної дії.

3.2. Оцінка отриманих результатів

При оцінці зміни показників стану імунної реактивності основним критерієм є ступінь відхилення від паралельного контролю, а також тривалість виявлених змін. Фізіологічні показники і норми для інтактних тварин надані в рекомендованих імунологічних методах дослідження. Крім того, рекомендується орієнтуватись на фізіологічні показники і норми, прийняті в токсикології /9/.

У комплексі показників, що застосовуються для виявлення токсичного ефекту при хронічній дії, імунологічні показники розглядаються як інтегральні. У той же час їх гігієнічне значення суттєве, оскільки зміна функціональної активності імунної системи визначає рівень резистентності організму по відношенню до шкідливих факторів (фізичних, хімічних, мікробіологічних).

При оцінці порогових доз і концентрацій необхідно враховувати спрямованість і стійкість змін досліджених показників, які характеризують стан ІС, і віддиференціювати адаптацію організму від пошкоджень. Провести таку диференціацію допомагають дослідження резервних можливостей організму за здатністю ІС відповідати на додатковий антигенний стимул (еритроцити барана або бактеріальні антигени).

Недіючою дозою препарата вважають ту, при дії якої не спостерігається змін імунної реактивності організму на додаткову дію антигену.

Пороговою дозою препарата є та доза, при дії якої не спостерігається змін в реактивності ІС, але виявляються порушення імунної відповіді на додатковий антигенний стимул.

В деяких випадках об'єктивна оцінка шкідливої дії ускладнена, в зв'язку з фазними змінами виявлених ефектів, а також неадекватністю реагування різних видів тварин.

При неоднозначній відповіді ІС (стимуляція з подальшим пригніченням і т.і.) на дію ксенобіотика, для оцінки значимості отриманих змін і визначення порогових доз, доцільним є визначення величини і гармонійності ефекта по узагальненому критерію І, який являє собою суму показників величини індекса змін і гармонійності /10/.

Запропонований метод дозволяє провести порівняльну оцінку реакції (біоефектів) у піддослідних і інтактних тварин на основі загальних положень теорії подібності, виявити фактор, який викликає мінімальний по величині і максимальний по гармонійності біоефект (наприклад, визначення мінімальної діючої дози), або виявити фактор, який викликає біоефект, максимальний по величині і гармонійності (наприклад, при оцінці стимуляторів або імунодепресантів).

4.1. Показники неспецифічної резистентності організму

4.1.1. Формула крові

Оскільки клітини крові безпосередньо беруть участь у специфічній і неспецифічній імунній відповіді, то перш за все необхідно визначити загальну кількість лейкоцитів та лейкограму крові. Це сприяє прогнозуванню сенсибілізуючих і імунотоксичних властивостей речовини, та використанню даних гематологічних досліджень для розрахунку абсолютної кількості окремих популяцій імунокомпетентних клітин, визначених у відносних одиницях за імунологічними показниками, поданими нижче.

Визначення загальної кількості лейкоцитів периферичної крові та лейкоцитарної формули проводять загальноприйнятим методом в гематології /11/.

4.1.2. Фагоцитарна активність макрофагів і нейтрофілів Принцип методу

Про фагоцитарну активність макрофагів і нейтрофілів судять по кількості клітин, які вміщують мікроорганізми, кількості цих мікроорганізмів у одному фагоциті і ступеню пошкодження (перетравлювання) мікроорганізмів у фагоциті.

а) Визначення фагоцитарої активності макрофагів /12/

Реактиви

Для оцінки фагоцитарної активності перитонеальних макрофагів отримують клітини перитонеального ексудату. Піддослідним мишам в черевну порожнину вводять 5 мл (щурам - 10-15 мл) забуференого фізіологічного розчину (рН 7,2-7,4), що містить 20 од/мл гепарину і 1% сироватки ембріонів телят. Протягом 1-2 хв масажують живіт тварин, потім роблять розріз передньої стінки і відсмоктують рідину з різних відділів черевної порожнини. Щоб отримати більшу кількість макрофагів у черевну порожнину мишей вводять 1,5 мл 2% розчину пептону, щурам - 5 мл і через 48 год відсмоктують рідину.

В отриманому ексудаті підраховують кількість макрофагів. Забуференим фізіологічним розчином (рН 7,2-7,4) розводять макрофаги до кінцевої концентрації - 400-500 тис/мл. Отриману суспензію розливають у пробірки по 1,5 мл. Готують завись агарової культури мікробів (стафілококів або іншої культури, придатної для виявлення фагоцитарної активності) у фізіологічному розчині з концентрацією мікробних тіл 500 млн/мл. До кожної пробірки вносять по 0,3 мл зависі мікробів, струшують і ставлять у термостат на 30 хв при 37 град. С. При дослідженні фагоцитарної активності in vitro до дослідних пробірок вносять препарат, що вивчається. Кінцева концентрація препарарата не повинна чинити цитотоксичну дію. Після інкубації роблять мазок на предметному склі, фіксують метанолом 15 хв і забарвлюють за Романовським-Гімзе.

Перетравлюючу здатність макрофагів вивчають таким чином: до залишеної в пробірках суміші додають по 0,05 мл м'ясо-пептонного бульйону (рН=7,3), перемішують і ставлять у термостат (37 град. С). Проби для мазків беруть через 1 год та 6 год.

У світловому мікроскопі підраховують відсоток клітин, які фагоцитують мікроби (фагоцитарний індекс), кількість мікробів, поглинених одним макрофагом (фагоцитарне число) та фагоцитарну активність, яка визначається діленням кількості поглинутих мікробів на сто підрахованих клітин.

Перетравлюючу здатність характеризують за індексом завершеності фагоцитозу (ІЗ), який обчислюють за формулою:

1. Гепарин

2. 0,164 М розчин хлориду натрію (фізіологічний розчин)

3. Завись мікроорганізмів Candida albicans або іншої культури

4. Фіксатор крові

5. Фарба по Романовському-Гімзе

Завись Candida albicans готують в 0,164 М розчині хлориду натрію (10 в 9-му ступені) клітин/мл). Candida albicans вирощують у бульйоні протягом 48 годин при температурі 37 град. С (щоб запобігти утворенню міцелію). Потім тричі відмивають у стерильному фізіологічному розчині центрифугуванням при 1,5 тис. об/хв впродовж 10 хв.; визначають концентрацію мікробних клітин в камері Горяєва. Клітини мікроорганізмів розводять стерильним фізрозчином до концентрації 10 (в 9-му ступені) клітин/мл. Отримана суспензія придатна до застосування впродовж 2-3 тижнів при умові зберігання під резиновою пробкою при 4 град. С.

В пробірку або лунку пластикової планшетки вносять 0,02 мл фізрозчину, який вміщує 200 од/мл гепарина, додають 0,1 мл крові (забраної в стерильних умовах), 0,02 мл суспензії Candida albicans (співвідношення мікроби/фагоцити приблизно 40:1) і старанно перемішують. Після 30-хвилинної інкубації при 37 град. С готують мазки, висушують на повітрі не менше 1 години, фіксують і забарвлюють.

Під світловим мікроскопом по периферії мазка підраховують 100 нейтрофілів, визначають відсоток клітин, які вміщують мікроорганізми (фагоцитарний показник), середнє число мікроорганізмів у 1 фагоциті (фагоцитарний індекс), відносну кількість пошкоджених (слабкозабарвлених або нерівномірно забарвлених) мікробних клітин фагоцитованих нейтрофілами (відсоток перетравлених клітин). Для об'єктивного висновку про стан фагоцитарної функції в цілому слід визначити і абсолютну кількість фагоцитуючих нейтрофілів (для цього використовують дані загального аналіза крові - кількість лейкоцитів і нейтрофілів). Результат виражають у Гіга/л.

Для щурів масою тіла 180-200 г фагоцитарний показник за даною методикою складає 40-60%, фагоцитарний індекс - 1,8-2,5, відсоток перетравлювання - 40-55%.

4.1.3. Оцінка функціональної активності нейтрофілів в реакції відновлення нітросинього тетразолію (НСТ-тест) /14/

Метод грунтується на здатності нітросинього тетразолію під впливом активних продуктів метаболізму перетворюватися в нерозчинний блакитний формазан.

1. 0,1 М ізотонічний фосфатний буфер (рН 7,2):

Розчин А - 13,509 г KH2PO4 розчиняють в 1 л ізотонічного розчину хлористого натрію (для кроликів - 0,15 М, для щурів і мишей - 0,164 М).

Розчин В - 17,8 г Na2HPO4.2H2O або 35,82 г Na2HPO4.12H2O розчиняють в 1 л ізотонічного розчину хлористого натрію.

Розчини А і В змішують у співвідношенні 13:37 (pH 7,2).

2. Гепарин

Розчин гепарину - 800 од/мл. Зберігають при температурі +4 град. С.

3. 0,2% розчин нітросинього тетразолію.

Розчин НСТ готують перед використанням. До 2 мг порошка НСТ додають краплю 96% етилового спирту, 0,5 мл дистильованої води і 0,5 мл ізотонічного фосфатного буфера, розчиняють, фільтрують через паперовий фільтр.

4. Суспензія латексу (0,8 мкм - 1х(10 в 6-му ступені) в 1 мкл). Можна використовувати зимозан.

5. Метанол для фіксації мазків.

6. 2% водний розчин метилового зеленого.

При його відсутності можна використовувати 1% розчин карміну, 0,1% розчин нейтрального червоного. Не можна використовувати барвники, що забарвлюють ядра в темно-синій або фіолетовий колір.

Перед забором крові піпетки і лунки планшетки змочують розчином гепарину. В дві лунки пластикового планшету вносять по 0,05 мл крові. В першу лунку (вивчення спонтанної реакції) додають 0,025 мл фосфатного ізотонічного буфера з гепарином, у другу (вивчення реакції нейтрофілів на стимуляцію) - 0,025 мл суспензії латексу.

Потім у обидві пробірки додають по 0,025 мл розчину НСТ. Плавним погойдуванням кров ретельно перемішують, накривають фільтрувальним папером, змоченим фосфатним буфером і склом (волога камера) і на 30 хв ставлять в термостат при 37 град. С. Після інкубації знову перемішують вміст пластини, готують мазки середньої густини, висушують на повітрі, фіксують 5 хв у метанолі. Потім фарбують їх 5-7 хвилин метиловим зеленим. 30 с промивають проточною водою, ополоскують дыстильованою водою, висушують на повітрі. Під світловим мікроскопом (об'єктив х90) визначають число формазан-позитивних клітин на 100 нейтрофілів.

Облік реакції проводять на основі підрахунку кількості нейтрофілів, що вміщують сині глибки формазана.

Підрахунок реакції можна проводити двома способами:

1. Визначення відсотка формазанпозитивних (активованих) нейтрофілів з одночасним перерахунком на їх абсолютну кількість.

Цей спосіб передбачає облік кількості позитивних і негативних клітин. Підраховують 100 нейтрофілів. Результати виражають у відсотках і в Г/л (10 в 9-му ступені /л). Це так званий спонтанний НСТ-тест.

Такий же підрахунок проводять у другому мазку при використанні стимулятора (стимульований НСТ-тест).

Абсолютну кількість формазанпозитивних нейтрофілів розраховують за формулою: АхВхСх0.001, де

А - кількість лейкоцитів в Г/л;

В - процент усіх нейтрофілів;

С - процент формазанпозитивних нейтрофілів;

0.001 - коефіцієнт перерахунку в Г/л.

2. Визначення індексу активації нейтрофілоцитів (ІАН).

ІАН - середній показник активації системи фагоцитозу в перерахунку на один нейтрофіл. За ступенем активації усі нейтрофіли поділяють на 4 групи:

0 - клітини з одиничними пиловидними гранулами або без них;

1 - клітини з відкладаннями, що не займають більше 1/3 площини ядра;

2 - відкладання формазана, які займають більше 1/3 площини ядра, але не більше, ніж розміри цілого ядра;

3 - нейтрофіли з відкладаннями формазана, що перевищують розміри ядра.

Для одержання ІАН застосовують формулу Астальді і Верга, що використовують в цитохімії для перерахунку середнього цитохімічного коефіціенту (СЦК):

букви - число клітин з тим чи іншим ступенем активації,

100 - число підрахованих клітин.

В нормі відносна кількість формазанпозитивних нейтрофілів у дорослих щурів складає 9-11%.

4.1.4. Визначення кількості природних клітин-кілерів (ВГЛ - великих гранульованих лімфоцитів) /15/

Природні клітини-кілери (NK-клітини) мають характерну морфологічну будову. Це великі лімфоцити, в цитоплазмі яких при фарбуванні по Паппенгейму-Крюкову, Романовському-Гімзе або по Нохту, виявляються азурофільні гранули.

1. Метанол або фіксатор по Май-Грюнвальду

2. Водний розчин барвника Романовського.

Розчин готують перед дослідом - 1 частина фарби на 10 частин нейтральної дистильованої або водопроводної води.

Висушені на повітрі мазки крові фіксують в метанолі або фарбнику-фіксаторі Май-Грюнвальда протягом 5-7 хвилин, промивають водопроводною водою та висушують на повітрі. Потім на висушений мазок наливають водний розчин барвника Романовського на 8-15 хвилин (в залежності від температури в приміщенні), змивають фарбу і мазки висушують на повітрі.

Під світловим мікроскопом підраховують лейкоцитарну формулу і диференціюють лейкоцити. Підраховують 100-200 лейкоцитів. При підрахунку лімфоцитів ідентифікують великі гранульовані лімфоцити (ВГЛ), які характеризуються більшим розміром в порівнянні з іншими лімфоцитами, округлим або бобовидним ядром, рясною блідо-блакитною цитоплазмою, яка містить в собі три та більше еозинофільних гранул, які забарвлюються в яскраво-червоний або вишнево-фіолетовий колір. Абсолютну кількість ВГЛ в 1 л крові (Г/л) обчислюють із їх процентного вмісту і загального числа лейкоцитів.

4.1.5. Визначення активності природних кілерів /16/

Метод базується на здатності природних кілерів лізувати клітини мішені, мічені Na(51Cr)O3.

Як клітини-мішені використовують лінію клітин УАС-1, ріст яких підтримують у середовищі RPMI-1640 з додаванням 10% сироватки ембріонів корів.

Клітини-мішені мітять, інкубуючи їх протягом 1 год з 100 мкКюрі Nа(51Cr)O3. Активність природних кілерів оцінюють у 18-годинному тесті за вивільненням радіоактивного хрому 51Cr, а саме: до 10 в 4-му ступені мічених клітин-мішеней, які знаходились в 0,1 мл середовища RPMI- 1640 із сироваткою ембріонів корів (10%), додають такий же об'єм ефекторних клітин (виділених із селезінки дослідних тварин), так щоб у кінцевому підсумку отримати співвідношення ефекторних клітин до клітин-мішеней 25:1. Усі дослідження проводять у трьох паралелях у мікропанелях (кінцевий об'єм інкубаційної зависі - 0,2 мл). Пластикові мікропанелі інкубують 18 год при 37 град. С в атмосфері, що містить 5% СО2. Для оцінки результатів панелі центрифугують 5 хв при 450 g і 0,1 мл супернатанту відбирають для підрахунку радіоактивності (СРМ - кількість імпульсів за хв/лунку). Спонтанне виділення радіоактивної мітки визначають у контрольних лунках (клітини-мішені без додавання ефекторних клітин), а максимальне вивільнення - інкубуючи клітини-мішені з 0,5% розчином Тритону Х-100 (0,1 мл). Відсоток цитотоксичності (ЦТ) підраховують за формулою:

4.1.6. Активність комплементу сироватки крові за 50% гемолізом /17/

Метод грунтується на властивості комплементу викликати лізис сенсибілізованих еритроцитів барана (ЕБ). Використовуючи ряд розведень досліджуваної сироватки з наростаючою кількістю комплементу, визначають об'єм сироватки, необхідний для гемолізу 50% оптимально сенсибілізованих ЕБ. Ця величина позначається ICH50 і є одиницею гемолітичної активності комплементу.

1. Розчин N 1: 0,164 М хлористого натрію (9,587 г NaCl на 1 л дистильованої води) - для титрування сироватки щурів та мишей або 0,15 М розчин NaCl (8,777 г на 1 л дистильованої води) - для титрування сироватки кролів.

2. Розчин N 2: 1/15 М розчин однозаміщеного фосфорнокислого калію (9,073 г KH2PO4 на 1 л дистильованої води).

3. Розчин N 3: 1/15 М розчин двозаміщеного фосфорнокислого натрію (Na2HPO4.2H2O - 11,87 г на 1 л дистильованої води).

4. Розчин N 4 (фосфатний буфер): до 29,6 мл розчину N 2 доливають до 100 мл розчин N 3 та перевіряють рН розчину, який має бути 7,2.

5. Забуферений фосфатами ізотонічний розчин хлориду натрію (рН 7,2) готують, змішуючи 9 частин розчину N 1 та 1 частину розчину N 4.

6. Приготування розчину Алсвера - до 2,5 г глюкози додають 0,3 г лимоннокислого натрію, 0,55 г лимонної кислоти, доводять дистильованою водою до 100 мл. Розчин стерилизують кип'ятінням.

7. Еритроцити барана (ЕБ) витримують не менше 2-3 тижднів в розчині Алсвера. Готують 3% суспензію ЕБ, тричі відмиваючи їх розчином N 5, центрифугують 10 хвилин при 2000 об/хв. Для спектрофотометричної стандартизації цієї суспензії - 0,2 мл підготовленої суспензії лізують в 4,8 мл дистильованої води та визначають оптичну густину лізату при допомозі спектрофотометра при довжині хвилі - 541 нм. Правильно підготовлена суспензія ЕБ повинна мати оптичну густину, рівну 0,375 нм. У випадку невідповідності кінцевий об'єм суспензії (Vк) розраховують за формулою: