На виконання підпункту 4 пункту 4 Положення про Міністерство охорони здоров'я України , затвердженого Указом Президента України від 13 квітня 2011 року № 467,

1. Затвердити Методичні рекомендації "Кріоконсервування клітин донорської крові та їх довгострокове зберігання у низькотемпературних банках", що додаються.

2. Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим, керівникам структурних підрозділів з питань охорони здоров'я обласних, Київської та Севастопольської міських державних адміністрацій рекомендувати використання цих Методичних рекомендацій у підпорядкованих закладах переливання крові.

3. Контроль за виконанням цього наказу покласти на заступника Міністра - керівника апарату А. Терещенко.

1. Ці Методичні рекомендації визначають загальні принципи кріоконсервування клітин донорської крові та їх довгострокового зберігання у низькотемпературних банках.

2. У цих Методичних рекомендаціях терміни вживаються у значеннях, наведених у Порядку контролю за дотриманням показників безпеки та якості донорської крові та її компонентів, затвердженого наказом Міністерства охорони здоров'я України 9 березня 2010 року № 211, зареєстрованого у Міністерстві юстиції України 8 червня 2010 року за № 368/17663.

3. Широкий спектр складних травматичних оперативних втручань, сучасні програми хіміотерапії в гематології, онкології та інших галузях медицини потребують значних об'ємів компонентів донорської крові.

4. Створення низькотемпературних банків клітин крові (еритроцитів, тромбоцитів тощо) забезпечить раціональне використання компонентів донорської крові як в повсякденній медичній практиці, так і в надзвичайних ситуаціях (техногенні катастрофи, природні катаклізми тощо).

5. Заклади служби крові можуть користуватися різними методами кріоконсервування еритроцитів та інших клітин крові, застосовувати різне кріогенне обладнання для їх довгострокового зберігання. Довгострокове зберігання компонентів крові у замороженому стані та створення їх запасів у низькотемпературних банках має забезпечити ефективну роботу закладів охорони здоров'я з надання трансфузійної допомоги населенню.

6. Кріоконсервування надає нові можливості у забезпеченні стандартів якості і безпеки заготівлі, зберігання і застосування компонентів крові, дозволяє заготовляти і тривалий час зберігати не тільки донорську, а й аутологічну кров, створювати запаси еритроцитів рідкісних груп, сприяти уникненню багатьох ускладнень, пов'язаних з трансфузіями компонентів крові, у тому числі ризику передачі гемотрансмісивних інфекцій (ВІЛ, гепатити B і C, сифіліс тощо).

7. Багаторічний досвід клінічного застосування еритроцитів, кріоконсервованих з кріоконсервантом "Пропандіосахароль", показав їх високу клінічну ефективність.

8. Фундаментальні розробки в галузі кріобіології та досягнення у створенні спеціальної кріогенної апаратури для заморожування і зберігання клітин крові в умовах низьких та помірно низьких температур дозволили реалізувати розроблені методики кріоконсервування компонентів крові.

9. У Методичних рекомендаціях наведені методи заморожування, зберігання, розморожування клітин крові, які пройшли клінічну апробацію і знайшли практичне застосування, способи підготовки кріоконсервованих клітин до трансфузій, рецептура кріоконсервантів і розчинів для відмивання, ресуспендуючих розчинів.

10. Методи кріоконсервування еритроцитів при ультранизьких -196 °C або низьких -150 °C : -140 °C температурах на основі використання кріоконсерванту "Пропандіосахароль", головним компонентом якого є кріопротектор 1,2-пропандіол. Методи кріоконсервування еритроцитів з кріоконсервантом "Пропандіосахароль" відрізняється спрощенням процедури обробки клітин перед кріоконсервуванням, стабільним відтворенням результатів кріоконсервування, можливістю обмеження кількості відмивань розморожених еритроцитів (1- або 2-кратне відмивання) і, таким чином, спрощенням і здешевленням процесу кріоконсервування еритроцитів нарівні з високою його ефективністю.

11. Метод кріоконсервування еритроцитів при помірно низькій температурі -40 °C передбачає використання висококонцентрованого розчину гліцерину (39,6% у кінцевій концентрації).

12. Перевага методу полягає в тому, що він здійснюється в доступних для практичної медицини електричних рефрижераторах, що є економічно доцільнішим у порівнянні з методом, який базується на використанні ультранизьких температур.

13. Для реалізації застосування методів кріоконсервації клітин крові пропонуються рекомендації з організації відділення довгострокового зберігання заморожених клітин крові, що наведені у додатку 1 до Методичних рекомендацій.

1. Сучасні методи і технології кріоконсервування клітин донорської крові людини при ультранизьких (в рідкому азоті при - 196 °C або його парах при - 150 °C : - 140 °C) та помірно низьких температурах (в холодильних камерах при -80 °C та -40 °C) базуються на застосуванні:

кріозахисних середовищ різного складу, головним компонентом яких є кріопротектор;

різних швидкостей охолодження-заморожування (швидкі, помірно низькі).

2. У результаті досліджень і розробки теоретичних основ кріоконсервування біологічних систем, вивчення реакцій живих клітин на вплив низьких температур і фізико-хімічних процесів, що відбуваються в них:

створено методи захисту від пошкоджуючої дії чинників заморожування;

досліджено можливості репарації та відновлення життєздатності заморожених клітин;

визначено найбільш ефективні кріопротекторні сполуки;

розроблено методи кріоконсервування.

3. Усі кріопротектори поділяють на ендоцелюлярні, які проникають у клітину, і екзоцелюлярні - непроникаючі. Для кожного класу кріопротекторів запропоновані відповідні теорії механізму кріозахисту біологічних систем, для яких провідним і загальним чинником є здатність кріозахисних сполук утворювати міцні зв'язки з молекулами води і, таким чином, впливати на процеси кристалоутворення, фазовий перехід вода-лід в кріобіологічних системах при заморожуванні-відтаюванні.

4. Досвід клінічного застосування еритроцитів, кріоконсервованих при помірно низьких температурах, свідчить про їх високі функціонально-морфологічні властивості та високу терапевтичну ефективність.

1. Характеристика еритроцитів.

Донорську кров заготовлюють на одному з гемоконсервантів, які застосовуються в службі крові, у стерильні апірогенні системи полімерних гемоконтейнерів.

Еритроцити для кріоконсервування отримують з консервованої крові методами первинного фракціонування без наступної переробки, шляхом центрифугування в рефрижераторних центрифугах або методами аферезу. Кріоконсервуванню підлягають еритроцити, які відповідають вимогам якості та безпеки, були отримані в день взяття крові у донора або після зберігання при температурі 4 ± 2 °C протягом 1 - 2 діб.

2. Контроль якості еритроцитів для кріоконсервування:

1) використовують еритроцити з видаленням більшої частини плазми (компонент "Еритроцити") або еритроцити з видаленим тромболейкоцитарним шаром (компонент "Еритроцити з видаленим тромболейкоцитарним шаром (ТЛШ)". Гематокрит еритроцитів з видаленим ТЛШ повинен знаходитись у межах 0,65 - 0,75, вміст гемоглобіну - не менше 43 г у дозі;

2) використання для кріоконсервування еритроцитів з видаленим ТЛШ має переваги через видалення більшої частини лейкоцитів та тромбоцитів. Залишковий вміст лейкоцитів у дозі еритроцитів повинен бути менше 1,2 х 10-9/л у дозі, а залишкова кількість тромбоцитів - менше 20 х 10-9/л у дозі.

3. Технологічні рекомендації до отримання еритроцитів:

1) усі операції з кріоконсервування потрібно виконувати в закритій системі, із застосуванням зварювача магістралей і забезпеченням стерильності;

2) отримані компоненти потрібно заморожувати відповідно до стандартних операційних процедур технологій кріоконсервування, згідно з вибраною програмою та методичними рекомендаціями.

4. Методи кріоконсервування еритроцитів.

При кріоконсервуванні еритроцитів донорської крові людини використовуються два основні базові методи в різних модифікаціях:

1) кріоконсервування еритроцитів при ультранизьких температурах, що передбачає швидке заморожування еритроцитів у рідкому азоті з застосуванням кріопротекторів у кінцевій концентрації приблизно 20% і наступним зберіганням у рідкому азоті (-196 °C) або його парах (-150 : -140 °C). При заморожуванні з низькою концентрацією кріопротекторів велике значення має швидкість заморожування (тепловідведення) суспензії еритроцитів з кріозахисними розчинами, для чого використовуються металеві холдери і кріокасети відповідної конструкції. Методи, що дозволяють зберігати еритроцити у біологічно повноцінному, життєздатному стані протягом багатьох років, наведено у додатку 2 до Методичних рекомендацій;

2) кріоконсервування при повільному заморожуванні і зберіганні еритроцитів при помірно низьких температурах (-80 °C, -40 °C) у електричних рефрижераторах, з використанням високих концентрацій кріопротекторів (кінцева близько 40%). Як кріопротектор переважно застосовують гліцерин. Термін зберігання таких еритроцитів залежно від технології становить до 5 років. Методи повільного заморожування і зберігання еритроцитів наведено у додатку 3 до Методичних рекомендацій;

3) доцільно заморозити зразки сироватки доз, закладених на довгострокове зберігання, для того щоб виконати відповідні дослідження;

4) для підготовки кріоконсервованих еритроцитів до клінічного застосування проводиться процедура їх розморожування та відмивання від кріопротектора. Всі способи відмивання еритроцитів ґрунтуються на принципі поетапного розведення суспензії розморожених еритроцитів гіпертонічними розчинами сполук, які не проникають в клітину - дисахариди, багатоатомні спирти, електроліти у поступово знижуючих концентраціях;

5) технологія видалення кріопротектора базується на застосуванні методів:

повторного серійного центрифугування;

автоматичного відмивання за допомогою спеціальних сепараторів, в замкнутій стерильній системі в безперервному потоці розчинів;

прискореної седиментації еритроцитів - зворотної цитагломерації у низькоіонному середовищі гіпертонічних розчинів цукрів.

Для відмивання використовують стандартні розчини.

5. Методи кріоконсервування тромбоцитів розчином "Тромбокріодмац" рекомендується для заморожування і довгострокового зберігання концентратів тромбоцитів у рідкому азоті при -96 °C з метою подальшого клінічного застосування. Розчин "Тромбокріодмац" проявляє кріозахисну дію при повільному заморожуванні-розморожуванні тромбоцитів. При тривалому (до двох років) зберіганні заморожених концентратів тромбоцитів після розморожування зберігається більш ніж 80% клітин, з яких 50% є життєздатними і функціонально повноцінними за тестами in vitro. Методи кріоконсервування тромбоцитів наведено в додатку 4 до Методичних рекомендацій.

Після відмивання проводиться ресупендування відмитих еритроцитів та контроль їх якості, який наведено в додатку 5 до Методичних рекомендацій.

1. У відділенні довгострокового зберігання заморожених клітин крові (далі - кріобанк) здійснюється кріоконсервування та тривале зберігання компонентів донорської крові людини для клінічного застосування.

Для організації роботи кріобанку потрібні:

1) спеціальна апаратура та кріогенне обладнання;

2) відповідне приміщення для раціонального розміщення в ньому обладнання;

3) регулярне постачання рідкого азоту в необхідній кількості;

4) регулярне живлення електричним струмом;

5) кваліфіковане обслуговування та догляд за обладнанням;

6) система документації, облік надходження, зберігання та видачі компонентів крові;

7) комп'ютерні програми.

2. При організації кріобанку слід враховувати необхідність забезпечення якості та безпеки трансфузій кріоконсервованих компонентів крові.

1. Обладнання кріобанку можна розділити на чотири основні функціональні частини, склад яких визначається цільовим призначенням робіт: обладнання для підготовки та кріоконсервування, обладнання для зберігання, обладнання для відмивання (дегліцеринізації), транспорт та обладнання для транспортування.

2. Для функціонування кріобанку використовують два типи холодильного обладнання: комплект спеціального кріогенного обладнання, яке працює на рідкому азоті (-196 °С), і електрохолодильники (морозильні камери) на -80 °С, -40 °С.

3. До переліку спеціалізованого кріогенного обладнання входять:

1) зовнішній резервуар (танк) з рідким азотом (в разі облаштування централізованої подачі зрідженого азоту) (1500 л);

2) вакуум-ізольований трубопровід;

3) кріосховища об'ємом 500 - 1000 л, які використовують зріджений азот для зберігання зразків у зрідженому азоті при -196 °С або в його парах -140 : -150 °С;

4) кріосховища об'ємом 100 - 250 л, обладнані зовнішнім кожухом ("кабінетом");

5) посудини Дьюара різного об'єму для транспортування в зрідженому азоті, зберігання зрідженого азоту та його подачі в системи для програмного заморожування;

6) морозильні камери на -80 °С, -40 °С;

7) програмний заморожувач біологічних об'єктів;

8) система постачання рідкого азоту до програмного заморожувача;

9) розморожувач біологічних об'єктів;

10) переносні морозильники для транспортування;

11) система контролю кріосховища (цілодобовий моніторинг температури і рівня рідкого азоту, сигналізація);

12) комп'ютери та відповідне програмне забезпечення для створення баз даних заморожених біологічних об'єктів, які зберігаються в кріобанку, та проведення моніторингу;

13) електронні системи контролю роботи обладнання та архівації даних;

14) стаціонарні та персональні датчики рівня кисню;

15) допоміжне оснащення.

4. Кріобанк оснащується також спеціалізованим медичним та лабораторним обладнанням.

5. Після охолодження до температури зберігання (температура рідкого азоту -196 °С або пари азоту -150 °С) кріопробірки, контейнери з компонентами крові тощо зберігаються в кріосховищі протягом тривалого терміну. Кріосховище - це посудина Дьюара великого об'єму (від 100 до 1000 л) з широкою горловиною, що забезпечує зручний доступ всередину. Внутрішній простір кріосховища оснащується системою стійок, висувних стелажів, укладок та осередків, що забезпечують зручну систематизацію і швидкий доступ до потрібного контейнера. Кріосховища також можуть відрізнятися відповідно до свого функціонального призначення - для частої роботи з великою кількістю об'єктів (кріобанки певних клітин крові) планують великі кріосховища з широкою горловиною та поворотною системою зберігання.

6. Під час експлуатації кріобанків необхідно регулярно поповнювати запаси азоту в них. Для цього приміщення, в якому розташовані сховища, оснащують транспортними трубопроводами, що мають контрольне та аварійне устаткування. Для більш надійної та зручної експлуатації кріосховищ вони можуть бути обладнані системою автоматичного доливання рідкого азоту.

7. Для забезпечення надійного зберігання компонентів крові при належній температурі морозильні камери та кріосховища мають бути оснащені електронною системою контролю температури та рівня зрідженого азоту. Кожне кріосховище має бути обладнане системою контролю кріосховищ (СКК), яка призначена для цілодобового моніторингу температури і рівня холодоносія (рідкий азот) у кріосховищах з одночасним архівуванням інформації та можливістю передачі її в персональний комп'ютер.

8. Сучасні електричні рефрижератори (морозильні камери) кріобанку мають різні типи сигналізації, наприклад, для підвищення температури, відключення електроживлення, відкритих дверей. Для морозильних камер сигналізація включається, коли температура в камері стає вище -65 °C.

9. Електропостачання всієї електричної апаратури (морозильні камери) повинно бути продубльоване системами безперебійного живлення.

10. Кріобанк має бути оснащений комп'ютерною системою бази даних, в якій відображено точне розміщення об'єктів в кріобанку, повна легенда та історія.

11. Кріобанк повинен мати запасне обладнання для зберігання об'єктів на випадок аварійної ситуації. Потрібно мати по одній запасній одиниці програмного заморожувача, морозильної камери, кріосховища. Запасні одиниці обладнання мають знаходитися весь час в робочому стані при робочій температурі. У великих кріобанках загальний вміст запасного обладнання становить 3% від усього обладнання кріобанку.

12. У кріобанках, в яких використовується зріджений азот, має бути забезпечений його запас мінімум на 3 дні роботи кріобанку, плюс 20% від щоденного споживання зрідженого азоту на випадок аварійної ситуації.

1. Приміщення, в якому розміщують кріобанк, має бути обладнане відповідно до санітарних норм і правил, а також нормативних документів з проектування та експлуатації підприємств, працюючих із зрідженими газами.

2. Приміщення кріобанку рекомендується організовувати в окремому блоці, розташованому на першому поверсі або в цокольному приміщенні, для зручної подачі рідкого азоту.

3. Ці приміщення мають бути сухими, з примусовою припливно-витяжною системою вентиляції, водопроводом, підводом електроенергії (220 - 380 В), засобами зв'язку, обігрівом.

4. Приміщення кріобанку має складатися як мінімум з 2-3 кімнат.

5. У кімнаті площею не менше 25 м-2 розміщують обладнання, необхідне для заморожування компонентів крові:

1) програмний заморожувач;

2) спеціальне обладнання для заморожування безпосередньо в рідкому азоті;

3) пристрій для розморожування;

4) комп'ютеризований центр управління і моніторингу роботи кріобанку;

5) посудини Дьюара середнього об'єму для транспортування кріоконсервованого матеріалу.

6. Приміщення площею не менше 50 м-2 використовується для установки кріосховищ з рідким азотом. Площа цього приміщення має створювати умови для просторого розміщення кріосховищ, вільного обслуговування та переміщення кожного зі сховищ. Між сховищами повинні залишатися проходи, зручні для завантаження/вивантаження матеріалів, що зберігаються, та перевезення транспортних судин Дьюара. Отвір для дверей повинен забезпечувати вільне переміщення кріосховищ (більше 1,2 м).

7. Допоміжна третя кімната (не менше 10 м-2) призначена для обслуговуючого персоналу. Бажано, щоб вона була розташована поряд з першою.

8. Можливе використання додаткових приміщень, наприклад, для зберігання запасних частин до апаратури, кріоконтейнерів для клітин крові тощо.

9. Асептичну частину роботи банку з кріоконсервування клітин крові та їх підготовки до трансфузій після розморожування проводять у боксованих приміщеннях кріобанку. У разі їх відсутності у кріобанку, ця робота може виконуватися у відповідних підрозділах центрів крові (СПК) або відділеннях трансфузіології.

1. Кріобанк повинен бути оснащений системою охоронної сигналізації, яка повинна функціонувати цілодобово.

2. У кріобанку має бути налагоджена система швидкого реагування в разі виникнення небезпечної ситуації.

Кріобанк має бути оснащений системою протипожежної безпеки згідно з діючими нормами.

1. Кріобанк повинен бути оснащений електронною системою контролю доступу. Двері повинні бути замкнені. Доступ до ключів повинні мати лише авторизовані особи. Має здійснюватися моніторинг і архівування даних з доступу кожного із членів персоналу до кріобанку. Система охорони, яка має включати детектори відкривання дверей, пристрої сигналізації, повинна забезпечувати надійний захист від неавторизованого проникнення в кріобанк.

1. Внутрішнє оснащення приміщень повинно відповідати їх функціональному призначенню. У чистих зонах усі відкриті поверхні мають бути гладкими, непроникними і непошкодженими, щоб звести до мінімуму утворення і накопичення часток або мікроорганізмів, а також дозволити багаторазово застосовувати очищувальні та при необхідності дезінфікуючі засоби.

2. Перекриття підлог мають витримувати вагу всього обладнання з урахуванням заповнення його рідким азотом і матеріалами, а також активне навантаження робочого персоналу.

3. Покриття підлоги має бути виконане з твердих непористих, не пилоутворюючих, термостійких матеріалів, що витримують різкі перепади температури, кріогенні температури (до -200 °С), а також витримувати тиск опор сховищ і механічне навантаження до 1 т/м-2.

4. Покриття стін, стель має бути виконано з твердих непористих, не пилоутворюючих матеріалів, що забезпечують міцне кріплення контрольно-вимірювального та трубопровідного устаткування.

5. Підвісні стелі мають бути герметизовані з метою запобігання контамінації з простору над ними. Труби, канали та інші комунальні комунікації та пристрої мають бути встановлені таким чином, щоб не утворювалися заглиблення і незакриті отвори, а також були відсутні поверхні, не доступні для очищення.

6. Для зменшення накопичення пилу і полегшення прибирання в приміщеннях не повинно бути заглиблень, що не піддаються очищенню, і має бути якнайменше країв, які виступають, полиць, шаф і обладнання. Двері мають бути сконструйовані без заглиблень, недоступних для очищення; з цієї ж причини небажано використовувати розсувні двері.

7. У приміщенні не повинно розміщуватися стороннє (нагрівальне, електричне та інше) обладнання.

8. Приміщення кріобанку має бути обладнане примусовою припливно-витяжною вентиляцією. Системи витяжної вентиляції робочих приміщень, в яких знаходяться кріосховища з біологічним матеріалом, повинні бути обладнані фільтрами тонкої очистки повітря.

9. Приміщення кріобанку повинно мати центральне опалення. Температура повітря в робочих приміщеннях повинна підтримуватися в межах 18 - 20 °С.

10. Приміщення кріобанку повинні бути обладнанні водопроводом з гарячою і холодною водою та каналізацією. Стоки повинні бути відповідних розмірів і обладнані для запобігання зворотному потоку. По можливості слід уникати відкритих зливних жолобів; якщо вони необхідні, то повинні бути неглибокими для полегшення очищення і дезінфекції. Раковини розміщують біля виходів, біля раковин встановлюють пристрої для миючих і дезінфікуючих засобів. Зливники у підлозі в чистих кімнатах мають бути забезпечені сифонами або водяними затворами для запобігання зворотному потоку.

11. Приміщення кріобанку повинне мати природне і штучне освітлення, або штучне освітлення. Світильники і арматура мають бути закритого типу та забезпечувати зручну роботу з матеріалами і обладнанням.

12. Магістральні короби припливно-витяжної вентиляції, електричних, водопровідних, каналізаційних мереж розміщують в спеціальних нішах коридорів для забезпечення вільного доступу до них під час профілактичного огляду і ремонту.

13. Приміщення кріобанку клітин крові обладнуються бактерицидними лампами. Вимикачі бактерицидних ламп повинні бути винесені з робочих приміщень.

14. Електричні проводи, електрообладнання повинні відповідати "Правилам улаштування електроустановок" (ПУЕ), "Правилам технічної експлуатації електроустановок споживачів" (ПТЕ), ДНАОП 0.00-1.21 - 98.

15. Експлуатацію обладнання, працюючого під тиском, проводять відповідно до ДНАОП 0.00-1.07-94 "Правила будови і безпечної експлуатації посудин, що працюють під тиском".

1. До роботи в кріобанку допускаються особи не молодше 18 років, що мають відповідну освіту та кваліфікацію, а також пройшли спеціальне навчання з роботи із кріогенним обладнання, зрідженим азотом, добре засвоїли правила безпеки та охорони праці при роботі в кріобанку та ознайомлені із правилами надання першої допомоги в аварійних ситуаціях.

2. Для функціонування низькотемпературного банку клітин крові, в якому передбачається зберігання від 300 до 1000 доз компонентів крові, необхідно мати не менше 3 - 4 штатних одиниць обслуговуючого персоналу.

3. Медичні працівники проводять процедуру підготовки компонентів крові для заморожування, спеціальну їх обробку після розморожування перед трансфузією.

4. Спеціалісти з кріогенного обладнання: інженер або технік обслуговують устаткування і виконують функції:

1) інженер слідкує за технічним станом всієї апаратури, веде облік контейнерів із замороженими компонентами крові в кріосховищах (їх надходження, зберігання, видача) за журналом і спеціальним графіком-сіткою або комп'ютерною базою даних, видає їх після розморожування, зробленого за заявкою лікаря;

2) технік проводить заморожування і розморожування; він же стежить за рівнем рідкого азоту у сховищах, періодично поповнює їх азотом, забезпечує (контролює) своєчасне постачання рідкого азоту, стежить за роботою кріогенних сховищ, електрохолодильників та іншого обладнання.

5. Технічні інструкції для працівників банку з експлуатації обладнання і роботи в кріобанку складаються на основі діючого законодавства з санітарії і гігієни, захисту праці, протиепідемічних заходаів, біологічної безпеки. Всі інструкції затверджуються керівником установи або закладу, в якій експлуатується низькотемпературний банк клітин крові.

6. Персонал у своїй роботі керується стандартними операційними процедурами (СОП), розробленими для конкретного кріобанку.

7. При роботі із кріогенним обладнанням персонал повинен користуватися захисним одягом, а саме: товстими водонепроникними рукавицями та фартухами (кріорукавиці, кріофартух), маскою для обличчя. Взуття має бути високим і водонепроникним.

1. У відділенні кріобанку треба мати технологічні інструкції, зміст яких включає:

1) дані про основне обладнання, що застосовується;

2) методи, що використовуються для підготовки необхідного обладнання (наприклад: очищення, монтаж, калібрування, стерилізація);

3) докладний опис етапів технологічного процесу кріоконсервування клітин крові (наприклад, попередня підготовка, заморожування, температурні режими зберігання тощо).

2. Документація ведеться в низькотемпературному банку, а також операційному відділенні, де виконуються всі роботи, пов'язані з кріоконсервуванням клітин крові (підготовка до заморожування, обробка клітин після розморожування перед трансфузією). Основні відомості про групову належність клітин крові та всі інші дані про заморожені зразки заносяться лікарем в комп'ютерну базу даних та/або спеціальний журнал реєстрації заморожених компонентів крові.

3. Комп'ютеризована система обліку замороженого матеріалу, який зберігається у кріобанку, забезпечує реєстрацію даних про заморожені компоненти крові і їх пошук за датою (закладка, вилучення), адресою зберігання (№ кріосховища, № укладки, касети), видом об'єкта (еритроцити, тромбоцити тощо). Користування комп'ютерною програмою дозволяє отримати повну інформацію про кріоконсервований матеріал (маркування, тип пакування, об'єм зразка, програма заморожування, кріозахисний розчин, тривалість зберігання зразка та спосіб розморожування, що рекомендується, тощо). При необхідності вилучення того чи іншого кріоконсервованого матеріалу відповідну інформацію вводять у комп'ютер і отримують всі необхідні дані.

4. У всіх комп'ютеризованих системах мають бути передбачені засоби, що забезпечують дублювання інформації, захист даних та їх запис іншим способом.

5. Журнал реєстрації заморожених компонентів крові зберігається у лікаря кріобанку. У цьому журналі знаходиться інформація, що є необхідною для швидкого знаходження у кріосховищі потрібного контейнера за зареєстрованим номером. У документах відділення донорських кадрів повинні бути продубльовані дані низькотемпературного банку клітин крові про номери контейнерів, в яких вони зберігаються.

6. Обов'язковий контроль якості розморожених клітин крові і бактеріологічний контроль розморожених зразків проводяться у спеціалізованих лабораторіях установи або закладу служби крові. До лікувальних установ та закладів розморожені компоненти крові мають право видавати тільки установи (заклади) служби крові.

1. Необхідне регулярне поповнення запасу рідкого азоту в кріосховищах, який випаровується під час їх експлуатації.

2. Для покриття витрат рідкого азоту на виконання робіт із заморожування та зберігання клітин крові визнають місячне його споживання.

3. Транспортування рідкого азоту здійснюється відповідно до Закону України "Про перевезення небезпечних вантажів" .

1. Обслуговуючий персонал повинен знати правила безпеки і отримати відповідний допуск. Персонал інформують про наступне:

1) підвищення концентрації азоту в приміщенні (вміст кисню менше 18%) призводить до головного болю, сонливості, загальної слабкості та втрати свідомості;

2) у приміщенні, в якому розміщене обладнання з рідким азотом, повинна постійно працювати припливно-витяжна вентиляція;

3) забороняється обслуговування обладнання з рідким азотом однією людиною, у приміщенні повинні знаходитися не менше двох осіб;

4) для занурення предметів у рідкий азот або їх вилучення необхідно користуватися спеціальними пристроями.

2. При втраті свідомості від підвищеної концентрації азоту в приміщенні необхідно:

1) негайно винести потерпілого на свіже повітря;

2) звільнити від одягу, що затрудняє дихання, а в разі його зупинки зробити штучне дихання;

3) викликати екстрену медичну допомогу.

3. У приміщенні, де розміщено кріогенне обладнання, необхідно проводити аналіз повітря за допомогою переносного лабораторного газоаналізатора - концентрація кисню в повітрі має бути не менше 19% (в середньому 21%).

4. Періодично, один раз на 6 місяців, необхідно перевіряти процентний вміст кисню в рідкому азоті, що знаходиться в кріосховищах - концентрація кисню не повинна перевищувати 20%. Вимірювання здійснюють переносним лабораторним газоаналізатором.

5. Суміш, в якій міститься 25% рідкого кисню, є вибухонебезпечною.

6. Заправка кріогенних ємностей рідким азотом, їх технічний стан щоденно реєструється у спеціальному журналі відповідальною особою.

Для раціонального використання комплектуючого обладнання складається графік проведення регламентних і профілактичних заходів протягом року. Терміни всіх регламентних робіт, а також перелік заходів, що мають бути виконані, вказані в інструкціях з експлуатації кріогенного обладнання.

1. До вимог зберігання клітин крові входить:

1) якщо технологічний регламент кріоконсервування клітин крові передбачає їх довгострокове зберігання при -196 °С, контейнери мають бути занурені і зберігатися у рідкому азоті. Перепад температур у заморожених зразках під час зберігання не повинен перевищувати -196 °С : -150 °С;

2) для зберігання кріоконсервованого матеріалу у парах азоту (не нижче -150 ° : -140 °С) необхідно використовувати кріосховища зі спеціальним устаткуванням, яке стабільно підтримує вказану температуру;

3) доцільно зберігати в окремих кріосховищах однотипний заморожений біоматеріал: еритроцити, тромбоцити тощо;

4) кріоконтейнер з замороженими клітинами крові, призначеними для трансфузії, бажано зберігати у додатковому герметичному пакеті. Використання додаткового пакування запобігає ризику перехресної контамінації при зберіганні в рідкому азоті та сприяє збереженню клітин при розморожуванні у випадку порушення цілісності контейнера.

Кріоконсервант "Пропандіосахароль":

1,2-пропандіол (ДФУ 2004, доповн.1, С.441-442) - 370,0 г

Сахароза безводна - 32,0 г

Натрію хлорид - 6,0 г

Вода для ін'єкцій - до 1000,0 мл

рН розчину при 20 °С становить 5,5 - 7,5

1) заморожуванню з кріоконсервантом "Пропандіосахароль" підлягають еритроцити з видаленим тромболейкоцитарним шаром ("еритроцити з видаленим ТЛШ");

2) у полімерний контейнер з еритроцитами за допомогою пристрою для стерильного з'єднання трубок додати кріоконсервант "Пропандіосахароль" у співвідношенні 1:1 (за вагою);

3) додавання до еритроцитів кріоконсерванту здійснювати шляхом його нашаровування на клітини по стінках полімерного контейнера;

4) після додавання всього об'єму кріоконсерванту суспензію еритроцитів ретельно перемішати перевертанням полімерного контейнера (8 - 10 разів);

5) після змішування з кріоконсервантом "Пропандіосахароль" суспензію еритроцитів відразу центрифугувати при відцентровому прискоренні 1900 g протягом 15 хв при температурі 4 °С, після чого надлишок кріоконсерванту видалити у додатковий контейнер;

6) об'єм отриманого концентрату еритроцитів у суміші з кріоконсервантом зазвичай становить 230,0 - 250,0 мл;

7) концентрат еритроцитів з кріоконсервантом перевести в стерильний полімерний кріоконтейнер (місткість 1000,0 мл) за допомогою пристрою для стерильного з'єднання трубок. Кріоконтейнер заповнити на 30 - 50% його об'єму (відповідно до рекомендації фірми-виробника) з метою уникнення розриву при заморожуванні. Для кожного типу пластикатних контейнерів для заморожування надається рекомендований мінімальний-максимальний об'єм заповнення: так, для деяких контейнерів місткістю 1000 мл об'єму матеріалу, що заморожується, становить 120,0 - 275,0 мл;

8) після заповнення кріоконтейнера суспензією еритроцитів обережно видалити з нього повітря і провести запаювання вихідного порту;

9) кріоконтейнер з сумішшю еритроцитів з кріоконсервантом розмістити у додатковій спеціальній упаковці, з пакувального пакета видалити повітря і запаяти. Використання додаткової упаковки рекомендується для запобігання ризику перехресної контамінації матеріалу в резервуарі з рідким азотом і збереження клітин у разі порушення цілісності контейнера при розморожуванні;

10) на кріоконтейнері з еритроцитами, у спеціальному віконці для маркування розмістити етикетку "Кріоконсервовані еритроцити - "Пропандіосахароль". Решта інформації - як при маркуванні компонентів крові.

1. Заморожування еритроцитів з кріоконсервантом "Пропандіосахароль" здійснюють за допомогою технології, яка передбачає застосування спеціально сконструйованого устаткування - холдера і камери для фіксованого розміщення холдерів з кріоконтейнерами в ємності з рідким азотом:

1) кріоконтейнер з концентратом еритроцитів розмістити у спеціальному металевому холдері, який надає пластикатному контейнеру з біоматеріалом, що заморожують, необхідну форму і захищає контейнер від механічних пошкоджень;

2) холдер з кріоконтейнером помістити в камеру, а потім - у ємність з рідким азотом, у якій здійснюється процес заморожування протягом 12 - 15 хв;

3) після завершення процедури заморожування кріоконтейнер вийняти з ємності для заморожування та звільнити від камери і холера;

4) контейнер вкласти в металеву кріокасету для захисту полімерних контейнерів при заморожуванні, зберіганні у рідкому азоті або його парах та електричних рефрижераторах, транспортуванні у замороженому стані, завчасно охолоджену для запобігання термічному шоку, і розмістити на стелажах спеціального рідкоазотного сховища, де зберігати в рідкому азоті (-196 °С) або його парах (-150 : -140 °С).

2. Зберігання та стабільність заморожених еритроцитів.

Зберігати в рідкоазотному сховищі при температурі -196 °С (рідкий азот) або його парах (-150 : -140 °С).

Рекомендований термін зберігання заморожених еритроцитів до 10 років.

3. Розморожування еритроцитів:

1) кріокасету з кріоконтейнером вийняти з рідкоазотного сховища і розмістити в спеціальній переносній ємності з рідким азотом (посудина Дьюара);

2) кріоконтейнер із замороженими еритроцитами дістати з касети, розмістити у спеціальному пінопластовому чохлі та залишити при кімнатній (20 : 22 °С) температурі на 25 - 30 хв., у результаті чого відбудеться розморожування суспензії еритроцитів до -110 : -80 °С;

3) кріоконтейнер з еритроцитами помістити в спеціальну водяну баню з автоматичною регуляцією температури та розморожувати при температурі 40 - 42 °С при постійному погойдуванні контейнера - цей процес займає до 10 хв.

4. Відмивання розморожених еритроцитів:

1) відмивання розморожених еритроцитів проводити методом одно- або двократного серійного центрифугування. Для відмивання використовувати спеціальні пластикатні контейнери місткістю 500,0 або 1000,0 мл. Усі маніпуляції з відмивання та видалення консерванту виконуються в асептичних умовах;

2) розморожений концентрат еритроцитів перевести до контейнера для відмивання і до нього струминно, при постійному перемішуванні, додати один із розчинів (№ 1) для відмивання у співвідношенні 1:1 (за вагою) (див. п.1.7);

3) потім до цього ж контейнера, при постійному перемішуванні, додати один із розчинів (№ 2) у кількості, що дорівнює отриманій суміші розморожених еритроцитів і розчину № 1. Загальне співвідношення розморожених еритроцитів і розчинів для відмивання повинно становить 1:3;

4) з контейнера видалити повітря, герметизувати та центрифугувати при відцентровому прискоренні 1900 g протягом 10 хв. при температурі 4 °С. Після центрифугування надосадову рідину видалити у додатковий контейнер;

5) при наявності у видаленій надосадовій рідині значного гемолізу, визначеного візуально за інтенсивним рожевим забарвленням, необхідно здійснити повторне відмивання;

6) при проведенні повторного відмивання до об'єму еритроцитів, що залишився, за допомогою пристрою для стерильного з'єднання трубок додати струминно, при постійному обережному перемішуванні, три об'єми розчину № 2 для відмивання (1:3 за вагою). З контейнера видалити повітря, герметизувати та центрифугувати при 1900 g протягом 10 хв. при температурі 4 °С, надосад видалити.