Відповідно до статті 6 Закону України "Про захист населення від інфекційних хвороб" та Положення про Міністерство охорони здоров'я України , затвердженого Указом Президента України від 13 квітня 2011 року № 467, з метою поліпшення якості лабораторної діагностики сальмонельозів

1. Затвердити Методичні рекомендації "Методи виділення та ідентифікації сальмонел" (далі - Методичні рекомендації), що додаються.

2. Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим, керівникам структурних підрозділів з питань охорони здоров'я обласних, Київської та Севастопольської міських державних адміністрацій, закладів охорони здоров'я, медико-санітарних частин, науково-дослідних інститутів, що належать до сфери управління Міністерства охорони здоров'я України, ректорам вищих медичних (фармацевтичного) навчальних закладів, забезпечити використання Методичних рекомендацій при здійсненні лабораторної діагностики сальмонельозів.

3. Державній санітарно-епідеміологічній службі України (А. Пономаренко) прийняти цей наказ до керівництва та застосування під час здійснення державного санітарно-епідеміологічного нагляду.

4. Департаменту реформ та розвитку медичної допомоги (М. Хобзей), відповідно до покладених завдань та функцій, у межах компетенції, здійснювати контроль за дотриманням Методичних рекомендацій при наданні лікувально-профілактичної допомоги.

5. Контроль за виконанням цього наказу покласти на першого заступника Міністра О. Качура.

1.1. У цих методичних рекомендаціях визначені основні підходи до проведення лабораторних досліджень з метою виявлення та ідентифікації сальмонел в клінічному матеріалі, харчових продуктах і об'єктах середовища життєдіяльності людини.

1.2. Організація і проведення лабораторних досліджень з метою діагностики та профілактики сальмонельозів - важлива складова системи епідеміологічного нагляду. Цей розділ роботи включає кадрове забезпечення, зміцнення матеріальної бази лабораторій, забезпечення їх достатньою кількістю поживних середовищ і діагностичних препаратів гарантованої якості, створення умов для дотримання вимог біобезпеки.

1.3. Дослідження проводяться у відповідності з діючою в лабораторії системою забезпечення якості, яка передбачає контроль поживних середовищ, діагностичних тестів, засобів вимірювальної техніки, обладнання, дотримання параметрів інкубації, стерилізації і знешкодження.

1.4. Дослідження на сальмонели проводять з метою діагностики захворювань, контролю ефективності лікування (контроль перед випискою), виявлення бактеріоносіїв серед перехворілих, контактних із хворими та декретованих груп населення, розслідування спалахів з метою визначення джерел та факторів передачі збудників інфекції, а також з метою визначення відповідності гігієнічним вимогам безпеки харчових продуктів, виявлення обсіменіння об'єктів середовища життєдіяльності людини.

1.5. Комплекс методів діагностики сальмонельозної інфекції, лабораторного контролю харчових продуктів, продовольчої сировини і об'єктів зовнішнього середовища включає:

класичний бактеріологічний (посів досліджуваного матеріалу на відповідні поживні середовища, виділення культур сальмонел і їх ідентифікація);

прискорені та експрес-методи діагностики: імунофлуоресцентний, латексної аглютинації, імуноферментного аналізу (ІФА), імунохроматогріфічний (ІХА);

автоматизовані та напівавтоматизовані системи;

молекулярно-генетичні;

серологічні - РПГА з еритроцитарним діагностикумом і цистеїнова проба, що виявляють специфічні антитіла різної фізико-хімічної природи;

1.6. Кінцевий діагноз сальмонельозу людині може бути поставлений: при спорадичних захворюваннях - тільки при лабораторному його підтвердженні в кожному випадку; на спалахах з встановленою сальмонельозною етіологією у одночасно захворілих - на підставі клінічної картини та епідеміологічних даних.

1.7. Складнощі виділення сальмонел пов'язані з присутністю у складі мікрофлори кишечнику 10 -11 конкурентних мікроорганізмів 300 - 400 видів, непостійним виділенням їх з випорожненнями, травмуванням та загибеллю клітин при транспортуванні. Для подолання цього при виділенні сальмонел обов'язково використовуються методи концентрування, накопичення.

1.8. З метою отримання об'єктивної інформації про циркуляцію сальмонел на території країни, своєчасного відстеження появи нових або зміни домінуючих збудників, необхідно збирати і надсилати до ДЗ "Центральна санітарно-епідеміологічна станція Міністерства охорони здоров'я України" на ідентифікацію, підтвердження та подальше вивчення наступні штами сальмонел:

вперше виділені та такі, що рідко зустрічаються на території регіону; S.Java, S.Paratyphi B, S.Typhi;

у яких утруднене серологічне типування;

стійкі до дезінфекційних засобів та/або мають множинну стійкість до антибіотиків;

виділені під час спалахів;

виділені з матеріалу від померлих;

мають відхилення від типових властивостей.

Бактерії роду Salmonella - лактозонегативні, грамнегативні палички. Спор і капсул не утворюють, добре фарбуються аніліновими барвниками. Рухливі, мають перитрихіальні джгутики, за виключенням S.Gallinarum.

Сальмонели є факультативними анаеробами. Вони добре ростуть на звичайних поживних середовищах та середовищах, що містять жовч. На щільних середовищах можуть утворювати колонії в S та R - формах. На рідких середовищах - S-форми сальмонел ростуть дифузно, R - форми створюють осад, культуральна рідина залишається практично прозорою. Колонії в S-формі середніх розмірів, за винятком окремих серологічних варіантів (S.Paratyphi A, S.Abortusequi, S.Abortusovis, S.Typhisuis та деякі інші), які утворюють більш дрібні колонії діаметром біля 1 мм. На середовищах, що містять лактозу, утворюють безбарвні колонії, на вісмут-сульфітному агарі - колонії чорного або сірого кольору з чорним ореолом, металевим блиском та чорною основою під колонією. Оптимальна температура росту - 35 - 37 °C, pH середовища - 7,2 - 7,4. При більш низькій температурі (20 °C) або більш високій (42 °C) та при іншій реакції середовища (pH від 5,0 до 8,0) вони також можуть розмножуватись, але значно повільніше, ніж при оптимальних умовах. При температурі нижче 5 °C ріст їх повністю припиняється.

Сальмонели біохімічно активні мікроорганізми. Ферментативні властивості різноманітні, не тільки у окремих представників окремих підродів, але можуть відрізнятися в межах одного і того ж серовару. Сальмонели оксидазонегативні, каталазопозитивні, не розщеплюють сечовину, зазвичай утворюють сірководень (S.Paratyphi A, та деякі інші серовари, рідко) і не утворюють індол, хоча іноді зустрічаються окремі серовари або їх різновиди, які утворюють індол. Не ферментують лактозу, саліцин, утилізують цитрат на середовищі Сімонса (S.Typhi не утилізують) і варіабельні на ацетатному агарі.

Для сальмонел характерні ферменти лізин-, орнітиндекарбоксилаза і аргініндегідролаза, хоча відомі штами S.Typhimurium, S.Enteritidis v. ratin та деяких інших сероварів, які мають знижений вміст ферменту лізиндекарбоксилази або зовсім його не мають. Всі сальмонели дають позитивну реакцію з метиловим червоним (далі - MR) і негативну реакцію Фогеса-Проскауера (далі - VP), редукують нітрати, ферментують маніт. Зазвичай ферментують глюкозу з утворенням кислоти та газу, але серед таких сероварів як S.Typhimurium, S.Derby, S.Thompson, S.Enteritidis, S. Paratyphi B, зустрічаються "безгазові" варіанти. Постійно не утворюють газ S.Typhi і S.Gallinarum. Не ферментують сахарозу і адоніт, хоча відомі випадки виділення штамів окремих сероварів, що ферментують сахарозу (S.Newport, S.Meleagridis, S.Stenleyville та ін.). Майже всі сальмонели швидко ферментують сорбіт. Як правило, не розріджують желатину.

Відношення сальмонел до арабінози, дульциту, інозиту, ксилози, рамнози, трегалози, гліцерину за Штерном, а також до d-, і- та L-тартрату, цитрату і мукату неоднакове навіть у межах одного серологічного типу, що дозволяє підрозділяти їх на ряд стабільних біохімічних варіантів.

Сальмонели відносно стійкі в зовнішньому середовищі: витримують pH в діапазоні 4 - 9; у воді відкритих водоймищ та питній зберігаються від 11 до 120 днів; в морській воді - від 15 до 27 днів; в ґрунті - від 1 до 9 міс.; в кімнатному пилу - від 80 днів до 18 міс.; у м'ясі і ковбасних виробах - від 60 до 130 днів (у замороженому м'ясі - від 6 до 13 міс.); у молоці при кімнатній температурі - до 10 днів; в холодильнику - до 20 днів; у вершковому маслі - 52 - 128 днів; у яйцях - до 13 міс.; в сирах - до 1 року; на яєчній шкаралупі - від 17 до 24 днів; в яєчному порошку від 3 до 9 місяців; на овочах і фруктах 5 - 10 днів; на заморожених овочах та фруктах - від 2 тижнів до 2,5 місяців. При нагріванні до 56 °C сальмонели гинуть протягом 45 - 60 хв., при 70 °C - протягом 5 - 10 хв., в товщі шматка м'яса (10 см) витримують кип'ятіння протягом тривалого часу.

Соління та копчення чинить на них незначний вплив. Високі концентрації солей та цукру обмежують або пригнічують ріст сальмонел. Пряме сонячне опромінення діє на них згубно.

Розчини дезінфікуючих засобів (5 % фенол, 3 % хлорамін, 3 % лізол) вбивають сальмонели протягом 2 - 3 хвилин.

Госпітальні штами сальмонел відрізняються множинною стійкістю до антибіотиків і фізико-хімічних чинників середовища (включаючи дезінфектанти).

Резервуари і джерела збудника: багато видів тварин і птахів, зокрема сільськогосподарських, диких і навіть домашніх, у яких серовари сальмонел, небезпечні для людини, викликають як захворювання, так і носійство. Описані випадки зараження сальмонелами від домашніх черепашок і котів. У тварин реалізується фекально-оральний механізм передачі, у птахів можлива також трансоваріальна передача сальмонел. Людина може бути джерелом деяких сероварів сальмонел.

Тварини можуть виділяти збудника місяцями, хвора людина - від 3 днів до 3 тижнів. Близько 1 % інфікованих дорослих і 5 % дітей старше 5 років здатні виділяти сальмонели більше року.

Механізм передачі збудника - фекально-оральний; шлях передачі переважно харчовий; фактори передачі - продукти тваринного походження (м'ясні, молочні, яйця); менше епідеміологічне значення мають риба, рибні продукти, продукти рослинного походження (овочі, фрукти, ягоди), а також дріжджі, кондитерські барвники і навіть наркотичні засоби (марихуана). Вода, переважно, бере опосередковану участь в передачі сальмонел.

Найбільшу небезпеку, як можливі фактори передачі сальмонел, являють продукти та страви, які після приготування не піддають термічній обробці та/або зберігають тривалий час, в тому числі і при кімнатній температурі. При цьому навіть при інтенсивному розмноженні сальмонел в харчових продуктах їх органолептичні властивості (смак, запах) і зовнішній вигляд не змінюється.

Харчові продукти, інфіковані навіть незначними дозами сальмонел (кілька десятків клітин), можуть виявитися факторами передачі.

Не виключається можливість реалізації повітряно-пилового, а також побутового шляху передачі. Природна сприйнятливість людей висока, особливо виражена у дітей перших місяців життя та у людей похилого віку, і підвищується при імунодефіцитах, включаючи СНІД.

Слід відмітити, що останні 20 років набула глобального розповсюдження S.Enteritidis. Представники цього серовару викликають спалахи сальмонельозу при низькій дозі контамінації продукту, а захворювання характеризуються зазвичай більш маніфестними клінічними проявами.

Рід Salmonella входить до родини Enterobacteriaceae і складається з мікроорганізмів, споріднених за фенотиповими і генотиповими властивостями. Ферментативні ознаки сальмонел, покладені в основу їх поділу на підвиди, представлені в таблиці 1.

За сучасною класифікацією рід Salmonella представлений двома видами - S.enterica і S.bongori.

Вид S.enterica ділиться на 6 підвидів (subsp.), які позначаються наступними символами:

I - або назва серовару для сероварів виду S.enterica subsp. enterica;

Для інших підвидів виду S.enterica введені наступні позначення:

II - для сероварів виду S.enterica subsp.salamae;

IIIa - для сероварів виду S.enterica subsp.arizonae;

IIIb - для сероварів виду S.enterica subsp.diarizonae;

IV - для сероварів виду S.enterica subsp.houtenae;

VI - для сероварів виду S.enterica subsp.indica;

V - Вид S.bongori - для серовара S.bongori subsp. bongori. Всі серовари виду S.bongori мають символ V.

Розподіл на підвиди має певне епідеміологічне значення, оскільки основним, природним резервуаром сальмонел підвиду I є теплокровні тварини, а для представників решти підвидів (II, IIIa, IIIb, IV, VI) і виду S.bongori - холоднокровні тварини і навколишнє середовище. Диференціальна характеристика видів і підвидів Salmonella надана в таблиці 1.

__________

(*) - S.Typhimurium d, S.Dublin -;

Позначення реакцій:

"+" - 90 % або більше позитивних реакцій;

"-" - 90 % або більш негативних реакцій;

d - різні серовари дають різні реакції

Сальмонели кожного підвиду розділяються на серологічні варіанти за O- і H-антигенною характеристикою. Доповнені схеми Кауфмана-Уайта, що випускаються періодично Референс-центром ВООЗ по сальмонелам (Інститут Пастера, Париж) ґрунтуються саме на цих принципах номенклатури сальмонел. Так, 8 видання схеми Кауфмана-Уайта, опубліковане в 2001 році, включає 67 серологічних груп і перелік антигенної структури 2501 серовара сальмонел, відомих на даний час (додається).

Підвид I (S.enterica subsp. enterica) є найчисленнішим і включає абсолютну більшість відомих сероварів сальмонел. Кількість сероварів кожного підвиду дана в таблиці 2.

Число відомих серологічних варіантів сальмонел постійно зростає. Разом з тим світовий досвід указує, що не більше 200 з них мають значення в патології людини, а широкого розповсюдження набули і грають істотну епідеміологічну роль не більше 50. Переважна більшість сальмонел, ізольованих від людей в нашій країні і за кордоном, відносяться до чотирьох серологічних груп - B C D E (98 - 99 %), а до інших 63 серологічних груп - не більше 1 - 2 %.

Проте в світі накопичено чимало фактів про те, що всі відомі сальмонели потенційно патогенні і можуть викликати інфекційний процес у людей, тварин, птахів. Чисельні спостереження указують на те, що будь-який із сероварів сальмонел може стати причиною самих різноманітних клінічних форм хвороби - від тяжких генералізованих форм до безсимптомного носійства. Однак це в більшій ступені відноситься до сальмонел підвиду I. Патогенність для людей сальмонел - представників інших підвидів і виду S.bongori (V) практично не вивчена.

В клінічній практиці немає необхідності зазначати підвид. Необхідним для ідентифікації є тільки назва серовару підвиду enterica. При зазначенні серовару сальмонел перша буква повинна бути заголовною (S.Typhimurium, S.Dublin, S.Moscow і ін.), а при позначенні виду або підвиду - прописна. В звичайній практиці можливо використання двох варіантів назв: Salmonella ser. Typhimurium або Salmonella Typhimurium (скорочено - S.Typhimurium).

Серовари інших підвидів S.enterica або S.bongori позначають тільки номером підвиду і їх антигенною формулою. Наприклад: II-O1,6,14 H, e, n, x, z 15. Це означає, що штам з такою антигенною характеристикою відноситься до виду enterica subsp. Salamae.

4.1. Загальні вимоги

4.1.1. Відбір проб здійснюють з дотриманням правил асептики з метою виключення можливості контамінації їх за рахунок суміжних областей шкіри, інших органів, зовнішнього середовища тощо.

4.1.2. Відібраний біологічний матеріал ретельно упаковують, щоб уникнути контамінації сторонньою мікрофлорою, заповнюють форму 204/о "Направлення на мікробіологічне (бактеріологічне, вірусологічне, паразитологічне) дослідження", затверджену наказом МОЗ України від 04.01.2001 № 1 .

4.1.3. Відібрані проби харчових продуктів, інших об'єктів середовища життєдіяльності людини поміщають в стерильний посуд (склянки, пробірки, флакони), нові поліетиленові пакети, стерильний пергаментний папір, ретельно закривають і упаковують, заповнюють форму № 205/о "Направлення на санітарно-мікробіологічне дослідження", затверджену наказом МОЗ України від 04.01.2001 № 1 .

4.1.4. Супроводжувальну документацію упаковують окремо від проб. Ємкості з матеріалом повинні бути промарковані відповідно до направлення. Забороняється обертати направлення навколо ємкості з об'єктом досліджень, вкладати в контейнер. Направлення зберігаються в лабораторії протягом терміну, визначеного в установленому порядку.

4.1.5. При направленні проб харчових продуктів, відібраних за епідпоказами, додатково вказують, який з продуктів є підозрюваним, як фактор ризику.

4.1.6. Матеріал для мікробіологічного дослідження в лабораторію доставляють в контейнерах, що виключають пошкодження первинних контейнерів з матеріалом.

4.1.7. Категорично забороняється доставка матеріалу в лабораторію особами, яких обстежують.

4.1.8. Загальні вимоги до відбору, пакування та транспортування матеріалу в лабораторію викладені в ДСП 9.9.5.-080-2002 "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю" , затверджених постановою Головного державного санітарного лікаря України від 28.01.2002 № 1.

4.2. Відбір та доставка біологічного матеріалу

4.2.1. Матеріалом для мікробіологічних досліджень на наявність сальмонел у людини є: кров, випорожнення, блювотиння, промивні води шлунка, сеча, а при наявності показів - жовч, дуоденальний вміст, ліквор, гній, ексудат; у летальних випадках - секційний матеріал.

4.2.2. Кров для бактеріологічного дослідження, у зв'язку з короткочасністю бактеріємії при сальмонельозах, беруть обмежено і в найбільш ранні строки хвороби, а також повторно у період лихоманки, або в розпалі рецидивів стерильним одноразовим шприцом з ліктьової або іншої вени в об'ємі 2 - 10 см -3 в залежності від віку. В більш пізні терміни або при слабо вираженій клінічній картині - 15 - 20 см -3. У дітей до одного року кров беруть в доступних кількостях з пальця, п'яти або мочки вуха. Відібрану кров засівають біля ліжка хворого. За вимогою лікаря може бути зроблена бактеріоскопія "товстої краплі".

4.2.3. Випорожнення забирають для дослідження з перших годин захворювання по можливості до початку лікування, особливо антибіотиками; потім - у міру необхідності, протягом усього періоду хвороби і перед випискою зі стаціонару. Варто звернути увагу на забір більш рідких порцій безпосередньо після дефекації. На суднах, горщиках тощо, звідки робиться відбір, не повинно бути слідів дезінфекційних засобів. Забір проводять скляною паличкою, шпателем або ректальною петлею.

При неможливості отримання випорожнень після дефекації матеріал відбирають безпосередньо із прямої кишки за допомогою ректальної петлі або тампона, вводячи його в кишку на 8 - 10 см.

При профілактичному обстеженні здорових осіб з метою виявлення носійства, випорожнення забирають за допомогою одноразових тампонів. При масових обстеженнях допускається використання ректальних петель. Матеріал для дослідження на носійство сальмонел, взятий на дому за відсутності медичного працівника, на дослідження не приймається.

Відібраний матеріал поміщають у стерильний посуд з консервантом; можна використовувати середовище збагачення, але при цьому обов'язково паралельно проводиться прямий посів на щільні поживні середовища.

4.2.4. Блювотиння і промивні води шлунка збирають, при наявності відповідної симптоматики в кількості до 100 см -3 у стерильний посуд. Для дослідження відбирають перші порції промивних вод і тільки в тих випадках, коли хворий не отримував для промивання шлунка марганцевокислий калій чи інші бактерицидні засоби.

4.2.5. Сечу у кількості 20 - 30 см -3 збирають в стерильний посуд після ретельного туалету сечостатевих органів. Першу порцію сечі для аналізу не беруть. Дослідження проводять при підозрі на черевний тиф або паратифи на 1 - 3 тижні від початку захворювання.

4.2.6. Жовч (дуоденальний вміст) збирають натщесерце при дуоденальному зондуванні у стерильні пробірки. При цьому окремо збирають дуоденальний вміст, пузирну жовч і жовч з жовчних протоків (відповідно порції A, B, C). Кисла реакція, білуватий відтінок, наявність пластівців роблять матеріал непридатним для бактеріологічного дослідження. При оперативному втручанні пробу збирають за допомогою шприца, стерильної піпетки або тампону. Питання необхідності дослідження жовчі вирішує клініцист, з метою контролю формування або наявності бактеріоносійства.

4.2.7. Ліквор підлягає дослідженню при наявності менінгеального або менінгоенцефалітичного синдрому. Пробу (3 - 5 см -3) збирають в стерильну пробірку і доставляють в лабораторію, запобігаючи охолодження (використовувати термоконтейнер).

4.2.8. Операційний (пунктати з запальних органів і середовищ) і секційний матеріал (шматочки органів, мезентеріальні вузли, кров, жовч тощо) для дослідження відбирають у разі потреби при оперативних втручаннях або на місці розтину. Маса проби повинна бути не менше 20 г.

4.3. Відбір та доставка проб харчових продуктів і інших об'єктів середовища життєдіяльності людини

4.3.1. Об'єктами дослідження можуть бути проби харчових продуктів та сировини, відібрані в порядку здійснення державного санітарно-епідеміологічного нагляду, залишки їжі, що вживалася хворими, а також продукти і напівфабрикати, які використовували при її приготуванні; добові проби готової їжі, корми тваринного і рослинного походження, змиви з устаткування і інших предметів, підозрюваних як чинник передачі збудника, вода (питна, відкритих водоймищ, стічна), повітря, грунт тощо.

4.3.2. Проби харчових продуктів для дослідження відбирають відповідно до вимог нормативної документації на конкретні групи та види продуктів.

4.3.3. Залишки консервів направляють в лабораторію безпосередньо в тій банці, з якої їх використовували в їжу. За відсутності залишків консервів дослідженню підлягає вміст 2 - 5 нерозкритих банок з аналогічним маркуванням.

4.3.4. Дрібну рибу відбирають в кількості 2 - 3 штук, у великої вирізують 3 - 4 шматки із спинки, ближче до голови, і з ділянок біля анального отвору загальною масою не менше 200 г.

4.3.5. Солонину і солоні продукти, що знаходяться в бочковій тарі, беруть зверху, з середини і з дна бочки. Загальна маса проби має бути не менше 200 г. У окремий посуд набирають 100 - 200 см -3 розсолу.

4.3.6. Проби рідких і напіврідких продуктів і кормів (супи, соуси, замінник цілісного молока (далі - ЗЦМ) відбирають після ретельного перемішування в кількості близько 200 г.

4.3.7. Молочні продукти заводського приготування доставляють в лабораторію в оригінальній упаковці, інші - в об'ємі до 200 см -3.

4.3.8. Добові проби направляють для дослідження безпосередньо в тому посуді, в якому вони зберігалися в холодильнику. Залишки фактично спожитої їжі відбирають в тому посуді, в якому їх виявили.

Допускається доставка цих проб в стерильних контейнерах, куди їх перекладають з дотриманням асептики.

4.3.9. Яйця відбирають по 5 шт. з шести різних місць обстежуваної партії; в першу чергу беруть яйця, що зберігалися більше 7 днів.

4.3.10. Для дослідження сухих ЗЦМ відбирають з п'яти мішків однієї партії по 80 - 100 г продукту, який ретельно перемішують і поміщають в стерильну банку. Всього відбирають 4 - 5 збірних проб ЗЦМ.

4.3.11. Відбір змивів проводять з урахуванням вимог ДСТУ ISO 18593:2006 "Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Мікробіологічний аналіз із використанням відбитків і змивів з поверхонь".

Відбір здійснюють стерильними ватяними або ватяно-марлевими тампонами з площі не менше 100 см -2, в деяких випадках до 1000 см -2, в пробірки з 2 см -3 попереднього середовища збагачення - забуференої пептонної води pH 7,0. Безпосередньо перед узяттям змиву тампон зволожують, нахиляючи пробірку, надлишок вологи віджимають об стінку пробірки.

При відборі змивів з яєчної шкаралупи один тампон використовують для відбору змиву з 10 яєць.

4.3.12. Проби питної води відбирають відповідно до вимог методичних вказівок "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води" , затверджених наказом МОЗ України від 03.02.2005 № 60.

4.3.13. Проби води відкритих водоймищ або стічних вод відбирають відповідно до "Методических указаний по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов", затв. МОЗ СРСР 19.02.81 № 2285-81.

4.3.14. Дослідження ґрунту проводять за епідпоказами. Наважку 50 г поміщають в середовище неселективного збагачення в співвідношенні 1:10 і подальше дослідження виконують аналогічно харчовим продуктам.

4.3.15. Визначення наявності сальмонел в повітрі проводять за епідпоказами. Проби відбирають аспіраційним методом за допомогою апаратів і пристроїв, дозволених до застосування в установленому порядку. Кількість пропущеного повітря повинна складати 250 дм -3 на одну чашку з диференційно-діагностичним середовищем, наприклад: використовують 2 чашки з агаром Ендо і дві чашки з вісмут-сульфітним агаром. Таким чином, об'єм пропущеного через апарат повітря складає 1000 дм -3.

Дослідження на сальмонели складається з наступних етапів.

Підготовка матеріалу до дослідження.

Первинний посів (середовища збагачення, диференційно-діагностичні середовища).

Відбір підозрілих колоній, отримання чистих культур.

Ідентифікація виділених культур за біохімічними та серологічними властивостями. Визначення біохімічних та серологічних варіантів.

Визначення чутливості до антибіотиків, дезінфекційних засобів (при необхідності).

Слід зазначити, що при дослідженні різних матеріалів відрізняються тільки початкові етапи аналізу (правила забору матеріалу, його обробка, вибір адекватних поживних середовищ). Починаючи з відбору колоній на диференційно-діагностичних середовищах, подальші етапи бактеріологічного дослідження ідентичні.

5.1. Підготовка проб біологічного матеріалу до дослідження і первинний посів

5.1.1. Ефективність дослідження, направленого на виділення сальмонел з різних матеріалів, в першу чергу залежить від застосування відповідних середовищ збагачення і адекватних диференційно-діагностичних середовищ.

Перевагу слід віддавати поживним середовищам комерційного виготовлення. У тих випадках, коли рекомендовані середовища відсутні, їх готують в лабораторних умовах. Приготування та контроль поживних середовищ здійснюють з урахуванням вимог ДСТУ ISO/TS 11133-1:2005 "Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Настанови щодо готування та виробництва поживних середовищ. Частина 1. Загальні настанови щодо виготовлення поживних середовищ гарантованої якості в лабораторії" та ДСТУ ISO/TS 11133-2:2006 "Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Настанови щодо готування та вироблення поживних середовищ. Частина 2. Практичні настанови щодо випробування культуральних середовищ".

5.1.2. Рекомендовані середовища збагачення діляться на неселективні первинні (забуферена пептонна вода) і середовища селективного збагачення, наприклад: магнієве, селенітове, Мюллера-Кауфмана (тетратіонатне середовище), Раппапорта-Василіадіса, селеніт-цистинове. В деяких випадках доцільно використовувати слабо-селективне середовище - 10 - 20 % жовчний бульйон.

5.1.3. Диференційно-діагностичні середовища у свою чергу діляться на слабоселективні і високоселективні. Прикладами слабоселективних є - агар Ендо, агар Мак-Конки, бриліант-грюн агар, високоселективних - агар Плоскірева, SS-агар, ксилозолізин дезоксихолат агар, вісмут-сульфітний агар.

В сучасній мікробіологічній практиці широко використовуються. При цьому утворюються забарвлені і/або флюоресцюючі продукти. Внаслідок цього колонії мікроорганізмів забарвлюється в певний колір або набувають здібності до флюоресценції при ультрафіолетовому опромінюванні.

При застосуванні хромогенних середовищ виділення чистої культури і її орієнтовна ідентифікація можуть бути здійснені вже протягом першої доби дослідження.

Характер росту сальмонел на щільних середовищах первинного посіву наведений в таблиці 3.

5.1.4. Зразки біологічного матеріалу, що надійшли на дослідження до лабораторії, реєструють і готують для посіву в середовища збагачення і на чашки Петрі з диференційно-діагностичними середовищами.

Безпосередній висів матеріалу з середовища збагачення до інкубації в термостаті може замінити прямий посів на диференційно-діагностичні середовища.

5.1.5. Випорожнення, доставлені у фосфатно-буферному розчині, висівають в середовище збагачення подвійної концентрації в співвідношенні 1:1. Матеріал, доставлений в гліцериновому консерванті або транспортному середовищі, засівають в середовище збагачення в співвідношенні 1:10. Випорожнення, доставлені без консерванту, суспендують в середовищі збагачення в співвідношенні 1:5. З вказаних суспензій роблять висів на диференційно-діагностичні середовища, частину, що залишилася, інкубують в термостаті.

5.1.6. Кров, узяту з вени, висівають в подвійне середовище. У разі крайньої необхідності посіви проводять в 10 - 20 % жовчний бульйон. Після 16 - 20 годин інкубації роблять висів на одне з диференційно-діагностичних середовищ. При негативному результаті висів повторюють на 3, 5, 8 добу.

Оптимально використовувати комерційні системи для виділення гемокультур. При цьому слід користуватися інструкцією про застосування конкретної системи.

5.1.7. Кожну фракцію жовчі (дуоденального вмісту) висівають у флакони із слабо лужним поживним бульйоном в співвідношенні 1:10 і на диференційно-діагностичні середовища. Через 18 - 24 год. з флаконів здійснюють повторний висів на диференційно-діагностичні середовища. У разі отримання негативних результатів висів повторюють на 3, 5, 7 добу, використовуючи слабо-селективні середовища.

5.1.8. Блювотиння і промивні води шлунку. У випадку кислої реакції блювотиння (pH<4,5), його перед посівом нейтралізують 10 % розчином натрію бікарбонату (pH 7,0 - 7,4), промивні води центрифугують 15 хвилин при 3000 об/хвилину. Осад висівають в середовища збагачення. У випадку неможливості центрифугування роблять посів нативного матеріалу в середовище збагачення подвійної концентрації у співвідношенні 1:1 і після 18 - 24 год. інкубації роблять висів на диференційно-діагностичні середовища.

5.1.9. Сеча. Пробу сечі центрифугують 15 хвилин при 3000 об./хвилину. Осад висівають в середовища збагачення. У випадку неможливості центрифугування допускається посів нативного матеріалу в середовища збагачення подвійної концентрації в співвідношенні 1:1 і після 18 - 24 год. інкубації роблять висів на диференційно-діагностичні середовища.

5.1.10. Операційний і секційний матеріал розтирають у ступках і висівають в одне з середовищ збагачення (переважно магнієве або селенітове) у співвідношенні 1:5, одночасно роблять прямий посів на диференційно-діагностичні середовища.

5.1.11. За наявності іншого клінічного матеріалу його висівають на два-три диференційно-діагностичних середовища (комбінуючи високо- і низькоселективні) і, одночасно, в середовища збагачення.

5.1.12. Середовища в чашках Петрі підсушують. Для забезпечення росту ізольованих колоній на їх поверхні не повинна залишатися конденсаційна волога.

5.1.13. На щільні поживні середовища досліджуваний матеріал наносять за допомогою бактеріологічної петлі (матеріал від хворих), піпетки, скляної палички або тампона (проби продуктів і змиви) з подальшим втиранням матеріалу шпателем по всій поверхні середовища. На високоселективні середовища посівний матеріал наносять у великому об'ємі, у 3 - 5 разів більше, чим на слабоселективні.

5.1.14. Посіви інкубують в термостаті при (37±1) °C, за виключенням посівів на середовищах збагачення Раппапорта-Василіадіса, Мюллера-Кауфмана, які інкубують відповідно до інструкції про застосування при температурі 42 - 43 °C.

5.1.15. Після інкубації посівів на середовищах збагачення роблять повторний висів на диференційно-діагностичні середовища з подальшим відбором підозрілих колоній.

5.2. Підготовка проб з об'єктів середовища життєдіяльності людини до дослідження і первинний посів

5.2.1. При дослідженні проб продуктів і кормів роблять наважки масою 25 г.

5.2.2. Харчові продукти, бактеріологічне дослідження яких проводять відповідно до вимог "Мікробіологічних нормативів і методів аналізу продуктів дитячого, лікувального і дієтичного харчування і їх компонентів" (М., 1988), "Нормативів і методів мікробіологічного контролю продуктів дитячого харчування, виготовлених на молочних кухнях системи охорони здоров'я" (М., 1988), "Медико-біологічних вимог до якості продовольчої сировини і харчових продуктів" (М., 1989), беруть для дослідження в кількості, передбаченій у вказаних документах.

5.2.3. Дослідження проводять з урахуванням вимог ДСТУ ISO 6579 "Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Методика виявлення Salmonella spp. ", молоко та молочні продукти - ДСТУ IDF 93A:2003 "Молоко і молочні продукти. Визначання Salmonella".

5.2.4. Підготовлені проби харчових продуктів висівають в неселективне середовище збагачення в співвідношенні 1:10 і одночасно роблять посів матеріалу з вказаного середовища до його інкубації на диференційно-діагностичні середовища, використовуючи одну чашку з низькоселективним середовищем і одну з високоселективним.

5.2.5. Після інкубації посівів на неселективному середовищі збагачення матеріал пересівають в два середовища селективного збагачення. При цьому має дотримуватися наступне співвідношення посівної дози і об'єму середовища збагачення. Для всіх вказаних середовищ збагачення воно складає 1 см -3 надосадової рідини на 10 см -3 середовища і інкубації 18 - 20 годин при (37±1) °C. Для середовища Мюллера-Кауфмана 1 см -3 надосадової рідини на 10 см -3 середовища, для середовища Раппапорта-Василіадіса - 0,1 см -3 з неселективного середовища збагачення (забуференной пептонної води) в 10 см -3 вказаного середовища, інкубація 18 - 24 год. при (42±1) °C.

5.2.6. Після інкубації на середовищах селективного збагачення проводять висів на чашки Петрі з вісмут-сульфітним агаром та обов'язково на середовище Ендо.

5.2.7. Проби кормів висівають в попереднє середовище збагачення в співвідношенні 1:5 - 1:10 залежно від здібності до набухання і інкубують 5 год. в термостаті, після чого збовтують, відстоюють. Надосадову рідину пересівають в співвідношенні 1:5 в друге середовище збагачення і поміщають в термостат. Набряклі корми рослинного походження заливають другим середовищем збагачення так, щоб вона покрила поверхню проби.

5.2.8. Продукти щільної консистенції гомогенізують з невеликою кількістю попереднього середовища збагачення, яке потім додають в кількості, що забезпечує співвідношення 1:10.

5.2.9. Крем, вершкове масло і т. п. перед посівом розплавляють у водяній бані за температури (45±1) °C, струшуючи під час розплавлення, і негайно виймають із водяної бані після повного розплавлення.

5.2.10. Морозиво готують аналогічно, але використовують водяну баню з температурою не вище 37 °C.

5.2.11. Рідкі об'єкти, що мають кислу реакцію pH<4,5, перед посівом нейтралізують 10 % стерильним розчином бікарбонату натрію до слаболужної реакції (pH 7,0 - 7,4).

5.2.12. При дослідженні яєць шкаралупу обробляють спиртом і обпалюють, після чого яйця розбивають і відокремлюють жовток в стерильний посуд, об'єднуючи п'ять жовтків однієї проби. Жовтки гомогенізують і використовують для посіву.

5.2.13. Проби м'яса тварин і птахів, яєчного порошку, меланжу і консерви в закритих банках досліджують відповідно до діючих ГОСТ та ДСТУ.

5.2.14. Посіви змивів в попередньому середовищі збагачення після інкубації в термостаті пересівають в друге середовище збагачення: в пробірку з посівом змиву додають 10 см -3 другого середовища збагачення і поміщають в термостат на 18 - 20 год. Після інкубації роблять висів з другого середовища збагачення на диференційно-діагностичні з подальшим відбором підозрілих колоній і їх ідентифікацією.

5.2.15. При дослідженні води питної, поверхневих водних об'єктів і стічних вод беруть 2 проби по 500 см -3 кожна і вносять до рівного об'єму селективного середовища збагачення подвійної концентрації. При використанні методу мембранної фільтрації одержані фільтри поміщають в 50 см -3 кожного з двох середовищ накопичення, наприклад магнієвого і селенітового, або середовища Раппапорта-Василіадіса і селенітового. Після інкубації роблять висів на диференційно-діагностичні середовища.

5.2.16. Посіви на диференційно-діагностичних середовищах інкубують в термостаті при температурі (37±1) °C 18 - 20 год., а чашки з вісмут-сульфітним агаром - 48 год. з попереднім переглядом через 24 години.

6.1. Визначення біохімічних властивостей

6.1.1. Переглядають посіви на щільних поживних середовищах неозброєним оком або за допомогою лупи в денному або штучному світлі, що проходить (посіви на чашках Петрі з вісмут-сульфитним агаром проглядають в світлі, що падає) і відзначають колонії, за морфологічними властивостями схожі на сальмонельозні.

6.1.2. Якщо на чашках первинного посіву підозрілі колонії відсутні, відповідь видають тільки після обліку результатів висівів із середовищ збагачення. Якщо і при висіві із середовищ збагачення підозрілих колоній не виявлено, може бути видана відповідь про негативний результат дослідження.

6.1.3. У випадку, якщо в результаті прямого посіву випорожнень не виросло жодної колонії, варто отримати матеріал для досліджень ще раз.

6.1.4. Розмір колоній на щільних поживних середовищах при посіві помірної густоти сягає 1 - 2 мм, але зустрічаються і карликові колонії.

6.1.5. Колоніям S.Paratyphi B, S.Abortusequi, S.Tyhisuis та деяких інших сальмонел, при зберіганні посівів протягом 1 - 2 діб при кімнатній температурі, властива здатність до валоутворення, яка виражається у тому, що зовнішні краї колонії злегка піднімаються, утворюючи слизуватий вал. Ця ознака використовується для диференціації S.Paratyphi B від її біохімічного варіанту S.Java, що не утворює вал при рості на агарі.

6.1.6. Пересівають 3 - 5 підозрілих колоній у пробірки із комбінованими середовищами - трицукровий агар Олькеницького (Кліглера). Посів роблять спочатку штрихами по скошеній частині, а потім уколом у середину стовпчика. Для прискорення дослідження, особливо при ускладненні епідемічної ситуації, підозрілі колонії, паралельно відсівають ще і на скошений м'ясо-пептонний агар для подальшої постановки реакції аглютинації. Результати цієї реакції орієнтовні і потребують підтвердження на етапі завершення біохімічної ідентифікації.

6.1.7. Пробірки з посівами інкубують у термостаті при температурі (37±1) °C до наступного дня.

6.1.8. Проводять попередню ідентифікацію культур, за характером росту на середовищі Олькеницького (Кліглера), по ферментації лактози, глюкози, сахарози, гідролізу сечовини, утворенню сірководню, а також за серологічними властивостями, які визначають у реакції аглютинації на склі з полівалентними сироватками.

6.1.9. Про ферментацію лактози (і сахарози) в середовищі Олькеницького і ферментацію лактози в середовищі Кліглера судять по появі жовтого забарвлення в скошеній частині агару, а про ферментацію глюкози - по такому ж забарвленню в стовпчику. Газоутворення встановлюють по наявності бульбашок газу і розриву агару, утворення сірководню - по почорнінню середовища. Якщо культура гідролізує сечовину, середовище Олькеницького набуває дифузного яскравого червоно-малинового забарвлення.

6.1.10. Якщо культури ферментують лактозу і глюкозу з утворенням газу і гідролізують сечовину, вони не належать до бактерій роду Salmonella.

6.1.11. Культури, що не ферментують лактозу і не гідролізують сечовину, але ферментують глюкозу (з утворенням чи без утворення газу), утворюють сірководень, піддають подальшому вивченню на належність до роду Salmonella.

6.1.12. Культури, що не ферментують лактозу, ферментують глюкозу без газоутворення, не утворюють сірководень і не гідролізують сечовину, підозрілі як паратифозні чи шигельозні. Їх випробовують у реакції аглютинації з полівалентними сальмонельозними та шигельозними сироватками і подальше вивчення роблять в залежності від результату аглютинації.

6.1.13. Культури, що не ферментують лактозу, ферментують глюкозу з утворенням газу, не утворюють сірководню і позитивні в реакції аглютинації з полівалентними сальмонельозними сироватками можуть належати до роду Salmonella.

6.1.14. У підозрілих культур вивчають морфологію, тинкторіальні властивості, ферментативні характеристики, що дозволяють визначити родову належність виділених бактерій. З цією метою використовують тести, що дозволяють визначити здібність до утворення індолу, росту на середовищах з цитратами, розкладання сечовини, саліцину, малонату натрію, наявність лізин-декарбоксилази, фенілаланіндезамінази, здібність до утворення ацетил-метил-карбінолу в реакції VP. Ставлять також пробу з MR і визначають рухливість.