1.1. Ця Інструкція, розроблена на виконання Закону України "Про племінну справу у тваринництві", визначає порядок проведення тестування за ДНК-маркерами у тваринництві, яке є невід'ємною частиною генетичної експертизи походження та аномалій племінних тварин.

1.2. Тестування за ДНК-маркерами - визначення генотипу тварини за окремими генами або локусами геному на основі аналізу ДНК.

Аналіз ДНК - визначення алельного стану локусу. Генотипи можуть визначатися за окремими генами, важливими в біологічному та господарському відношенні, за високополіморфними локусами ДНК та за будь-якими іншими локусами геному сільськогосподарських тварин.

1.3. Мета тестування - виявлення тварин із спадковими вадами розвитку та особливостями генотипу за окремими локусами.

1.4. Тестування за ДНК-маркерами проводять один раз за життя тварини.

1.5. Організацію та проведення відбору зразків біоматеріалу для тестування за ДНК-маркерами здійснюють ветеринарні спеціалісти господарств/власників тварин.

1.6. Тестування за ДНК-маркерами здійснюють на підприємствах (лабораторіях) генетичного контролю атестовані фахівці із спеціальною освітою, які пройшли спеціальну підготовку щодо проведення ДНК-тестування.

У цій Інструкції наведені нижче терміни вживаються в такому значенні:

алель - одна з альтернативних структурних форм стану гена;

біоптат - частка тканини (органа), отримана прижиттєво для дослідження;

генотип - сукупність генів організму;

ДНК - дезоксирибонуклеїнова кислота, речовина спадковості, молекула, яка кодує генетичну інформацію і здатна до самовідновлення;

ДНК-ампліфікація - множинне копіювання певної ділянки ДНК за допомогою ПЛР;

електрофореграма - результат розділення біополімерів в електричному полі;

електрофорез - фізичний метод розділення біополімерів в електричному полі;

ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція;

праймер - коротка послідовність нуклеотидів, яка використовується в ПЛР;

рестрикт - фрагмент ДНК, отриманий у результаті обробки ДНК рестриктазою;

рестриктаза - бактеріальний фермент, що розщеплює молекулу ДНК у специфічних ділянках (сайтах пізнавання);

скринінг - метод або комплекс методів, що дає змогу ідентифікувати окремий об'єкт шляхом перегляду великої кількості об'єктів;

супернатант - надосадова рідина;

BLAD - (Bovine Leucocyte Adhesion Deficiency) синдром дефіциту адгезійності лейкоцитів великої рогатої худоби;

RYR - (rianodine receptor gene, ріанодин-рецепторний ген). Виконує головну роль у контролі стресчутливості свиней.

3.1. Як біопробу для тестування за ДНК-маркерами використовують будь-який біологічний матеріал тварини: кров, сперму, біоптат тощо.

3.1.1. Відбір крові

Проводять в антикоагулянт або на марлевий тампон. За умови використання марлевого тампона його просякують відібраною кров'ю та висушують на повітрі. Для ДНК-аналізу достатньо 0,5 мл рідкої крові або кров'яної плями на марлевому тампоні розміром 5х5 мм.

Умови зберігання крові:

рідкої - 5-7 діб при температурі 4 град.С або декілька місяців при температурі -20 град.С;

висушеної - у герметично закритому сухому пакеті до 5 років за кімнатної температури або в холодильнику при температурі 4 град.С. Висушену кров можна пересилати поштою до підприємства (лабораторії) генетичного контролю.

3.1.2. Відбір та зберігання сперми

Відбирають 0,5-2 мл нативної сперми. Сперму для виділення ДНК зберігають за умов, аналогічних для зберігання рідкої крові.

3.1.3. Відбір біоптатів

Біоптати можуть мати різне походження. Для ДНК-аналізу можна використовувати вищипи з вуха, які залишаються при міченні тварин. Термін зберігання шматочків розміром від 5х5 мм при температурі 4 град.С - 3-4 доби, у замороженому стані (-20 град.С і нижче) - необмежений час.

3.1.4. Під час відбору кожну пробу маркують індивідуальним номером. Складають акт про відбір проб у довільній формі, у якому вказують повну назву господарства/власника, де зроблено відбір біоматеріалу, час відбору, його вид, записують номери тварин та відповідні номери проб.

3.2. Виділення ДНК проводять за декількома методиками в залежності від мети дослідження.

За умови, якщо метою дослідження є скринінговий експрес-аналіз певної групи тварин на наявність генетичних аномалій чи особливостей, ДНК виділяють експрес-методом у невеликій кількості, термін зберігання проби 1-2 доби.

З метою зберігання проби тривалий час і використання для ряду аналізів - ДНК виділяють відповідним методом, така ДНК-проба може зберігатися декілька років.

3.3. Методи виділення ДНК

3.3.1. Експрес-метод виділення ДНК з різних тканин за допомогою реагента "Chelex-100".

3.3.1.1. Виділення ДНК із крові:

до 2-500 мкл крові або гомогенізованих тромбів додають 1000 мкл стерильної дистильованої води та перемішують на мікрозмішувачі типу "Vortex";

суміш інкубують протягом 15-30 хв за кімнатної температури, періодично перемішують шляхом струшування;

центрифугують протягом 1 хв при 6000 об/хв;

обережно видаляють надосадову рідину, залишають 20-30 мкл рідини над осадом;

додають 170-180 мкл 5%-ного стерильного водяного розчину "Chelex-100";

інкубують протягом 15-30 хв. при температурі 56 град.С;

ретельно перемішують шляхом струшування та витримують 8 хв. на водяній бані при температурі 100 град.С;

ретельно перемішують шляхом струшування;

центрифугують протягом 5 хв. при 6000 об/хв.

Для ампліфікації використовують 5 мкл надосадової рідини, яка містить ДНК. Зберігають зразки при температурі -20 град.С. Після кожного розморожування зразки перемішують та центрифугують протягом 5 хв. при 6000 об./хв.

3.3.1.2. Виділення ДНК із сперми:

до 3 мкл нативної сперми додають 200 мкл 5% стерильного водного розчину "Chelex-100"

до суміші додають 2 мкл протеїнази К концентрацією 10 мг/мл та 7 мкл 1 М дітіотрейтолу;

обережно перемішують шляхом струшування та інкубують зразки 30-60 хв. при температурі 56 град.С;

перемішують уміст пробірок на мікрозмішувачі 5-10 секунд та інкубують 8 хв. при температурі 100 град.C.;

перемішують на мікрозмішувачі 5-10 секунд та центрифугують 2-5 хв. при 8000-10000 об./хв.

Зразки зберігають при температурі -20 град.С. Для ампліфікації використовують 5 мкл надосадової рідини, яка містить ДНК.

Концентрацію та ступінь очищення ДНК визначають спектрофотометрично (спектрофотометр СФ-46) при довжині хвилі 260 та 280 нанометрів. Нативність ДНК визначають шляхом електрофорезу в 1% агарозному гелі за умови відсутності "шлейфу" фрагментів ДНК та інтенсивності флуоресценції бромистого етидію при ультрафіолетовому опромінюванні електрофореграм.

3.3.2. Метод виділення ДНК за Соколовим-Джемелинським (для проведення ряду аналізів і тривалого зберігання препаратів ДНК):

5 мл крові, що містить антикоагулянт змішують з 30 мл холодного (4 град.С) буферу для лізису клітин (0,32 М сахарози, 5 мМ MgCl2, 1% Тритон Х-100, 0,01М трис-HCl (рН 7,6)) і витримують при температурі 4 град.С протягом 30 хв.;

ядра клітин осаджують шляхом центрифугування при 4000 об/хв. Термін осаджування 30 хв. при температурі 4 град.С;

осад ресуспендують у розчині, що містить 1,5 мл солі ЕДТА (75 мМ NaCl, 25 mM ЕДТА (рН 8,0)), 200 мкл 10% SDS, 25 мкл (10 мг/мл) протеїнази К, та інкубують протягом 16 годин при температурі 37 град.С;

до одержаного лізату додають 0,75 мл 5М ацетату калію (рН 4,8), обережно перемішують, витримують 30 хв при температурі 4 град.С та центрифугують (40 хв., 5000 об./хв., 4 град.С);

до супернатанту додають два об'єми холодного (4 град.С) 96% етанолу та вимотують ДНК на скляну паличку;

підсушують за кімнатної температури, ДНК двічі промивають 70% етанолом та розчиняють у 0,5 мл буферу ТЕ (10 мМ Тріс-HCl (pH 7,4)), 1 мМ ЕДТА (рН 8,0) або 0,5 мл деіонізованої води.

Проби ДНК зберігають при температурі -20 град.С.

3.4. ДНК-ампліфікація локусів геному, вибраних для аналізу

Для ДНК-ампліфікації використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Суть методу - багатократний направлений синтез ДНК із дезоксирибонуклеотидтрифосфатів, in vitro, за допомогою термостабільної ДНК-полімерази. Специфічність синтезу (ампліфікації) вибраної ділянки ДНК визначається синтетичними праймерами-затравками.

3.4.1. Обладнання для проведення ПЛР:

ампліфікатор (інша назва приладу - термоциклер або термостат, що програмується для проведення ампліфікації);

автоматичні мікропіпетки (0,5 - 200 мкл) для відбору зразків;

центрифуга для пробірок типу "Eppendorf" (частота обертання ротора до 14000 об./хв.);

прилади для вертикального (у поліакриламідному гелі) та горизонтального ( в агарозному гелі) електрофорезу;

трансілюмінатор;

система для фото- або цифрової документації результатів.

3.4.2. Реактиви для проведення ПЛР:

термостабільна ДНК-полімераза;

специфічні праймери-затравки;

реакційна суміш для проведення ПЛР (уміщує реакційний буфер для проведення ПЛР з MgCl2 або без нього, оптимізований для конкретної термостабільної ДНК-полімерази, та суміш чотирьох дезоксинуклеотид-трифосфатів);

високоочищена (деіонізована) вода.

Реактиви поставляються у готовому вигляді фірмами-виробниками.

3.4.3. Проведення реакції

В ампліфікаційну пробірку (0,5 мл) уносять компоненти реакції: реакційну суміш, праймери-затравки для синтезу вибраної ділянки ДНК, термостабільну ДНК-полімеразу, зразок ДНК тварини і воду, доводячи до кінцевого об'єму 25 мкл.

Конкретна кількість реактивів (мкл) залежить від концентрації, у якій вони поставляються фірмами-виробниками. Реакційна суміш завжди вміщує 1-кратний реакційний буфер, а кількість у ній іонів Mg ++ може коливатися в діапазоні від 1,5 до 3 мМ. Кількість полімерази, що вноситься, залежить від її активності. Уносять 1-2 одиниці активності фермента (0,1-0,5 мкл). Загальну кількість реактивів розраховують у відповідності до числа зразків, які ампліфікують. Збирають в окрему пробірку всі компоненти реакції, крім зразка ДНК, після ретельного перемішування розносять в окремі пробірки. Пробірки заздалегідь маркують відповідно до зразків ДНК. Для запобігання випаровуванню на реакційну суміш до кожної пробірки наносять шляхом нашаровуванню мінеральне масло.

Для ДНК-діагностики стрес-синдрому у свиней як один з можливих варіантів використовують праймери:

RYR 1: 5' - GTGCCTGATGTCCTGTGTTCCCT - 3';

RYR 2: 5' - CTGGTGACATAGTTGATGAGGTTTG - 3'.

У результаті ПЛР синтезується фрагмент ДНК розміром 134 пари нуклеотидів (п.н.).

Для ДНК-аналізу синдрому дефіциту адгезійності лейкоцитів великої рогатої худоби (BLAD) використовують праймери:

F - 5' - TGAGACCAGGTCAGGCATTGCGTTCA - 3';

R - 5' - CCCCCAGCTTCTTGACGTTGACGAGGTC - 3'.

У результаті ПЛР синтезується фрагмент ДНК розміром 132 п.н.

В ампліфікаційній суміші під час ДНК-тестування великої рогатої худоби за геном гормону росту використовують праймери:

F - 5' - CCGTGTCTATGAGAAGC - 3';

R - 5' - GTTCTTGAGCAGCGCGT - 3'.

У результаті ПЛР синтезується фрагмент ДНК розміром 428 п.н.

Для свиней використовують праймери:

BG3M - 5' - ACCGGCTGTGATGGCTGCAGGCAA - 3';

BG4 - 5' - AGGTACTCCATCCAGAACGCCCAG - 3'.

У результаті ПЛР синтезується фрагмент ДНК розміром 659 п.н.

Під час ДНК-тестування за геном капа-казеїну використовують праймери:

Bocas A: 5' - ATGTGCTGAGCAGGTATCCTAGTTATGG - 3';

Bocas B: 5' - CCAAAAGTAGAGTGCAACAACACTGG - 3'.

У результаті ПЛР синтезується фрагмент ДНК розміром 883 п.н.

Для ампліфікації фрагмента гена рецептора естрогена використовують праймери: