1.1. Ця Інструкція, розроблена на виконання Закону України "Про племінну справу у тваринництві", визначає порядок проведення цитогенетичних досліджень у тваринництві, які є невід'ємною частиною генетичної експертизи походження та аномалій племінних тварин.

1.2. Цитогенетичний контроль - контроль стану хромосомного апарату тварини, його цілісності, наявності структурних та кількісних порушень каріотипу.

1.3. Мета цитогенетичного контролю - установлення відсутності або наявності хромосомних, хроматидних, геномних кількісних та якісних змін і порушень.

1.4. Цитогенетичний контроль проводять за необхідності.

1.5. Організацію та проведення відбору зразків крові для цитогенетичного контролю здійснюють ветеринарні спеціалісти господарств/власників тварин.

1.6. Цитогенетичний контроль здійснюють на підприємствах (лабораторіях) генетичного контролю атестовані фахівці із спеціальною освітою, які пройшли спеціальну підготовку щодо проведення цитогенетичних досліджень.

У цій Інструкції наведені нижче терміни вживаються в такому значенні:

аберація - зміна в каріотипі;

аутосоми - усі хромосоми каріотипу, крім статевих;

геномні мутації - структурні й кількісні порушення хромосомного апарату тварин;

генотип - сукупність генів організму;

каріотип - хромосомний набір соматичних клітин організму, характерний для даного виду;

каріотипування - ідентифікація кожної окремої хромосоми диплоїдного набору хромосом тварини;

клітина - основна структурна одиниця організму, що забезпечує його відтворення, розвиток та життєдіяльність;

метафазні платівки - сукупність хромосом, розташованих у вигляді платівки в екваторіальній площині клітини під час метафази мітозу або мейозу;

мітоз - поділ соматичних клітин, за якого зберігається диплоїдний набір хромосом, основний спосіб поділу еукаріотичних клітин;

мозаїцизм - присутність в організмі клітин (точніше клонів) різного генотипу;

поділ - форма розмноження організмів та клітин, при якій відбувається поділ ядер та цитоплазми з подальшим утворенням нових дочірніх клітин;

поживні середовища - рідкі чи тверді середовища, на яких у лабораторних або промислових умовах вирощують бактерії, гриби, віруси, найпростіших, культури клітин та тканин;

хромосоми - органоїди клітинного ядра, носії генів, що визначають спадкові властивості клітин та організмів;

хромосомний набір - сукупність хромосом, властивих клітинам даного організму;

цитогенетика - наука про закономірності спадковості та мінливості на рівні клітин та субклітинних структур (хромосом).

3.1. Для проведення цитогенетичних досліджень необхідна наявність лабораторії, що складається з двох кімнат (16-20 кв.м) з мийною, боксом і центрифужною, та необхідного оснащення.

Устаткування:

холодильник побутовий;

сушильна шафа;

термостат, що забезпечує температуру 37-38 град.С;

стерильний бокс (камера чи стіл з подачею стерильного повітря);

центрифуга, що забезпечує швидкість 1000 об/хв;

дистилятор;

витяжна шафа;

мікроскопи біологічні, які забезпечують високу якість зображення під збільшенням від 100 до 1000 разів;

автоклав;

стерилізатор для інструментів;

голки для взяття крові;

пальник спиртовий;

шприци на 1-20 мл;

звичайні та центрифужні пробірки;

мірні та пастерівські піпетки;

колби;

мірні циліндри;

флакони пеніцилінові;

предметні і покривні скельця;

обладнання для цифрового або аналогового фотографування.

Реактиви (для проведення цитогенетичного контролю 500 тварин):

фітогемаглютинін (типу Р - 5 мг, типу М - 50 мг) або конканавалін А - 50 мг;

колхіцин - 1 мг;

середовище 199 (Ерла, Ігла) або RPMI 1640 - 2,5 л;

сироватка крові людини IV групи АВ чи сироватка крові великої рогатої худоби - 0,5 л;

барвник Гімза - 1 г;

метиловий або етиловий спирт - 20 л;

крижана оцтова кислота - 7 л;

імерсійна олія - 50 г;

пеніцилін - 200 тис. од. зі стрептоміцином - 200 г або гентаміцин - 2,5 мл.

3.2. Матеріалом для одержання хромосомних препаратів слугує у:

великої рогатої худоби, овець, кіз та коней - кров, що відбирається з яремної вени тварини;

свиней - кров з вушної вени.

Кров відбирають при дотриманні умов стерильності традиційним шляхом або через спеціальну систему одноразового використання для взяття крові (ВК - 10-01) у спеціальний посуд (пробірку, флакон тощо), оброблений 0,2-0,3 мл розчину гепарину (0,2 мл аптечного гепарину та 8 мл дистильованої води).

Відбір проб крові проводять у такій послідовності:

пункція яремної вени;

зрошення, обмивання кров'ю протягом 2-3 секунд внутрішньої поверхні голки;

пробивання коротким кінцем голки гумової пробки спеціального посуду (пробірки, флакона тощо).

Після відбору кров відстоюють у щільно закритому посуді в холодильнику при температурі 4 град.С протягом 2 годин.

3.3. Кров доставляють на підприємство (лабораторію) генетичного контролю протягом доби після відбору з формою N 1-ГЕН "Відомість зразків крові N___", зазначеною в Положенні про порядок проведення генетичної експертизи походження та аномалій племінних тварин.

Доставку здійснюють у термосі, іншому посуді або пристосуванні, яке здатне підтримувати тривалий час температуру 4 град.С. Транспортують, не допускаючи струшування крові.

Умови та терміни транспортування крові в лабораторію впливають на одержання метафазних платівок високої якості. Протягом 3 годин кров можна транспортувати за звичайних умов. При тривалішому транспортуванні проби крові перевозять у термосі з льодом або в портативному холодильнику. Час транспортування за таких умов може бути збільшено до 24-30 годин. У процесі транспортування можливе культивування клітин. У цьому разі кров за описаним методом уносять у флакони з поживним середовищем і поміщають у термос (компоратор), здатний підтримувати температуру до 38 град.С.

3.4. Отримання цитогенетичних препаратів

Для взяття крові у тварин і культивування клітин використовують медичні флакони ємністю 30 мл з пластмасовими кришками, що загвинчуються, пеніцилінові флакони, стерильні бакпечатки.

3.4.1. Підготовка флаконів проводиться у послідовності:

флакони миють гарячою водою, використовуючи пральний порошок, тринатрій фосфат чи суміш трилону Б (чда) - 1 частину, гідроксид натрію - 2 частини та дистильовану воду - 10 л;

ретельно ополіскують спочатку проточною гарячою водою, потім дистильованою водою та залишають замоченими у дистильованій воді на ніч;

висушують у сушильній шафі (температура 110 град.С);

кип'ятять протягом 2 годин;

висушують;

закривають ватно-марлевими пробками;

обертають пергаментом;

витримують при температурі 110 град.С близько 2 годин;

готові флакони закривають чистими, стерильними пеніциліновими пробками, зверху - пластмасовими кришками з невеликим отвором, через який вводять за допомогою голки і шприца необхідні компоненти.

3.4.2. Постановку та культивування культури клітин проводять у стерильному боксі. За умови відсутності боксу ці операції проводяться у звичайній чистій кімнаті, яку опромінюють бактерицидними настінними лампами ОБН-150 протягом 2 годин перед початком роботи.

3.4.3. Постановка культури лімфоцитів периферійної крові

У флакони вводять 0,5 мл крові та поживне середовище такого складу:

5 мл середовища 199 (Ерла, Ігла) або RPMI 1640;

1 мл інактивованої сироватки крові великої рогатої худоби або людини IV групи (сироватку інактивують у водяній бані при 56 град.С протягом 1 години);

0,01 мл ФГА "Р" або 0,1 мл ФГА "М" чи конканаваліну А;

антибіотики в концентрації 100 од. пеніциліну та 100 мкг стрептоміцину або 0,001мл гентаміцину на 1 мл середовища.

Суспензію перемішують, ставлять у термостат при температурі 37 град.С на 48 годин.

За дві години до зняття культури в кожен флакон уводять колхіцин у кінцевій концентрації 0,05 мкг/мл. Маточний розчин колхіцину готують на дистильованій воді (10 мг сухого колхіцину на 100 мл води) та зберігають при температурі 4 град.С 1-2 місяці. Для одержання препаратів, збагачених клітинами на стадіях ранньої мета- та прометафази, за 2 години до фіксації (можна одночасно з колхіцином) додають розчин етидіум броміду в кінцевій концентрації 5-10 мкг/мл. Починаючи з цього етапу, допускається проведення робіт у нестерильних умовах.

3.4.4. Зняття культури лімфоцитів периферійної крові і отримання препаратів метафазних хромосом

По завершенні культивування:

уміст флаконів зливають у центрифужні пробірки та центрифугують протягом 10-20 хв при 1000 об/хв (режим центрифугування при всіх наступних обробках такий самий);

надосадову рідину відсмоктують або обережно зливають;

осад струшують, у пробірку додають підігрітий до температури 37 град.С гіпотонічний розчин (0,5%) KCl;

клітинну суспензію ретельно перемішують, використуючи пастерівську піпетку з гумовою грушею;

інкубують 10 хв при температурі 37 град.С;

центрифугують;

видаляють надосадову рідину;

клітинну суспензію фіксують у свіжоприготовленому та охолодженому фіксаторі (метиловий спирт, крижана оцтова кислота у співвідношенні 3:1);

зафіксовану суспензію клітин залишають у холодильнику при температурі 4 град.С на термін від 20 хвилин до 20 годин;

клітинну суспензію проводять ще через 2-3 зміни фіксатора;

отриману клітинну суспензію розчиняють невеликою кількістю свіжого фіксатора до бажаної густини;

наносять 3-4 краплі клітинної суспензії на знежирене предметне скло, препарат підпалюють чи висушують гарячим струменем повітря.

Якість отриманого препарату оцінюють під мікроскопом. Розкиданість хромосом контролюють у затемненому полі мікроскопа. Якщо розкиданість хромосом недостатня, суспензію проводять ще через одну зміну фіксатора, змінивши співвідношення компонентів на 2:1 чи додають у пробірку кілька крапель оцтової кислоти.

3.5. Рутинне забарвлення препаратів хромосом проводять за допомогою барвників азуру та еозину. Обидва барвники готуються на дистильованій воді у вигляді 0,15% розчину і зберігаються у суліях з темного скла. Розчини готують заздалегідь, тому що "дозрілі" розчини ефективніші.

Безпосередньо перед забарвленням готують робочий розчин: змішують 6 частин 0,15% ("дозрілого") розчину еозину і 9 частин дистильованої води. Для фарбування можна використовувати готовий барвник Гімза та готовий азур-еозин, приготовлений за методом Романовського. На 0,5-1 мл вихідного барвника беруть 10 мл дистильованої води.

Фарбування препаратів хромосом проводять у такій послідовності: готовий барвник наносять на предметне скло або предметне скло поміщають у склянку з барвником і витримують протягом декількох хвилин. Інтенсивність забарвлення визначають під мікроскопом.

3.6. При візуальному аналізі клітин під мікроскопом виявляють великі хромосомні порушення - центричні злиття аутосом, тандемні злиття, химеризм клітин за статевими хромосомами.

Для встановлення наявності центричного злиття досить позитивного висновку за 5-10 метафазними платівками. Для встановлення наявності химеризму клітин за статевими хромосомами необхідно знайти 2 Х-хромосоми у 10 метафазних платівках.

Для визначення номерів хромосом, що беруть участь у центричному злитті, проводять морфометричний аналіз на фотографічних відбитках. Вибирають метафазні пластинки з оптимальною спіралізацією хромосом і без накладень. Зображення хромосом вирізають і розклеюють попарно. На кількох метафазних пластинках вимірюють довжину кожної хромосоми та визначають її відносну довжину до сумарної довжини всього гаплоїдного жіночого (Х-хромосома) набору хромосом.

При діагностиці лейкозу наявність у цитологічних препаратах короткочасних гемокультур мітозів, відсутніх у здорової великої рогатої худоби, є першою ознакою можливого захворювання тварин на лейкоз.

Аналіз клітин під мікроскопом починають проводити під малим збільшенням мікроскопа в 100 разів, за координатами препаратоводія визначають розташування метафаз. Потім їх аналізують під імерсійним збільшенням мікроскопа у 1000 разів і мікрофотографують.

Пофарбовані препарати починають аналізувати під збільшенням мікроскопа в 100-200 разів, при цьому проводять їх загальну оцінку (мітотичний індекс та якість метафазних платівок). Метафази краще знаходити та вибирати при невеликому збільшенні. При доборі метафазних платівок для перегляду їх виключають через непридатність для аналізу за умов: