Відповідно до статті 7 Закону України "Про ветеринарну медицину", Положення про Державний департамент ветеринарної медицини, затвердженого постановою Кабінету Міністрів України від 8 червня 2001 року N 641, та з метою забезпечення епізоотичного благополуччя у птахогосподарствах України

1. Затвердити Інструкцію із серологічного контролю рівня антитіл до вірусу ньюкаслської хвороби птиці в реакції затримки гемаглютинації (РЗГА) (додається).

2. Директору Державного центру ветеринарної медицини птахівництва Демиденку В.М. подати даний наказ на державну реєстрацію до Міністерства юстиції України та в 10-денний термін забезпечити його тиражування і надсилання установам ветеринарної медицини Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя.

3. Головним державним інспекторам ветеринарної медицини Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя довести цю Інструкцію до відома установ системи ветеринарної медицини України та забезпечити контроль за її виконанням.

4. У зв'язку з прийняттям даного наказу вважати такими, що не застосовуються на території України, "Методические указания по серологическому контролю напряженности иммунитета при Ньюкаслской болезни птиц с помощью реакции задержки гемагглютинации", затверджені ГУВ МСГ СРСР N 115-6а від 18.05.79.

5. Контроль за виконанням даного наказу покласти на заступника Голови Державного департаменту ветеринарної медицини Вержиховського О.М.

1.1. Інструкція призначена для серологічного контролю напруженості імунітету птиці до ньюкаслської хвороби (далі - НХ), оцінки ефективності специфічної профілактики, визначення оптимальних строків вакцинації (ревакцинації) птиці, а також для контролю епізоотичної ситуації з НХ у птахогосподарствах.

1.2. Контроль напруженості імунітету проти НХ проводять лабораторії ветеринарної медицини птахогосподарств, державної ветеринарної медицини, спеціалізовані лабораторії ветеринарної медицини з хвороб птиці та акредитовані лабораторії ветеринарної медицини.

1.3. Контроль ґрунтується на виявленні специфічних антитіл (антигемаглютинінів) у сироватці крові птиці за допомогою реакції затримки гемаглютинації (РЗГА).

1.4. Серологічний контроль поголів'я птиці здійснюють через кожні 15-20 днів після застосування вакцини проти НХ або виходячи з епізоотичної ситуації в конкретному господарстві.

1.5. Дослідженню підлягають 25 проб сироваток крові від птиці, однієї партії, в об'ємі не менше 0,5 куб.см, узятих з різних місць пташника (залу) по діагоналі приміщення.

1.6. Результат серологічного контролю реєструють в спеціальному журналі.

1.7. Зберігання та транспортування досліджуваних проб крові від птиці та проб сироваток крові проводять згідно з розділом 1 "Методы отбора проб" (п.1.2, 1.3, 1.4, 1.5) ГОСТу - 25587-83 "Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики болезни Ньюкасла".

2.1. Обладнання та реактиви:

антиген сухої вірус-вакцини проти НХ із штамів "Ла-Сота", екстраембріональна алантоїсна рідина від курячих ембріонів, інфікованих вакцинними штамами вірусу хв. Ньюкасла, з гемаглютинувальним титром не менше 1:8;

досліджувані сироватки крові птиці;

1%-на суспензія еритроцитів півнів-донорів на фосфатно-буферному розчині (далі - ФБР), рН 7,0, 7,2, 7,4;

контрольні (еталонні) позитивні та негативні сироватки;

пластини полістиролові титраційні з лунками, позначеними літерою "V";

центрифуга лабораторна на 2000 об/хв;

наконечники одноразові;

піпетки градуйовані на 1,0; 2,0; 5,0 і 10,0 мл або дозатори автоматичні на 50-200 мкл, 1000 мкл;

розчин фізіологічний 0,87%-ний з рН 7,0-7,2;

вода дистильована ГОСТ 6709-72;

колби конічні скляні на 50 куб.см, 250 куб.см, 1000 куб.см з лабораторними пробками згідно з ГОСТ 1770-74;

штативи лабораторні бактеріологічні для пробірок;

пробірки лабораторні скляні на 5 куб.см, 10 куб.см, 15 куб.см, 20 куб.см згідно з ГОСТ 25336-82;

шафа сушильна;

ваги лабораторні з похибкою зважування не більше 0,01 г;

кювети лабораторні ниркоподібні (зливні);

натрію хлорид ГОСТ 4233-77;

пробірки для центрифуги;

камера холодильна;

розчин для дезінфекції: 3%-ний розчин їдкого натру згідно з ГОСТ 4328-77 або інші дезінфекційні розчини;

ємність зливна для відпрацьованого матеріалу;

5%-ний розчин лимоннокислого натрію на фізіологічному розчині або розчин Альсивера (24,6 г глюкози, 9,6 г лимоннокислого натрію, дистильованої води 1200 мл);

термостат на 37 град. С.

2.2. Підготовка антигену

Уміст ампули (флакона) сухої вірус-вакцини з штаму "Ла-Сота" (активністю не менше 8,5 lg EID 50 куб.см) розчиняють фізіологічним розчином у співвідношенні 1:5.

2.3. Приготування 1%-ної суспензії еритроцитів півнів-донорів

Для одержання 1%-ної суспензії еритроцитів беруть кров тільки у не вакцинованих проти НХ півнів-донорів старше 6-місячного віку, еритроцити яких не дають спонтанної аглютинації і сироватки крові періодично перевіряються на відсутність антитіл до НХ.

2.3.1. Кров беруть не менше ніж у трьох півнів, з підкрильцевої вени в колбу з розчином Альсивера в рівних об'ємах або у флаконі з 5%-ним розчином лимоннокислого натрію на фізіологічному розчині (рН 7,0 - 7,2) у співвідношенні 1:3. Одержану кров тричі відмивають фізіологічним розчином (0,1 М) або ФБР (рН 7,0; 7,2), осаджуючи еритроцити, центрифугуючи протягом 2-5 хвилин при 800 об/хв. З осаду відмитих еритроцитів готують 1%-ну суспензію і зберігають не більше як 2 доби при t +4 град. С.

Промиті та ущільнені еритроцити зберігають у вигляді 50%-ної суспензії на фізіологічному розчині (рН 7,2) протягом 5 діб при температурі +4 град. С в холодильній камері у скляній колбі з ватно-марлевою пробкою.

2.4. Одержання досліджуваних сироваток.

Проби крові набирають в окремі пронумеровані пробірки, попередньо зволожені стерильним фізіологічним розчином. Утворений згусток обводять тонким металевим стержнем або скляною паличкою, потім пробірки вносять у термостат на 20-30 хвилин при 37 град. С. Далі проби крові витримують у холодильнику при +4 град. С до утворення сироватки. Відстояну сироватку зливають у чисті пронумеровані пробірки і досліджують в РЗГА.

Сироватки крові інших видів птиці можуть викликати аглютинацію еритроцитів півнів. Тому в разі виявлення такої особливості проводять додаткову обробку сироваток еритроцитами. Для цього 0,025 мл осаду еритроцитів додають до 0,5 мл сироватки, струшують та залишають на 30 хвилин. Еритроцити осаджуються центрифугуванням при 800 об/хв протягом 2-5 хвилин та оброблену сироватку зливають.

2.5. РЗГА ставлять у два етапи:

титрування антигену в реакції гемаглютинації (РГА) для обчислення робочої дози вірусу;

постановка основної реакції.

РЗГА супроводжується контролями:

сироватки на ізоаглютинацію (сироватка + ФБР в рівних об'ємах + 1%-на суспензія еритроцитів в подвійному об'ємі). Аглютинація повинна бути відсутня;

еритроцитів на спонтанну аглютинацію (суспензія еритроцитів + ФБР у рівних об'ємах). Аглютинація повинна бути відсутня.

2.6. Титрування антигену в РГА

2.6.1. Спочатку готують подвійні розведення антигену від 1:2 до 1:4096. Для цього в усі лунки полістиролових пластин наливають ФБР в об'ємі 0,25 мл. Потім у першу лунку вносять 0,25 мл вірусу, новою піпеткою три рази піпетують і переносять 0,25 мл суміші в другу лунку і т. ін. до потрібного розведення. З останньої лунки 0,25 мл суміші видаляють у дезрозчин. У кожну лунку новою піпеткою додають по 0,25 мл 1%-ної суспензії еритроцитів півнів.

Паралельно ставлять контроль еритроцитів на спонтанну аглютинацію, для чого в три лунки наливають по 0,25 мл ФБР і новою піпеткою додають по 0,25 мл 1%-ної суспензії еритроцитів. Полістиролові пластинки струшують обережними круговими рухами і залишають при кімнатній температурі (18-20 град. С) на 30-45 хвилин для осідання еритроцитів у контролі.

2.6.2. Результати РГА виражають хрестами, в залежності від ступеня інтенсивності реакції.

Реакція на три хрести (+ + +). По периметру лунки утворюється осад у вигляді "парасольки" з рожевими краями.

Реакція на два хрести (+ +). Пройшла менш інтенсивна аглютинація, при цьому аглютиновані еритроцити мають зубчатий вигляд.

Реакція на один хрест (+) має вигляд незначної аглютинації на дні лунки.

Негативна реакція (-) аналогічно контролю має вигляд ґудзика, який при нахилі пластини стікає.

2.6.3. За гемаглютинувальний титр вірусу або одну гемаглютинувальну одиницю 1 (ГАО) приймають найбільше розведення, де чітко виражена аглютинація еритроцитів у вигляді парасольки, але не менш як на 2 хрести.

Наприклад, чітко виражена гемаглютинація, одержана в розведенні 1:64, тобто 0,25 мл вірусу в розведенні 1:64, містить одну гемаглютинувальну одиницю (1 ГАО). Для постановки РЗГА потрібно брати 4 ГАО в 0,25 мл, що становить робочу дозу вірусу, яка використовується при постановці основної реакції.

Для визначення робочої дози граничний титр вірусу ділять на 4, тобто в наведеному прикладі 4 ГАО в 0,25 мл будуть міститися при розведенні вірусу 1:16 (64:4=16).

Для приготування робочого розведення вірусу, який містить 4 ГАО в 0,25 мл, потрібно взяти 1 мл вихідного вірусу і додати 15 мл ФБР. Підібрану робочу дозу вірусу необхідно використати протягом 8 годин.

2.6.4. Перед постановкою РЗГА необхідно перевірити правильність вибраної робочої дози вірусу (4 ГАО). Для цього в 4 лунки одного ряду і 3 лунки контрольного ряду наливають по 0,25 мл ФБР. У першу лунку з 4 наливають 0,25 мл робочої дози вірусу. Новою піпеткою суміш тричі піпетують, а потім переносять по 0,25 мл в наступну лунку і т. ін. Із останньої лунки 0,25 мл суміші видаляють у дезрозчин. Після цього у лунки з антигеном та лунки контрольного ряду додають 0,25 мл 1%-ного розчину еритроцитів півнів, струшують круговими рухами і залишають при кімнатній температурі (18-20 град. С) на 30-45 хвилин.