1. Ця Інструкція поширюється на лабораторні центри та заклади охорони здоров'я незалежно від форм власності (далі - заклади).

2. Основними завданнями лабораторних центрів є моніторинг циркуляції вірусів грипу, в тому числі з пандемічним потенціалом:

виявлення генетичних змін чи появи реасортантів вірусів;

визначення стійкості вірусів до противірусних препаратів;

забезпечення специфічності та чутливості діагностичних методів, що використовуються в лабораторній практиці;

отримання необхідної інформації для розробки вакцин.

1. Всі маніпуляції з відбору зразків від хворих, розкриття термоконтейнерів з пробами клінічного (секційного) матеріалу та дослідження медичний персонал проводить із використанням засобів індивідуального захисту:

респіратор № 95 (або одноразова маска);

халат та шапочка;

гумові рукавички;

захисні окуляри (захисний щиток).

2. Попередня підготовка проб та всі маніпуляції з клінічними зразками при дослідженні методом полімеразної ланцюгової реакції (далі - ПЛР) проводяться в умовах лабораторії другого або третього рівня біобезпеки залежно від епідемічної ситуації з використанням засобів індивідуального захисту.

3. Вірусологічні дослідження (зараження культур клітин або курячих ембріонів з метою ізоляції та ідентифікації вірусу), а також роботи, пов'язані з утворенням аерозолю вірусів грипу з пандемічним потенціалом, виконуються в умовах лабораторії з третім рівнем біобезпеки (BSL-3).

1. Всі предмети, що знаходилися в контакті з потенційно інфікованими матеріалами, підлягають знезараженню.

2. Знезараження поверхонь приміщень (підлога, стіни, двері), обладнання, робочих столів при лабораторній діагностиці захворювань, викликаних вірусами грипу, проводиться сучасними дезінфекційними засобами, що зареєстровані в Україні та мають віруліцидну активність відносно респіраторних вірусів і не впливають на хід дослідження.

3. Знезараження лабораторного посуду, наконечників, вірусовмісних рідин, агарозного гелю, інструментарію з металу, засобів індивідуального захисту одноразового використання та відпрацьованого матеріалу проводиться методом автоклавування (тиск 2,0 кгс/см-3, температура 132 °С ± 2 °С протягом 45 хвилин). Знезараження дозаторів проводять двократним протиранням з інтервалом 15 хвилин 70-відсотковим етиловим спиртом або за інструкцією виробника.

1. Виявлення достовірного позитивного результату дослідження на грип та гострі респіраторні інфекції (далі - ГРІ) залежить від дотримання правил відбору зразків матеріалів, наведених у додатку 1 до цієї Інструкції, їх оперативної доставки до лабораторного центру і належного зберігання до проведення лабораторної діагностики.

2. Зразки клінічного матеріалу відбирають при зверненні пацієнта за медичною допомогою або його госпіталізації не пізніше 72 годин з часу появи симптомів захворювання до початку проведення антивірусної терапії.

3. Зразки матеріалів від осіб, померлих від грипу, ГРІ або з підозрою на неї, потрібно відбирати в межах 6-12 годин з часу біологічної смерті.

4. Відбір клінічного (секційного) матеріалу та його пакування проводять медичні працівники закладу стерильними інструментами в стерильні одноразові кріофлакони, пробірки, контейнери з гвинтовими кришками.

5. Працівники закладу обов'язково проходять навчання щодо правил дотримання біологічної безпеки при роботі з інфекційним матеріалом.

6. Лікар закладу під час огляду пацієнта визначає методи відбору зразків матеріалу для лабораторного дослідження:

1) мазок із зіва;

2) назальний мазок;

3) мазок або аспірат із носоглотки;

4) аспірат фарингальний або бронхіальний;

5) зразки крові на початку захворювання та через 10-14 діб.

7. Відібрані мазки із зіва та носа допустимо об'єднувати в одну пробу та транспортувати в стерильних кріопробірках або кріофлаконах із використанням транспортного середовища.

8. Зразки матеріалів із дихальних шляхів для дослідження відбирають медичні працівники, при цьому використовуються такі матеріали:

1) засоби індивідуального захисту;

2) пластикові палички із стерильними тампонами з дакрону або віскози (дерев'яні палички з тампонами з альгінату кальцію або бавовни можуть містити речовини, що інактивують віруси та уповільнюють тестування в ПЛР, тому їх використовують лише за відсутності дакронових або віскозних тампонів), шпатель для язика (для взяття мазків із зіва), зразки яких наведено у додатку 2 до цієї Інструкції;

3) пластикові пробірки (кріопробірки, кріофлакони) місткістю 2-3 мл, що витримують температури в діапазоні від мінус 70 °C до мінус 180 °C (рідкий азот);

4) спиртостійкий маркер для маркування зразків.

1. Відібрані зразки матеріалів зберігають у пластикових пробірках з транспортним середовищем при температурі 4 °C не більше 48 годин.

Для транспортування зразків матеріалів використовують 2-3 мл транспортного середовища (комерційного або приготовленого), розлитого в пластикові пробірки.

Склад транспортного середовища:

10 г пептону;

2 г бичачого альбуміну (фракція V);

0,8 мл розчину гентаміцину сульфату (50 мг/мл);

3,2 мл амфотерицину В (250 мкг/мл).

Довести до 400 мл стерильною дистильованою водою. Стерилізувати фільтрацією.

Виготовлене транспортне середовище зберігається в стерильних умовах без доступу світла при 4 °С - 8 °С протягом одного місяця або мінус 20 °С - протягом року.

2. За неможливості дослідити зразки матеріалів протягом 24-48 годин їх заморожують при температурі мінус 70 °C або у рідкому азоті. Секційний матеріал після відбору підлягає обов'язковому заморожуванню. Зразки матеріалів із дихальних шляхів у транспортному середовищі доставляють протягом 24-48 годин з часу відбору до лабораторного центру. Якщо неможливо своєчасно доставити до лабораторії, зразки матеріалів заморожують при температурі мінус 70 °C або в рідкому азоті та розморожують безпосередньо перед проведенням дослідження. Кожен зразок для довготривалого зберігання при температурі мінус 70 °C розділяється на аліквоти для додаткового, повторного тестування або архівації.

3. Кількість циклів заморожування/розморожування має бути мінімальною, оскільки це може зруйнувати вірус у зразку. Зразки матеріалів не слід зберігати у морозильній камері (мінус 20 °C) з циклом заморожування/розморожування; в такому випадку пробу можна тримати на льоду протягом тижня.

4. Зразки упаковуються згідно з вимогами до пакування P650 для інфекційних субстанцій UN 3373 категорії B. Транспортування зразків матеріалів здійснюється відповідно до правил поштових та кур'єрських перевезень.

Зразки матеріалів пакують у три прошарки:

перший - кріопробірка (кріофлакон із гвинтовою кришкою);

другий - контейнер, що не пропускає рідину (пакет із застібкою, контейнер із пластика);

третій - тверде зовнішнє пакування (сумка-холодильник).

Між кріопробіркою (кріофлаконом) та другим водонепроникним шаром розміщують абсорбуючий матеріал, достатній для абсорбції всього об'єму рідких зразків матеріалів.

Для індикації вірусів грипу та ГРІ проводять дослідження зразків матеріалів методом ПЛР згідно з інструкцією виробника тест-систем.

Результати дослідження інтерпретують із урахуванням клінічних та епідеміологічних даних.

Виділення та культивування вірусів грипу на культурі клітин Madin-Darby canine kidney (далі - MDCK):

з метою ізоляції вірусів грипу із зразків матеріалів від пацієнтів з підозрою на грип використовують культуру клітин MDCK;

ведення культури клітин MDCK розпочинають з приготування інгредієнтів: середовища росту, підтримувального середовища, розчину трипсину згідно з додатком 3 до цієї Інструкції;

проведення інфікування культури клітин MDCК клінічним матеріалом від пацієнтів з підозрою на грип або інші респіраторні вірусні інфекції або 10-11-денних курячих ембріонів;

інфіковані клітини MDCК на середовищі для підтримання росту поміщають в термостат для накопичення вірусу на 5-7 діб із щоденною мікроскопією культури клітин для виявлення цитопатичної дії вірусу (далі - ЦПД);

за необхідності ізоляцію вірусів грипу проводять на курячих ембріонах паралельно з інфікуванням клітин MDCК;

визначення наявності вірусу грипу в амніотичній, алантоїсній або культуральній рідинах проводять у реакції гемаглютинації (далі - РГА);

типування вірусу грипу проводять у реакції гальмування гемаглютинації (далі - РГГА), для чого відбирають у стерильні пробірки алантоїсну (амніотичну) рідину, тестують з грипозними діагностичними сироватками згідно з інструкцією виробника;

додатковий метод підтвердження наявності вірусу грипу в ізоляті - імунохроматографія (далі - ІХА).

Серологічна діагностика ґрунтується на виявленні приросту антитіл в парних сироватках пацієнтів. З цією метою застосовують РГГА або визначають наявність антитіл різних класів методом імуноферментного аналізу (далі - ІФА).

РГГА має такі етапи:

підготовка сироваток;

приготування робочої дози вірусу;

приготування суспензії еритроцитів;

постановка реакції.

З грипозними антигенами для проведення РГГА використовують 1 % суспензію еритроцитів курей чи людини 0 (І) групи та комерційні діагностикуми грипозних антигенів із штамів вірусів грипу.

Перед постановкою реакції парні сироватки від пацієнтів розводять в 10 разів фізіологічним розчином (далі - ФР) і прогрівають на водяній бані при температурі 56 °C протягом 30 хвилин. Готують робочу дозу вірусу, суспензії еритроцитів та проводять реакцію.

У разі використання парагрипозних антигенів при постановці РГГА для вилучення неспецифічних інгібіторів сироватки обробляють еритроцитами морської свинки та коаліном. Для цього сироватку змішують з 10 % суспензією еритроцитів морської свинки у співвідношенні 1:5. Після 30-хвилинної інкубації при температурі 4 °C суміш центрифугують і до надосадової рідини додають рівний об'єм 25 % розчину каоліну на ФР. Суміш активно струшують в шутелі 20 хвилин, а потім центрифугують 10 хвилин при 2000 об/хв. Надосадова рідина - це сироватка в розведенні 1:10. В реакції використовують 0,5 % суспензію еритроцитів морської свинки.

Діагностикум розводять до вмісту 4 аглютинуючих одиниць (далі - АО) вірусу у робочій дозі. Постановку реакції проводять згідно з інструкцією виробника.

Діагностично достовірним є чотирикратне збільшення титрів антитіл у сироватці, отриманій на 10-14 день, порівняно із сироваткою, взятою на початку захворювання.

1. Метод імунофлуоресцентних антитіл (далі - МФА) використовують для швидкої діагностики грипу, парагрипу, адено-, РС-вірусної інфекції та мікоплазми пневмонії, а також змішаних інфекцій. В основі методу лежить здатність антигенів вступати в реакцію зі специфічними противірусними антитілами, міченими флуорохромом. Етіологічний діагноз встановлюють за допомогою МФА через 3-4 години при дослідженні препаратів від пацієнтів і через 24-48 годин при зараженні культури клітин. Ефективність досліджень найвища в гострій фазі захворювання і суттєво залежить від якості відбору зразків матеріалів та приготування препаратів.

2. Діагностика здійснюється у двох напрямах:

1) виявлення вірусного антигену в клітинах циліндричного епітелію слизової оболонки носоглотки або у відбитках із секційного матеріалу;

2) виявлення вірусного антигену в культурах клітин, інфікованих матеріалом від пацієнтів.

3. Використовують прямий і непрямий методи імунофлуоресценції:

1) при прямій модифікації методу використовують комерційні флуоресцентні глобуліни проти вірусів грипу, парагрипу, аденовірусів, РС-вірусів та інших;

2) для непрямого методу використовують противірусні імунні сироватки різних видів тварин і відповідні антивидові флуоресцентні глобуліни.

4. Фарбування препаратів та оцінка результатів проводяться згідно з інструкцією виробника щодо флуоресцентних діагностичних імуноглобулінів.

Наявність збудників респіраторних інфекцій, фрагментів нуклеїнових кислот та їх антигенів у зразках матеріалів від пацієнтів із підозрою на грип та ГРВІ визначають згідно з додатком 4 до цієї Інструкції такими методами:

вірусологічний;

ПЛР

МФА;

ІФА;

ІХА.

Специфічні антитіла визначають у реакції РЗК, ІФА, реакції нейтралізації.

Для роботи з культурою клітин МDСК готують такі інгредієнти:

ростове середовище:

до 500 мл середовища Ігла в модифікації Дальбекко, каталожний номер 1033220 (далі - DMEM), додають: