Щороку в Україні від людей та з об'єктів довкілля виділяються культури сибірки. Тільки за останні три роки від людей було виділено 14, а з об'єктів довкілля 9 штамів Bacillus anthracis.

Обсяг лабораторних досліджень на сибірку в 2001 році зріс у порівнянні з минулими роками майже на 20%. Збільшення обсягу досліджень, в першу чергу з об'єктів довкілля, пов'язано з терористичними актами використання збудника сибірки і випадками зараження ним людей в деяких країнах світу та з метою попередження виникнення надзвичайних ситуацій в нашій країні. Проби "невідомих речовин" досліджувались у всіх областях, окрім Київської. Найбільше цих досліджень проведено в Донецькій, Дніпропетровській, Херсонській, Волинській, Полтавській, Черкаській, Кіровоградській областях, містах Києві та Севастополі.

Надзвичайна ситуація 2001 року ще раз підтвердила необхідність постійної готовності до проведення лабораторних досліджень на особливо небезпечні інфекції, в т.ч. сибірки.

З метою удосконалення лабораторної діагностики сибірки

1. Затвердити Інструкцію з лабораторної діагностики сибірки у людей, в сировині тваринного походження та об'єктах довкілля (додається).

2. Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Севастопольської міської державних адміністрацій, Головного управління охорони здоров'я Київської міської державної адміністрації, головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя, головному лікарю Центральної санепідстанції МОЗ України, директору Українського науково-дослідного протичумного інституту, начальнику Кримської протичумної станції:

2.1. Забезпечити своєчасну діагностику сибірки в осіб, з підозрою на це захворювання, в сировині тваринного походження та об'єктах довкілля відповідно до Інструкції.

2.2. Вжити заходів щодо забезпечення постійної готовності установ до проведення таких досліджень.

3. Головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва і Севастополя:

3.1. Забезпечити лабораторії відділів особливо небезпечних інфекцій необхідними діагностичними поживними середовищами, імунобіологічними препаратами, реактивами, антибіотиками та лабораторними тваринами.

3.2. Встановити жорсткий контроль за виконанням вимог протиепідемічного режиму в підрозділах, де проводиться робота з матеріалом, підозрілим на контамінацію збудником сибірки, та надійну систему охорони їх.

3.3. Направляти виділені штами збудника сибірки для ідентифікації та подальшого вивчення до лабораторії особливо небезпечних інфекцій Центральної санітарно-епідеміологічної станції МОЗ України - референс лабораторії з діагностики зооантропонозних інфекцій.

4. Центральній санітарно-епідеміологічній станції МОЗ України (Некрасова Л.С.)

4.1. Надавати установам та закладам охорони здоров'я, державної санітарно-епідеміологічної служби організаційно-методичну і практичну допомогу з питань лабораторної діагностики сибірки.

4.2. Забезпечити ідентифікацію та вивчення штамів збудника сибірки, виділених від хворих та з об'єктів довкілля.

5. Вважати такими, що втратили чинність "Методические указания по лабораторной диагностике сибирской язвы у животных и людей и обнаружению возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения в объектах внешней среды", Москва, 1986.

6. Контроль за виконанням наказу покласти на начальника Головного санепідуправління МОЗ України Бережного С.П.

Лабораторні дослідження на сибірку від людей та з об'єктів довкілля здійснюються на базі лабораторій відділів особливо небезпечних інфекцій санепідстанцій, в протичумних установах, які мають дозвіл на роботу із збудниками II групи патогенності.

Дослідження на сибірку включає мікроскопію мазків з досліджуваного матеріалу, посіви на поживні середовища, постановку біопроби, при необхідності, реакцію преципітації, ідентифікацію виділених культур.

Збудник сибірки - Вас. anthracis, відноситься до роду Bacillus, сімейства Bacillacea, - нерухома велика грампозитивна паличка, довжиною 5-10 мк, товщиною 1-1,5 мк, оптимум росту 35-37 град. С, рН 7,2-7,6.

При культивуванні на поживних середовищах, а також в трупному матеріалі утворює спори. Спори овоїдної форми, містяться в центрі мікробної клітини, не перевищуючи її поперечника. В організмі людини, сприйнятливих тварин, свіжих трупах та крові загиблих тварин, а також на поживних середовищах з додаванням сироватки або крові утворює капсулу. Здатність утворювати капсулу і специфічний екзотоксин обумовлює патогенність збудника.

Збудник сибірки невибагливий до поживних середовищ, дає пишний ріст на МПБ і МПА. В бульйоні ріст у вигляді крупних пластівців, які через добу осідають на дно пробірки нагадуючи "жмуток вати".

На агарі ріст бацил сибірки можна помітити під малим збільшенням мікроскопа вже через 4 години після вирощування в термостаті. Через 18-20 годин з'являються добре розвинені колонії збудника сибірки - великі, шорсткі, матові, білувато-сірі, по зовнішньому виду нагадують пухкий таючий сніг. Типовим для молодих колоній сибірки є наявність тонких відростків - "вусиків". Під малим збільшенням мікроскопа (у 10-60 разів) колонії мають вид локонів, що складаються зі сплетень довгих ниток мікробів і отримали назву "голови медузи", "левової гриви".

Збудник сибірки може розкладати з утворюванням кислоти без газу глюкозу, мальтозу, сахарозу. При посіві на молоко воно зсідається повільно, через 2-4 доби і надалі також повільно пептонізується. Лакмусове молоко червоніє за рахунок утворення кислоти.

У збудника сибірки встановлена наявність каталази і лецитінази, немає уреазної та фосфотазної активності, він чутливий до пеніциліну, лізується специфічними бактеріофагами, патогенний для лабораторних тварин.

2.1. Відбір і пересилка матеріалу на дослідження

Матеріал забирають:

- від хворого - медичний персонал лікувально-профілактичних закладів, негайно після виявлення і до початку лікування антибіотиками;

- при обстеженні вогнищ - помічники епідеміологів;

- трупний матеріал - патологоанатоми і судмедексперти в спеціалізованих закладах.

При шкірній формі захворювання дослідженню підлягає вміст везикул, карбункулів, виразка або відторгнутий струп. Перед відбором матеріалу у хворого (бажано до початку лікування) шкіра навколо ураженого місця і поверхня карбункула обережно протираються спиртом.

При підозрі на легеневу форму сибірки досліджується мокрота, на кишкову форму - випорожнення хворого або сеча (1-2 л).

У випадках септичної форми захворювання беруть кров із вени, бажано в період гарячки. Кров в кількості 1-2 мл засівають на рідкі та 1-2 краплі на щільні поживні середовища, а також роблять два тонких мазки на предметних скельцях.

У померлих беруть частини уражених органів, тканин, кров, селезінку у встановленому порядку щодо проведення патолого-анатомічних та серцево-медичних експертних досліджень.

2.2. Направлення матеріалу на дослідження

Патологічний матеріал, що підлягає дослідженню, вміщують у стерильний посуд (пробірки, банки). Висушені мазки вміщують у чашки Петрі, які обгортають щільним папером. На упаковці роблять напис "Мазок не фіксований!".

Посуд із патологічним матеріалом вміщують у вологонепроникливу тару, обв'язують, пломбують або опечатують, роблять надпис "Верх, обережно" і направляють в лабораторію спеціальним посильним.

На супровідній етикетці до матеріалу вказують прізвище, ім'я, по батькові хворого (померлого), дата захворювання, місце і час забору матеріалу, його назву і можливий діагноз.

2.3. Порядок проведення дослідження

Лабораторне дослідження матеріалу включає:

- мікроскопічне дослідження (перегляд мазків і ІФМ);

- бактеріологічне дослідження (посіви на поживні середовища, виділення чистої культури);

- біологічне дослідження (на лабораторних тваринах);

- серологічне дослідження (реакція преципітації і РПГА);

- ідентифікацію виділених культур.

У випадку доставки матеріалу, що загнив, його досліджують тільки в реакції преципітації.

2.4. Мікроскопічне (попереднє) дослідження

2.4.1. З доставленого матеріалу роблять мазки, фіксують етиловим спиртом з добавленням 3% перекису водню (додаток п.1), фарбують по Граму і на капсулу по Ребігеру, Міхіну, Ольту або Романовському-Гимзі; а також обробляють люмінесцентними сироватками - по методу флуоресцуючих антитіл.

2.4.2. В мазках, пофарбованих по Граму, Вас. anthracis - прямі грампозитивні палички, які розташовуються короткими ланцюжками або попарно, кінці їх звернені один до одного, різко обрубані, вільні кінці закруглені. В окремих випадках форма збудників сибірки може бути нехарактерною (короткі товсті або зігнуті, іноді зернисті палички зі здуттям посередині або на кінці, можлива наявність "тіней" мікробів).

В мазках із свіжого патологічного матеріалу, пофарбованих спеціальними методами, палички сибірки оточені капсулою. Існують штами сибірки, які не утворюють капсулу і є авірулентними. Виділення та ідентифікація таких культур наведена в додатку до лабораторної діагностики. При фарбуванні мазків із несвіжого патологічного матеріалу мікроби можуть бути трохи збільшені, кінці закруглені, морфологічна структура бацил порушена, вони наче поїдені, іноді залишаються "тіні", а від капсул можуть залишатися обривки, які дуже слабо забарвлюються.

2.4.3. Обробку препаратів люмінесцентними сироватками проводять відповідно до настанови по їх застосуванню.

Виявлення в мазку специфічного свічіння дозволяє підозрювати наявність у досліджуваній пробі збудника сибірки.

2.4.4. За результатами мікроскопічного дослідження негайно видається попередня відповідь.

2.5. Бактеріологічне дослідження (посіви на поживні середовища)

2.5.1. Посіви з досліджуваного матеріалу проводять на диференційно-діагностичне середовище з 0,01% фенолфталеїнфосфату натрію або м'ясо-пептонний агар (МПА), м'ясо-пептонний бульйон (МПБ), або бульйон і агар Хотінгера (рН 7,4 +- 0,2).

Посіви інкубують 18-24 год. при температурі 37 +-1 град. С, а при відсутності росту, витримують при цій же температурі ще 48 год.

З свіжого патологічного матеріалу можна одночасно робити висіви на систему диск-преципітації (додаток 2). Посів проводять пастерівською піпеткою в МПБ, що знаходиться над шаром агарового гелю. Не слід вносити в середовище багато крові або великі шматочки кровонаповнених органів, тому що це затруднює виявлення специфічного диску преципітації внаслідок фарбування гелю.

Постановка та облік диск-преципітації в п. 3.5.

2.5.2. На щільних поживних середовищах збудник сибірки утворює плоскі матово-сірі шорсткуваті (R-форма) колонії. Центр колоній іноді затемнений, периферія торочкувата з локоноподібними паростками. Зустрічаються колонії з менш вираженою шорсткістю і без паростків, вони також підлягають подальшій ідентифікації. Під малим збільшенням мікроскопа колонії мають вид локонів.

Культури, що виросли на диференційно-діагностичному середовищі обробляють парами аміаку і для подальшого дослідження відбирають тільки безбарвні колонії.

МПБ після добового росту збудників сибірки залишається прозорим, на дні утворюється пухкий осад у вигляді жмутка вати. При струшуванні пробірки бульйон не мутніє, осад розбивається на дрібні пластівці. В окремих випадках у МПБ може бути дифузний ріст культури (легке помутніння), при струшуванні утворюються муарові хвилі.

2.5.3. З бульйонної культури роблять мазки, фарбують по Граму і досліджують під мікроскопом. У мазках з типової бульйонної культури збудника сибірки палички виявляються у вигляді ланцюжків, із бульйонної культури з дифузним ростом - окремі або парно розташовані палички.

2.5.4. При одержанні змішаної культури, виділення чистої культури збудника сибірки проводять звичайними методами (дрібний розсів на щільні поживні середовища в чашки Петрі, відсів окремих колоній, зараження білих мишей).

2.5.5. З шорсткуватих колоній, що виросли на МПА, а також із безбарвних колоній на диференційно-діагностичному середовищі роблять мазки, пересівають у МПБ і на МПА для подальшої їх ідентифікації.

При відсутності росту посіви витримують 5 діб.

Досліджувані культури замість МПБ можна пересівати в систему для постановки реакції диск-преципітації. У цьому випадку подальшу роботу проводять тільки з культурами, що дали позитивні або нечіткі результати.

2.6. Біологічне дослідження

2.6.1. Зараження лабораторних тварин досліджуваним матеріалом є обов'язковим і проводиться в день надходження матеріалу одночасно з посівом на поживні середовища. Досліджуваний матеріал, розтертий у невеликому об'ємі 0,9%-ного розчину натрію хлориду, вводять двом білим мишам у дозі 0,2-0,5 мл під шкіру спини ближче до кореня хвоста або двом морським свинкам у дозі 0,5-1,0 мл підшкірно в області внутрішньої поверхні стегна. При дослідженні крові ("чистого" матеріалу) використовується внурішньочеревне зараження. Загибель заражених білих мишей наступає через 1-2 доби з появленням набряку і загального сепсису, морські свинки через 2-3 доби з тими ж проявами. Іноді загибель відбувається пізніше.

2.6.2. Тварин, які загинули, розтинають, роблять мазки і посіви з крові серця, селезінки, печінки, інфільтрату на місці ін'єкції досліджуваного матеріалу.

В мазках з крові, серця, селезінки бактеріоскопічно встановлюють наявність збудників сибірки у вигляді коротких ланцюжків, паличок, оточених капсулою. Посіви з органів та крові дають на МПА колонії R-форми, а на бульйоні - ріст із утворенням пластівців на дні пробірки (жмуток вати).

При розтині лабораторних тварин, що загинули від сибірки, виявляється типова патолого-анатомічна картина.

При підшкірному зараженні - різкий драглеподібний набряк підшкірної клітчатки, ексудат в черевній та грудній порожнинах, багаточисельні геморагії, збільшення лімфатичних вузлів. Печінка та селезінка збільшені, кров, як правило, не згортається. В легенях - пневмонічні ділянки. У випадках дуже швидкої смерті тварин, патолога-анатомічні зміни, особливо набряк, не встигають розвинутись і виражені не так різко.

Необхідно враховувати, що при дослідженні матеріалу (особливо матеріалу від тварин) лабораторні тварини можуть загинути від супутньої патогенної мікрофлори, частіше від пастерел. У цих випадках проводять повторне зараження лабораторних тварин виділеними підозрілими на збудник сибірки культурами.

2.6.3. У випадках, коли чиста культура збудника з посівів матеріалу на поживному середовищі отримана раніше, ніж наступить смерть заражених тварин, додатково заражають добовою бульйонною культурою двох лабораторних тварин в дозах, зазначених вище.

2.6.4. Спостереження за лабораторними тваринами, зараженими патологічним матеріалом або культурою, ведуть протягом 10 діб. Розтин тварин проводять тільки в разі їх загибелі.

2.7. Серологічні дослідження

2.7.1. Реакція преципітації. Ця реакція не застосовується для прижиттєвого діагнозу. Перед постановкою реакції свіжий патологічний матеріал витримують у термостаті протягом 18-20 год. Несвіжий патологічний матеріал екстрагують без витримування в термостаті.

Екстрагування проводять двома способами: гарячим і холодним. При цьому потрібно враховувати, що екстракти, отримані гарячим способом, бідніші преципітиногенами.

Гарячий спосіб екстрагування: шматочки досліджуваного патологічного матеріалу (1-2 г) вміщують в пробірку або колбу, заливають 0,9%-ним розчином натрію хлориду в співвідношенні 1:10 і кип'ятять протягом 30-40 хв. на водяній бані.

Холодний спосіб екстрагування: шматочки патологічного матеріалу (1-2 г) розтирають в ступці з піском, переносять в колбу або баночку, заливають 0,9%-ним розчином натрію хлориду (з додаванням 0,3% кристалічного фенолу) в співвідношенні 1:10 і залишають на 16-18 год. при температурі (20 +- 2) град. С.

Отримані екстракти фільтрують через азбестову вату або фільтрувальний папір до прозорості, перші краплі фільтрату видаляють.

Реакцію ставлять шляхом нашаровування або підшаровування.

При нашаровуванні в уленгутівську пробірку наливають 0,2 - 0,3 мл прозорої преципітуючої сибіркової сироватки і обережно нашаровують рівну кількість екстракту так, щоб між компонентами була чітко виражена межа (тонка пряма лінія).

При підшаровуванні в уленгутівську пробірку спочатку вносять 0,2-0,3 мл екстракту, потім під нього обережно пастерівською піпеткою підшаровують рівну кількість преципітуючої сироватки.

Якщо при з'єднанні компонентів чітко виражена межа між ними відсутня, реакцію ставлять повторно.

Одночасно ставлять контроль преципітуючої сибіркової сироватки з стандартним сибірковим антигеном. Через 1-2 хв. після з'єднання компонентів, з'являється характерне кільце (реакція позитивна) та негативний контроль сироватки з неспецифічним антигеном.

Реакцію вважають позитивною, якщо через 1-2 хв. і не пізніше, ніж через 15 хв. на межі між компонентами з'явиться тонке білувате кільце.

При негативному результаті реакції преципітації з екстрактом, отриманим гарячим способом, реакцію ставлять повторно з екстрактом, отриманим холодним способом.

Е.Шляхов, С.Шварц та ін. запропонували для діагностики сибірки використовувати дифузну преципітацію в агаровому гелі з екстрактом із струпа карбункула (1964). Агар, що використовується для реакції преципітації, розливають в чашки Петрі. По охолодженні в ньому вирізають два ряди лунок, дно яких заливають тонким шаром того ж агару. Відстань між лунками - 6 мм. В один ряд лунок наливають по 0,2 мл сибіркової сироватки, в другий - екстракт струпа - цільний і розведений в 2-4-8-16 разів в тому ж об'ємі. Для контролю в одну з лунок другого ряду вносять сибірковий антиген. Чашки витримують при кімнатній температурі протягом 48 годин. При позитивному результаті між лунками з сироваткою і екстрактом із струпа з'являється лінія преципітації, що відповідна до лінії в контролі. При дослідженні струпа реакція специфічна.

2.7.3. Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РНГА)

Реакція використовується для виявлення та ідентифікації спорових та вегетативних форм збудника сибірки в підозрілих культурах, об'єктах довкілля та матеріалі від хворих людей і тварин. Постановка та облік результатів проводиться відповідно до настанови по застосуванню еритроцитарного діагостикума.

2.8. Ідентифікація збудника сибірки

2.8.1. Ідентифікацію збудника сибірки проводять за такими ознаками:

- морфологія мікроба, включаючи наявність капсул в мазках із досліджуваного матеріалу або органів загиблих лабораторних тварин;

культуральні властивості;

чутливість до пеніциліну; *

чутливість до специфічних фагів;

патогенність для лабораторних тварин

_______________

* На території України мають місце випадки виділення штамів, нечутливих до пеніциліну

2.8.2. Чутливість до пеніциліну (тест "перлинового намиста")

Агар, що містить 0,5 і 0,05 одиниць (од.) пеніциліну в 1 мл середовища (додаток 5), і без нього, розливають у чашки Петрі; після застигання пробіркою з рівними краями надсікають агар або вирізують пластинки (1,5 х 1,5 см), які переносять на предметні скельця і вміщують у чашки Петрі. На кожну пластинку бактеріологічною петлею наносять 3-годинну бульйонну культуру. Чашки закривають кришками і вміщують у термостат. Через 1-3 год. посіви переглядають під мікроскопом з сухою (об'єктив х 40) і імерсійною системами. Перед переглядом зону росту накривають покривним склом. Мікроби сибірки на МПА з пеніциліном приймають кулькоподібні форми, а ланцюжки мають вигляд "перлинового намиста". Спороутворюючі сапрофітні аеробні мікроби в аналогічних умовах виростають у вигляді звичайних форм. На агарі без пеніциліну збудник сибірки утворює довгі ланцюжки, що складаються з типових паличок. При негативному результаті мікроскопії інкубацію посівів продовжують до 6 год., після чого досліджують повторно і роблять заключний облік тесту.

Модифікація тесту "перлинового намиста" з використанням 0,3% агару Хотінгера (Н.П.Буравцева, В.О.Ярощук)

До розплавленого і охолодженого до 43 град. С 0,3% агару Хотінгера рН (7,3-7,6) додають 20-40% інактивованої при 56 град. С кінської сироватки. Виготовлене середовище стерильно розливають по 4,5 мл в пробірки і засівають по 0,1 мл суспензії спорової або вегетативної форми культури сибірки, що містить від 100 тис. мікробних клітин по стандарту мутності.

Пробірки з посівами інкубують на протязі 4 годин при 37 град. С, потім додають пеніцилін із розрахунку 0,5-0,05 од. на 1 мл середовища. Пробірки ставлять в термостат при 37 град. С на підрощування на 1,5-2 години, після чого роблять мазки, висушують на повітрі і фіксують в етиловому 96 % спирті з доданням 3% перекису водню на протязі 30 хвилин. Після фіксації мазки висушують на повітрі, фарбують метиленовою синькою або люмінесцентними сироватками і мікроскопують.

Модифікація тесту "перлинового намиста" з використанням МПБ.

Використовується МПБ з додаванням 20% інактивованої кінської сироватки. На 100 мл МПБ вноситься 0,5 мл розчину, що вміщує 100 од. пеніциліну в 1 мл (отримуємо в 1 мл МПБ 0,5 од. пеніциліну). Для отримання в 1 мл МПБ 0,05 од. пеніциліну в 100 мл МПБ вносять 0,5 мл пеніциліну, що містить 10 од/мл.

В 3 мл МПБ з інактивованою кінською сироваткою та розчинами пеніциліну (0,5 та 0,05 од/мл) додається по 2-3 краплі 3-годинної або добової бульйонної культури і інкубується напротязі 3 годин при температурі 37 град. С. Готують мазки, матеріал беруть з дна пробірки, мазки фіксують рідиною Карнуа (6 частин етилового спирту, 3 частини хлороформу, 1 частина крижаної оцтової кислоти) до її випарювання, фарбують метиленовою синькою 20-30 секунд і мікроскопують.

Bacillus anthracis знаходиться в мазках у вигляді куликоподібних форм.

B. Cereus та інші сапрофітні бацили на середовищі з пеніциліном ростуть звичайно. У випадку негативного результату інкубацію посівів слід продовжити до 6 годин.

2.8.3. Чутливість до специфічних фагів

Чутливість до фагів визначають одним з таких методів: стікаючої краплі, пробірочним або мікрометодом з використанням сибіркового бактеріофагу К, ВІЕВ у відповідності з настановами по застосуванню. Для тесту фаготипування використовують збудник сибірки тільки у вегетативній формі.

2.8.4. Патогенність для лабораторних тварин

Патогенність підтверджується смертю хоча б однієї з двох лабораторних тварин, заражених досліджуваним матеріалом або отриманою культурою, з подальшим виділенням з його органів типової культури збудника сибірки.

2.8.5. Додаткові тести ідентифікації.

Відсутність гемолізу визначається при посіві досліджуваної культури на МПА з 5-10% дефібрінованої крові барана. Посіви інкубують при 37 град. С на протязі 18-20 годин і проводять облік.

Відсутність лецитіназної активності визначається при посіві досліджуваної культури на рідке яєчне середовище. Середовище виготовляють шляхом змішування однієї частини курячого жовтка, що стерильно забирається, з двома частинами стерильного 0,85% розчину хлориду натрію. Середовище розливають в пробірки, засівають петлею досліджувану культуру і інкубують при 37 град. С. Збудник сибірки, як правило, жовток не згортає на протязі декількох діб інкубації.

Відсутність фосфотазної активності визначається на такому середовищі. До розплавленого і охолодженого до 45 град. С МПА додають 0.001% фенолфталеїнфосфату натрію. Середовище розливається в чашки Петрі і, після підсушування, на поверхню штрихом засівається досліджувана культура. Через 18-24 години на поверхню агару додається декілька краплин нашатирного спирту. Колонії сибірки, що не утворюють фосфотази, залишаються безбарвними, а колонії спороутворюючих сапрофітів забарвлюються від рожевого до червоного кольору.

2.8.6. Виділену культуру відносять до Вас. anthracis:

- при наявності характерних морфологічних і культуральних властивостей, капсул у мазках із патологічного матеріалу або з органів загиблої тварини;

- при відсутності капсул, але наявності інших характерних морфологічних і культуральних властивостей, чутливості до сибіркового фагу і пеніциліну.

2.9. Терміни дослідження:

- мікроскопічного - у день надходження матеріалу;

- бактеріологічного - до 3 діб;

- біологічного - до 10 діб.

3.1. Дослідження об'єктів довкілля і сировини тваринного походження проводять:

- при необхідності встановити або підтвердити джерело або фактор передачі інфекції;

- для виявлення обсіменіння збудником сибірки окремих об'єктів;

- з метою виявлення збудника сибірки в місцях старих скотомогильників при проведенні будівельних, меліоративних, гідротехнічних та інших робіт, пов'язаних з вибиранням і переміщенням грунту;

- для підтвердження результатів дослідження шкурок смушку, козеняти та ін. у випадках позитивної реакції преципітації.

- проведення внутрішнього лабораторного бактеріологічного контролю - змиви з лабораторного обладнання, інструментарію, відбір проб повітря в лабораторіях, де проводять дослідження на сибірку, змивів та ін.

3.2. Взяття матеріалу на дослідження

3.2.1. Відбір проб вовни. Для бактеріологічного дослідження беруть із різних місць не менше 5 зразків масою біля 2 г кожний (краще брати пучок забрудненої вовни). Якщо вовна упакована в паки, беруть не менше 10 зразків з різних місць кожної паки, а також пил, що зібрався всередині обшивки. Зразки від однієї паки об'єднують і упаковують разом.

3.2.2. Відбір проб шкіряно-хутряної сировини. Для дослідження беруть шматочки розміром 3 х 3 см з периферичних незагнилих і незацвілих шкурок поруч з місцями, звідки брали проби для контрольного дослідження. При наявності на внутрішній стороні шкурки синців або інфільтратів проби беруть і в цих місцях.

3.2.3. Відбір проб кормів. Концентровані корми (зерно, висівки, комбікорм) відбирають в залежності від умов їх зберігання.

При наявності незатарених кормів проби відбирають з розрахунку 1 проба масою не менше 100 г на 4 кв. м поверхні, але не менше 5 проб від кожного засіку, партії. Проби беруть як з поверхневих, так і з глибоких шарів кормів рівномірно по всій площі.

При наявності затарених кормів відбір проводять відповідно до такої таблиці:

Відбір проб проводять сухим стерильним щупом. Після взяття проб від кожного об'єкта (партії) щуп очищають і обпалюють вогнем паяльної лампи.

Проби грубих кормів (сіно, солома) беруть із різних місць скирти (стогу) за допомогою ножиць і пінцета з розрахунку 1 проба масою не менше 40 г на 4 кв. м площі скирти.

Зібрану зелену масу беруть, як і грубі корми, збільшивши масу проби до 100 г.

Коренеплоди (бульбоплоди) відбирають з розрахунку 1-3 штуки на 4 кв. м площі бурту, відсіку. З відібраних коренеплодів скальпелем у місцях, де є залишки землі, зрізають поверхневий шар, який використовують для дослідження.

Проби силосу, що зберігається в ямах (траншеях), відбирають як проби грунту, а вийнятого з траншей - як проби зеленої маси.

В лабораторію направляють середню пробу, яку складають з добре перемішаних проб даної партії, об'єму і т.п. Маса середньої проби не повинна перевищувати 500 г.

3.2.4. Відбір патологічного матеріалу від тварин

На дослідження направляють вухо, перев'язане в основі або мазки крові, отримані з надрізу вуха; від трупів свиней - шматки набряклої сполучної тканини і заглоточні підщелепні, а також інші лімфатичні вузли, в яких є характерні патолого-анатомічні зміни.

Вухо відрізають із тієї сторони, на якій лежить труп. Попередньо його туго перев'язують шпагатом в основі в двох місцях і відрізають між перев'язками. Місце відрізу вуха на трупі припікають.

Якщо підозра на сибірку виникла при розтині трупа тварини (крім трупів свиней), розтин припиняють і на дослідження направляють частину селезінки.

Відбір матеріалу від вимушено забитих тварин і його дослідження проводять відповідно до ДОСТ 21237-75 "М'ясо. Методи бактеріологічного аналізу" і діючими Правилами ветеринарного огляду забійних тварин і ветеринарно-санітарної експертизи м'яса і м'ясних продуктів.

3.2.5. Відбір проб грунту

Обстеженню підлягають ділянки, що підозрюються на зараження збудником сибірки. Площу, що досліджується, розбивають на квадратні ділянки зі стороною не більше 4 м. Грунтовим буром відбирають проби грунту масою 20-30 г кожна, по кутах і в центрі кожної ділянки.

Проби грунту з території, підозрюваної в поверхневому обсіменінні збудником сибірки, беруть на глибину до 15 см.

Перед взяттям проб на території скотомогильників верхній шар грунту на місці взяття проби знімають на 2-3 см і пробу беруть на глибині до двох метрів через кожні 25 см.

Вийнятий з глибини і не використаний для проб грунт з метою знезараження змішують з сухим хлорним вапном, що містить 25% активного хлору в співвідношенні 1 частина хлорного вапна на 3 частини грунту, злегка зволожують і скидають у шурф. Місце відбору проб дезінфікують розчином хлорного вапна, інструменти - вогнем паяльної лампи.

3.2.6. Відбір проб води

Проби води з природних і штучних водоймищ беруть з поверхні (на глибині 10-15 см) і біля дна за допомогою батометра або спеціально пристосованого бутлю. Об'єм кожної проби не менше 0,5 л, загальний об'єм не менше 1 л.

Крім того, беруть проби придонного осаду біля берега і досліджують їх як проби грунту.

3.2.7. Змиви з об'єктів довкілля роблять з площі 100 кв. см марлевим тампоном, змоченим стерильною водою.

Тампони вміщують в пробірки з 4-5 мл стерильної води або 0,9%-ного розчину натрію хлориду і закривають гумовим корком.

Кожну відібрану пробу вміщують в суху стерильну скляну банку і закривають стерильною кришкою, корком або пергаментом, можна використовувати поліетиленові мішечки, які зав'язують шпагатом. Проби води наливають в стерильні скляні пляшки і закривають стерильними гумовими корком. Проби нумерують (проби вовни - номером паки), упаковують у вологонепроникливу тару і направляють в лабораторію з посильним.

В направленні до проб вказують мету проведення дослідження, найменування матеріалу, його кількість, місце і дату відбору матеріалу. Для проб вовни і кормів додатково вказують їх походження, об'єм (масу) партії, вид упаковки і кількість пакувальних одиниць. При направленні до лабораторії кількох проб до супровідної прикладають опис, де вказують номери проб і місце відбору кожної проби.

3.2.8. Відбір і упаковку проб проводять з дотриманням правил особистої гігієни і загальноприйнятих в бактеріологічній практиці правил стерильного відбору матеріалу, не допускаючи розсіювання збудника як при відборі, так і транспортуванні проб.

3.3. Підготовка проб до дослідження

3.3.1. При підготовці проб до дослідження і подальшої обробки використовують тільки стерильні розчини, посуд, фільтри, інструменти.

3.3.2. Від кожної проби вовни відбирають найбільш забруднені частини, подрібнюють ножицями, разом із пилом вміщують в колбу і заливають 10-кратною (по масі) кількістю 0,9%-ного розчину натрію хлориду. Колбу закривають, ретельно струшують протягом 10-15 хв. і дають відстоятися. Змив фільтрують через 2-3 шари марлі для видалення грубих часток.

3.3.3. З різних місць проб шкурок беруть шматочки масою 1 г, вміщують в порцелянову ступку і заливають 0,9%-ним розчином натрію хлориду з таким розрахунком, щоб отримати 10-15 мл суспензії. Через деякий час (після достатнього розм'якшення матеріалу) шматочки подрібнюють ножицями і залишають при температурі 20 град. С ще на 2-3 год. Після цього проби добре розтирають в тій же рідині до отримання волокнистої мезги; мезгу видаляють, попередньо віджавши її товкачем на внутрішній бічній поверхні ступки.

3.3.4. Пробу кормів в кількості 50-100 г (грубі корми після подрібнення ножицями) вміщують в колбу і заливають 0,9%-ним розчином натрію хлориду з розрахунку отримання 15-20 мл змиву. Колбу закривають, ретельно струшують протягом 10-15 хв., дають відстоятися 5-8 хв., не допускаючи набухання кормів, і фільтрують через 2-3 шари марлі.

3.3.5. Проби грунту звільняють від коренів, камінчиків і ретельно перемішують. Від кожної проби беруть 50-70 г вміщують в колбу, заливають 0,9%-ним розчином натрію хлориду, дистильованою водою або 0,5%-ним розчином пірофосфату натрію з розрахунку отримання 15-20 мл змиву, добре струшують протягом 25 хв., дають відстоятися 5-8 хв. і фільтрують через 2-3 шари марлі.

3.3.6. Воду з мулистими частинками фільтрують через 2-3 шари марлі, чисту воду досліджують без попередньої підготовки.

3.3.7. Тампони, якими роблять змиви з об'єктів довкілля, віджимають об стінки пробірки і видаляють, а залишену рідину досліджують.

3.4. Методи збагачення і бактеріологічне дослідження

3.4.1. Змиви з вовни, кормів, грунту, підготовлені як вказано вище, а також проби води і змиви з об'єктів довкілля ділять на дві частини.

3.4.2. Одну частину прогрівають на водяній бані 80 хв. при 65 град. С і фільтрують через 1-2 мембранні фільтри N 3 у фільтрі Зейтца при невеликому вакуумі. Осад з кожного фільтру змивають 6-8 краплями 0,9%-ного розчину натрію хлориду і використовують для посіву.

Мембранні фільтри перед використанням стерилізують кип'ятінням в дистильованій воді два рази по 10 хв. зі зміною води, фільтр Зейтца - звичайним способом.

3.4.3. Другу частину змиву або проби без попереднього прогрівання фільтрують через мембранні фільтри і досліджують аналогічно прогрітій частині проби. Крім того, змивом з мембрани заражують двох білих мишей підшкірно в дозі 0,2-0,3 мл і спостерігають за ними 10 діб. З органів загиблих мишей роблять мазки, які фарбують по Граму і на капсулу, і посіви на МПА та МПБ.

3.4.4. Змиви з борошнистих кормів, які важко фільтруються через мембранні фільтри, центрифугують 15 хв. при 3000 об/хв. Висіви роблять з поверхневого шару надосадової рідини і осаду.

3.4.5. При відсутності мембранних фільтрів прогріті і непрогріті змиви, а також проби води центрифугують 15 хв. при 3000 об/хв., надосадову рідину видаляють, а з осаду роблять висів.

3.4.6. Суспензією з шкурок (п. 3.3.4.) заражають двох білих мишей, як вказано в п. 3.4.3.

Залишок суспензії центрифугують 15 хв. при 3000 об/хв., потім 2/3 надосадової рідини видаляють, рідину що залишилася з осадом прогрівають на водяній бані 30 хв. при 65 град. С. Після охолоджування осад використовують для посіву.

3.4.7. Матеріал, підготовлений для дослідження, висівають на 3-4 чашки Петрі з МПА або агаром Хотінгера і, при наявності, на диференційно-діагностичне середовище з 0,01% фенолфталеїнфосфатом натрію. Засіяні чашки інкубують в термостаті при температурі (37 +- 1) град. С протягом 18-24 годин.

3.4.8. Для ідентифікації з агару відбирають не менше 10 шорсткуватих колоній (при відсутності такої кількості - усі шорсткуваті колонії), які не змінили кольору після обробки парами аміаку.

3.4.9. З відібраних колоній роблять пересів на МПА і МПБ для подальшої ідентифікації (п.2.8), замість МПА пересів можна робити в систему для постановки диск-преципітації.

3.5. Постановка та облік реакції диск-преципітації

3.5.1. Посів роблять у рідке поживне середовище системи, не торкаючись гелю, із кожної колонії окремо або висівають суспензію, приготовлену з кількох (5-10) колоній. Посіви витримують в термостаті при (37 +-1) град. С 16-20 годин.

3.5.2. Облік результатів проводять візуально через 16-20 год. інкубації посівів в термостаті і при негативному результаті - повторно через 3-4 год. додаткової інкубації.

3.5.З. Пробірки витягують із термостату і залишають на 10-15 хв. при температурі (20 +- 2) град. С. Переглядають в прохідному світлі на чорному фоні.

3.5.4. Збудник сибірки утворює в середній частині стовпчика агарового гелю тонку з чіткою межею білу лінію (диск) преципітації, яка зберігається протягом 4 днів.

3.5.5. Грунтові сапрофітні бацили, за винятком деяких штамів Bacillus, дають негативний результат (диск преципітації відсутній). Окремі штами Bacillus через 16-20 годин утворять в нижній частині агарового стовпчика на межі з преципітуючою сироваткою рихлу зону преципітації, яка не має чітких меж і значно товща, ніж диск преципітації, що утворюється збудником сибірки. Через 36-40 годин зона преципітації, утворена штамами Bacillus, розпушується і зливається з преципітуючою сироваткою.

3.5.6. Як контроль, при постановці реакції диск преципітації можна використовувати посіви з вакциною СТІ.