Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідеміологічного благополуччя населення", з метою науково-методичного забезпечення державного санітарно-епідеміологічного нагляду

1. Затвердити методичні вказівки "Санітарно-вірусологічний контроль водних об'єктів" (додаються).

2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду (Пономаренко А.М.) ці методичні вказівки довести до відома керівників установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби, міністерств, інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку.

3. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Пономаренка А.М.

1.1. Методичні вказівки "Санітарно-вірусологічний контроль водних об'єктів" (далі - методичні вказівки) встановлюють єдині вимоги щодо організації відбору проб та виконання санітарно-вірусологічних досліджень води різного виду водокористування і ступеня забруднення по відношенню до її епідемічної безпеки за санітарно-вірусологічними показниками, у т.ч. питної води за показниками Державних санітарних правил і норм "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання", затверджених наказом МОЗ України від 23.12.96 N 383, зареєстрованим в Мін'юсті України 15.04.97 за N 136/1940.

1.2. Методичні вказівки призначені для використання при здійсненні контролю якості води (питної, господарсько-побутового призначення, відкритих водойм, стічної, води для зрошення сільськогосподарських угідь тощо) за вірусологічними показниками під час проведення державного санітарно-епідеміологічного нагляду та можуть бути використані для проведення відомчого та всіх інших видів контролю, незалежно від підпорядкованості і форм власності лабораторій.

У цих методичних вказівках застосовуються такі умовні скорочення:

АГ - антиген

АТ - антитіло

БТО - бляшкоутвірних одиниць

ВТС - вірусне транспортне середовище

ВГА та ВГЕ - вірус гепатиту А та вірус гепатиту Е

ГГМКК - гідрогель метилкремнієвої кислоти

ДНК - дезоксирибонуклеїнова кислота

ЕМ - електронна мікроскопія

ЕД - еритроцитарний діагностикум

ЕФ - електрофорез

ІЕМ - імунна електронна мікроскопія

ІАР - імунна асцитна рідина

ІФА - імуноферментний аналіз

ІХА - імунохроматографічний аналіз

НВЧ - найбільш вірогідне число

НК - негативний контроль

НКЗ - негативний контрольний зразок

НПЕВ - неполіомієлітні ентеровіруси

НЦМ - нітроцелюльозна мембрана

МФА - метод флуоресціюючих антитіл

ПААГ - поліакриламідний гель

ПЕГ - поліетиленгліколь

ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція

ПК - позитивний контроль

ПКЗ - позитивний контрольний зразок

РВ - ротавірус

РЛА - реакція латексаглютинації

РН - реакція нейтралізації

РНГА - реакція непрямої гемаглютинації

РНК - рибонуклеїнова кислота

РотаАГ - ротавірусні антигени

РВІ - ротавірусна інфекція

ФП - фільтр Петрянова

ЦПД - цитопатична дія

Основними об'єктами санітарно-вірусологічного дослідження є:

- стічні води;

- стічні води на етапах очистки та знезаражування;

- вода відкритих водойм, що використовуються як джерела водопостачання;

- водопровідна вода;

- вода підземних джерел;

- питна вода у розвідній водопровідній мережі;

- вода питна доочищена;

- вода питна бутильована;

- вода морських і прісних водойм, що використовуються для рекреаційних потреб;

- вода плавальних басейнів та аквапарків.

Санітарно-вірусологічне дослідження водних об'єктів здійснюється під час проведення запобіжного та поточного державного санітарно-епідеміологічного нагляду, а також за епідемічними показаннями.

Санітарно-вірусологічне дослідження води складається з етапів:

- відбір проб для дослідження;

- підготовка проб для дослідження (первинна обробка матеріалу);

- концентрація вірусів у пробах води;

- деконтамінація вірусного концентрату;

- вірусологічне дослідження (виділення вірусу або виявлення його антигенів та фрагменту геному).

Відбір проб води здійснюють, дотримуючись загальних вимог, що забезпечують збереження вірусів у пробі та не допускають забруднення вторинною мікрофлорою. Проби відбирає проінструктований працівник лабораторії, який працює в медичному халаті (спецодязі) та латексних або гумових рукавичках. Після відбору проб рукавички обробляють 70% етиловим спиртом, по завершенню роботи - халати та рукавички підлягають стерилізації.

Одержаний матеріал маркують, заповнюють направлення на дослідження, зазначаючи місце (населений пункт), точку відбору, назву проби та дату (число, місяць, рік). Термін доставки матеріалу в лабораторію повинен не перевищувати 6 годин з моменту його відбору. Проби води доставляють у лабораторію, дотримуючись правил холодового ланцюга (з холодовими елементами в сумках - холодильниках, пластикових коробках тощо). Доставлений матеріал обробляють у лабораторії в перші години з моменту його надходження. Якщо не можливо провести дослідження в цей день, можна зберігати доставлені проби при температурі +4 +- 0,1 град. С впродовж доби. Кожну пробу обов'язково реєструють в робочому журналі.

3.1. Стічні води

Місцями відбору проб стічних вод є оглядові колодязі, відкриті частини колектора, а також очисні споруди до і після очистки. За умови поточного санітарного нагляду (систематичного вірусологічного контролю) за стічними водами проби відбирають 1-2 рази на місяць, у разі зміни епідемічної ситуації кратність взяття проб визначає епідеміолог.

Відбір проб стічної води здійснюють різними методами. Існують два принципово відмінних між собою способи відбору проб води. Перший спосіб можна визначити як "захват" (grab), а другий - як "засідка" чи "ловушка" (trap). При першому способі відбір проб води здійснюється одномоментно в певний проміжок часу у стерильний посуд. Проби у другий спосіб відбираються з попередньою адсорбцією вірусів безпосередньо у воді досліджуваного об'єкту. Такий спосіб відбору проб ще має назву адсорбційного і здійснюється за допомогою марлевих тампонів за Moore та пакетиків, що заповнені адсорбуючим матеріалом (з іонообмінними смолами, макропористим склом, активованим вугіллям, бентонітом тощо).

Вибір методу відбору залежить від можливостей вірусологічної лабораторії, умов транспортування та від того, наскільки цей метод є зручним для співробітників лабораторії в подальшій роботі.

Важливо враховувати доступність та необхідну стандартизацію адсорбенту!

Відбір проб за допомогою марлевих тампонів

Проби стічної води можна відбирати за допомогою марлевих тампонів за Moore: нарізають марлю на серветки, розміром 10 х 10 см, кладуть їх одну на одну пошарово в 48 шарів, пронизують через них капронову шворку або нитку і міцно фіксують усі шари марлі, запаковують тампон у папір, стерилізують, лишаючи кінець шворки в 1,5 м ззовні. У місці відбору проб фіксують вільний кінець шворки на дроті, що закріплений над колектором, знімають обгортку і занурюють тампон на 1-2 доби в потік стічних вод. Після експозиції тампони витягують, переносять в стерильний поліетиленовий мішечок чи в стерильну скляну банку та щільно (герметично) закривають.

Недоліком відбору проб за допомогою марлевих тампонів є неможливість забезпечити необхідну стандартизацію адсорбенту.

Проте метод надзвичайно простий, доступний та економічний.

Відбір проб стічних вод в посуд

Відбір проб води способом "захват" одномоментно є більш перспективним і надійним способом, регламентованим ВООЗ в рекомендаціях щодо нагляду за поліовірусом в об'єктах довкілля.

Пробу із загального потоку стічних вод можна відбирати вручну за допомогою спеціального пристрою (батометру) у стерильний скляний посуд об'ємом 1,0 л (наприклад, дуже зручно відбирати у стерильні скляні пляшки об'ємом 500 мл з-під поживних середовищ для культури клітин) або матраци для культури клітин, об'ємом 1,0-1,5 л, які заповнюють на дві третини.

Сучасні очисні споруди оснащені автоматичними пристроями для відбору проб води у скляний посуд з чітко фіксованим інтервалом часу впродовж доби. З отриманих у такий спосіб проб надалі слід готувати змішану пробу і використовувати її для дослідження.

Стерильний скляний посуд слід відкривати безпосередньо перед відбором проби води. Споласкувати посуд або торкатись будь-яких предметів пробкою або краями посуду забороняється!

3.2. Вода поверхневих та підземних водойм (моря, водосховища, штучні та природні водойми, озера, річки, артезіанські свердловини, криниці)

Дослідження води поверхневих та підземних водойм проводять переважно при виборі джерела для централізованого господарсько-питного водопостачання або для оцінки санітарного стану місць відпочинку (наприклад, пляжів) за епідеміологічними показниками.

При виборі поверхневих водойм як джерела централізованого водопостачання місця для відбору проб води намічають відповідно до ГОСТу 2761-84 "Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения".

При виборі підземних джерел водопостачання місця відбору проб намічають у відповідності з параграфом 3 того ж самого ГОСТу. Проби беруть 1-2 рази на місяць або за схемами, що розробляє санепідслужба з урахуванням санітарно-гігієнічної та епідемічної ситуації.

Відбір проб безпосередньо з берега річки або озера не бажаний.

Воду з відкритих водойм, криниць, калтажів тощо забирають вручну за допомогою батометра у стерильний посуд об'ємом 3 л. При відборі проб води поверхневих водойм використовують плавучі засоби, мости або помости. Проби відбирають з глибини 10-15 см від поверхні води, придонні проби - на рівні 30-50 см від дна. Об'єм однієї проби - 3 л.

Проби води підземних джерел (у тому числі артезіанських свердловин) відбирають після тривалого відкачування води до встановлення постійного динамічного рівня у стерильний посуд об'ємом 10 л. Це, як правило, відносно чиста вода, її використовують для водозбірних колонок та водопроводів, тобто це питна вода. Посуд наповнюють водою та щільно закривають стерильною гумовою пробкою або кришечкою.

3.3. Питна вода

Проби води централізованого водопроводу беруть для дослідження в розвідній водопровідній мережі відповідно вимогам Державних санітарних правил і норм "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання", затверджених наказом МОЗ України від 23.12.96 N 383.

Питну воду відбирають безпосередньо в стерильний посуд без застосування гумових (латексних) шлангів, водорозподільчих сіток або насадок. Перед відбором проб кран кінцевої ділянки периферійної водопостачальної мережі (або відвідний кран на етапі обробки води на водозабірних спорудах) тричі фламбують запаленим спиртовим факелом і спускають воду впродовж 10-15 хв. при повністю відкритому крані.

Якщо через відповідний кран вода тече постійно, то відбір проб води проводиться без фламбування запаленим спиртовим факелом, без змін напору води або у самій конструкції крану.

Об'єм однієї проби - 10 л.

Для нейтралізації залишків хлору в посуд для відбору проб перед стерилізацією додають гіпосульфіт натрію з розрахунку 20 мг на 1 л води!

4.1. Обробка проб стічних вод

Проби стічної води, відібрані за допомогою марлевих тампонів за Moore, обробляють за методом Ріордана. Для цього в поліетиленовий мішечок з тампоном додають 10 мл розчину Хенкса (рН 7,4), перемішують, декілька разів стискаючи мішечок ззовні, через 1-2 хв. тампон віджимають та викидають.

У віджатій рідині вимірюють рН та доводять до значень 8,0-8,4, використовуючи 1 М розчин NaOH або 1 М розчин HCl. Про значення рН судять за зміною кольору індикаторної смужки. Із загальної кількості віджатої рідини відбирають тільки 100 мл в стерильну широкогорлу центрифужну склянку та центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв.

У стерильну центрифужну склянку переносять 20,0-50,0 мл надосаду, заморожують і зберігають при температурі -20 град. С впродовж однієї доби.

Через добу надосад розморожують при +20 град. С і повторно центрифугують у тому самому режимі. Після центрифугування відбирають надосад у стерильний скляний посуд. Маркують. Зразок готовий для подальшого дослідження.

Проби стічної води, відібрані в стерильний скляний посуд, поміщають у холодильник або у холодну кімнату при температурі +4 град. С. Стічній воді дають відстоятися впродовж 30 хв. у доставленому посуді, потім верхній шар стічної рідини в об'ємі 1,0 л відливають і маркують. Зразок готовий для подальшого дослідження.

Якщо відібрані проби стічної води дуже сильно забруднені твердими відходами, фекаліями або каламутні і мають майже чорний колір, то для прискорення осідання цих домішок проби попередньо центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. або фільтрують через простерилізований фільтр, виготовлений з фільтрувального паперу або вати. Надосад або освітлений фільтрат відбирають в об'ємі 1 л та використовують для подальшого дослідження.

Доцільно половину проби стічної води використати для концентрування в ній вірусу, а другу половину зберігати як резерв при температурі +4 град. С до успішного завершення етапів концентрування та індикації вірусу.

4.2. Обробка води поверхневих та підземних водойм

Проби води, відібрані в стерильний посуд і доставлені в лабораторію, поміщають у холодильник або у холодну кімнату при температурі +4 град. С, дають відстоятися впродовж 30 хв. у доставленому посуді, а потім верхній шар води в об'ємі 2,0 л відливають і використовують для подальшого дослідження.

4.3. Обробка питної води

Проби питної води в об'ємі 10 л, відібрані в стерильний посуд і доставлені в лабораторію, поміщають у холодильник або холодну кімнату при температурі +4 град. С, дають відстоятися впродовж 30 хв. у доставленому посуді, а потім вдаються до дехлорування (див. Розділ 3.3).

Проби води, звільнені від хлору, використовують для подальшого дослідження.

Методи, що застосовують для концентрації вірусів у пробах води, повинні відповідати таким вимогам: можливість концентрувати малу або навіть незначну кількість патогенних для людини вірусів, наявних у великих об'ємах води; забезпечувати відокремлення вірусів від бактерій та інших контамінантів; сконцентрований вірусний матеріал має зберігати життєздатність для подальшого вірусологічного дослідження.

Методи концентрації вірусів з води можна умовно поділити на групи:

- фізичні (ультрацентрифугування, фільтрація, ультрафільтрація, пінна флотація, електрофорез та електроосмос);

- фізико-хімічні (осадження за допомогою сульфату амонія, сульфату алюмінія, концентрація поліетиленгліколем, двохфазний метод із застосуванням ПЕГ 6000 та декстрану Т40 Amersham-Pharmacia та ін.);

- адсорбційні (адсорбція на марлевих тампонах, активованому вугіллі, природних мінеральних сорбентах - бентоніті, асканіті та ін., на іоно-обмінних смолах, аміноетоксиаеросилі, поліметилксилоксані, макро-пористому склі, двохфазний метод та ін.).

Вибір методу концентрації вірусів у пробах води залежить від багатьох чинників: ступеня забруднення води, чутливості методики, доступності стандартизованого адсорбенту, наявності відповідного обладнання (наприклад, ультрацентрифуг з охолодженням або спеціального обладнання для ультрафільтрації) та навантаження на лабораторію.

Санітарно-вірусологічний моніторинг за забрудненням води (стічної, поверхневих та підземних водойм, питної), як правило, в практичних лабораторіях проводиться за кількома показниками (ентеровіруси, ротавіруси, аденовіруси, віруси гепатиту А, коліфаги), тому доцільно використовувати такий спосіб концентрації і використовувати єдиний реактив для концентрації, який би дозволяв визначати декілька показників вірусів одномоментно.

Усі роботи, пов'язані з концентрацією та виділенням вірусів, здійснюються за умови дотримання правил безпеки (при роботі зі збудниками III-IV групи патогенності) у повній відповідності до регламентуючих документів (див. Список використаних джерел).

5.1. Концентрація вірусів методом фільтрації через фільтр з матеріалу Петрянова

Фільтр з матеріалу Петрянова (далі ФП) фіксують у будь-якому утримувачі фільтру, прикладаючи до решітки тою чи іншою його стороною, оскільки обидві поверхні фільтру ідентичні. Діаметр ФП може дорівнювати 3-14 см.

Досліджувану пробу води, що попередньо пройшла обробку (див. Розділ 4), пропускають під тиском через фільтрувальну установку або спеціальну насадку з утримувачем фільтру. Після проходження всієї досліджуваної проби води через фільтр та адсорбції на ньому вірусів його видаляють стерильним пінцетом із утримувача і вміщують у стерильну чашку Петрі.

Для елюції вірусу з поверхні фільтру на нього наносять 1 М розчин NaCl (елюент) з розрахунку 2,0 мл на 10 кв.см поверхні фільтра, тобто 2 мл рідини на фільтр діаметром 3 см. Фільтр промивають, піпетуючи рідину впродовж 2-3 хв., а далі рідину зливають у флакон і отримують елюат I. Процедуру елюції вірусів з фільтру повторюють, елюати I і II об'єднують.

Недоліком методу є швидке засмічення пор фільтру та неповна десорбція вірусу з його поверхні.

5.2. Концентрація вірусів методом осадження за допомогою алюмінія сульфату

Досліджувану пробу (рН 5,4-5,8) із внесеним в неї розчином алюмінія сульфату витримують при температурі +18-20 град. С впродовж 4 годин, або при температурі +4 град. С - впродовж 18 годин. Прозорий надосад обережно зливають та викидають, а білий аморфний осад, що містить у собі віруси, переносять у центрифужну склянку або пробірку і центрифугують при 2000 об./хв. впродовж 10-15 хв. Надосад знову видаляють, а осад, що став більш щільним, суспендують у 4,0 мл розчину Хенкса (рН 7,4) для елюції вірусів і знову центрифугують за вказаних вище умов. Для подальшого дослідження відбирають вже надосад (елюат), в якому міститься сконцентровані віруси, а осад алюмінія сульфату, звільнений від вірусу, викидають.

В якості елюентів, окрім розчину Хенксу (рН 7,4), можна використовувати 0,5 М фосфатний буфер (рН 8,2) та ін.

Проби води, оброблені солями алюмінію, зберігають тільки при температурі +4 град., ні в якому разі не заморожуючи їх.

5.3. Концентрація вірусів за допомогою гідрогелю метилкремнієвої кислоти

Дослідження починають з підготовки гідрогелю метилкремнієвої кислоти (далі ГГМКК), що випускається вітчизняним виробником ЗАТ "Екологоохоронна фірма "КРЕОМА-ФАРМ", м. Київ, N Р/П Р.11.02/05576.

В основі методу лежить принцип фізичної адсорбції кремнійорганічною матрицею ПМС рота-, ентеро-, кишкових аденовірусів людини, ВГА з проб води. Пориста структура ГГМКК характеризується стабільним складом, питомою сорбційною поверхнею 100-150 кв.м/г, сумарним об'ємом пор 2,7-3,0 см/г, радіусом пор понад 100 нм, високою ефективністю адсорбції ротавірусів (70-75 нм), ентеровірусів (28-30 нм), ВГА (27-30 нм), аденовірусів 40 та 41 типів (80-90 нм). Використовують дрібнодисперсну форму ГГМКК.

ГГМКК попередньо розфасовують по 1 г та по 20 г для зручності використання.

ГГМКК у пробу води додають з розрахунку 1,0 г на 0,5 л.

Концентрація вірусів у пробах стічної води: досліджувані проби води доводять до температури 20 +- 1 град. С, рН води від'юстовують до значення 5,0, додаючи краплинами 1 М розчин HCl.

До 0,5 л освітленої та підкисленої проби стічної води додають 1,0 г Ентеросгелю, ретельно та енергійно струшують вручну (4-5 хв.) або струшують автоматично впродовж 10-20 хв.

Проби води із внесеним Ентеросгелем розливають у стерильні центрифужні склянки або скляні флакони (зручно використовувати флакони з-під поживних середовищ для культури клітин або з-під трипсину для культур клітин об'ємом 250 мл чи 500 мл) та центрифугують при 1000 об./хв. впродовж 10-20 хв. або відстоюють 14-16 годин. Білий осад, який утворився, є дуже легким, не щільним, тому надосадову рідину обережно зливають через край, залишаючи на дні склянки або флакону не тільки осад, а ще й надосад (загальний об'єм 20 мл). Цей залишок струшують і переносять в дві центрифужні пробірки та повторно центрифугують за вказаних вище умов. Після повторного центрифугування осад щільно формується на дні пробірки, а надосад легко видаляють пастерівською піпеткою або дозатором і в роботі більше не використовують.

До отриманого осаду, що являє собою осаджений комплекс "вірус-ГГМКК", у кожну центрифужну пробірку додають 2,0 мл 0,05 М трис-буферу з рН 8,4 для елюції вірусу з часточок ГГМКК, легко струшують вручну та залишають при кімнатній температурі на 4-5 хв. Потім центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Відбирають у стерильні пробірки надосад (елюат), що є концентратом вірусів (загальний об'єм 4 мл), і використовують для подальшого дослідження.

В якості елюентів, окрім 0,05 М трис-буферу з рН 8,4, можна використовувати 0,05 М фосфатний буфер, рН 8,4.

Процес концентрації вірусів з проб займає загалом не більше 1,5-2,0 годин.

Схема концентрації вірусів ГГМКК у пробах стічної води надана у табл. 6.1.

Концентрація вірусів у пробах води поверхневих (відкритих) або підземних водойм: досліджувані проби води доводять до температури 20 +- 1 град. С, рН води від'юстовують до значення 5,0, додаючи краплинами 1 М розчин HCl.

До 1 л досліджуваної проби додають 2,0 г ГГМКК. При роботі з 2 л води відповідно вносять 4,0 г ГГМКК.

Проби води із внесеним ГГМКК розливають у стерильні центрифужні склянки або скляні флакони на 500 мл та центрифугують при 1000 об./хв. впродовж 10-20 хв. Білий осад, який утворився, є дуже легким, не щільним, тому надосадову рідину обережно зливають через край, залишаючи на дні склянки або флакону осад. Загальний об'єм осаду має не перевищувати 20 мл! Осад струшують і переносять в дві центрифужні пробірки та повторно центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Після повторного центрифугування осад щільно формується на дні пробірки, а надосад легко видаляють і в роботі більше не використовують.

До отриманого осаду, що являє собою комплекс "вірус-ГГМКК", в кожну центрифужну пробірку додають 2,0 мл 0,05 М трис-буферу з рН 8,4 для елюції вірусу з часточок Ентеросгелю, легко струшують вручну та залишають при кімнатній температурі на 4-5 хв. Потім центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Відбирають у стерильні пробірки надосад (елюат), що є концентратом вірусів (4 мл), і використовують для подальшого дослідження.

Схема концентрації вірусів Ентеросгелем у пробах води поверхневих (відкритих) або підземних водойм надана у табл. 6.2.

Концентрація вірусів у пробах питної води: проби води попередньо звільняють від хлору, доводять до температури 20 +- 1 град. С, рН води і доводять до значення 5,0, додаючи краплинами 1 М розчин HCl.

До проби водопровідної води/питної води об'ємом 10-20 л додають відповідно 20-40 г ГГМКК, який вносять безпосередньо у скляний посуд.

Не застосовуйте ГГМКК, якщо проба води знаходиться у металевому бідоні! Це утруднює відокремлення його від надосаду!

Для ефективної адсорбції вірусів Ентеросгелем, пробу струшують вручну або автоматично. Утворений комплекс "вірус-ГГМКК" осаджують шляхом відстоювання при температурі +4 град. С впродовж 14-18 годин. Так, наприклад, якщо проби води доставлені до лабораторії у другій половині або наприкінці робочого дня, то після вказаної вище підготовки та обробки ГГМКК вони можуть бути залишені для седиментації осаду до ранку при кімнатній температурі 20 +- 1 град. С. Далі надосад обережно зливають через край, залишаючи на дні скляного посуду 200 мл нещільного білого осаду. Цей залишок (осад + невелика кількість надосаду) струшують і переносять у центрифужні стакани або флакони на 250 мл та центрифугують при 1000 об./хв. впродовж 10-20 хв. Білий осад, який утворився після центрифугування, є ще також ще не досить щільним, тому надосадову рідину обережно зливають через край, залишаючи на дні флакону близько 20 мл. Цей залишок струшують і переносять в дві центрифужні пробірки та повторно центрифугують за тим самим режимом. Після повторного центрифугування осад щільно формується на дні пробірок, а надосад легко видаляють пастерівською піпеткою або дозатором і в роботі більше не використовують.

До отриманого осаду, що являє собою осаджений комплекс "вірус-ГГМКК", в кожну центрифужну пробірку додають по 2,0 мл 0,05 М трис-буферу з рН 8,4 для елюції вірусу з часточок ГГММКК, легко струшують вручну та залишають при кімнатній температурі на 4-5 хв. Потім центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Відбирають у стерильні пробірки надосад (елюат), що є концентратом вірусів (4 мл), і використовують для подальшого дослідження.

Схема концентрації вірусів ГГМКК у пробах питної води надана у табл. 6.3.

5.4. Концентрація вірусів за допомогою бентоніту

Метод широко застосовувався в Україні для дослідження води на ентеровіруси. Концентрація ентеровірусів за допомогою бентоніту детально описана в методичних рекомендаціях "Применение бентонита для выявления энтеровирусов у человека и во внешней среде", Київ, 1986.

Принцип методу концентрації полягає в адсорбції бентонітом ентеровірусів у кислому середовищі (рН 4,0-5,0) з подальшою елюцією вірусів трис-буфером з лужним значенням рН (8,5-9,5)

Елюції ентеровірусів з бентоніту перешкоджають в лужному середовищі катіони. Тому комплекс "бентоніт-вірус" попередньо відмивають (знесолюють) дистильованою водою в кислому середовищі, а потім процес елюції здійснюють у невеликому об'ємі в лужному середовищі.

Схема концентрації вірусів з проб води бентонітом представлена у табл. 6.4.

Метод характеризується високою ефективністю, його можна застосовувати для концентрації вірусів з води будь-якого ступеня забрудненості. До недоліків методу відноситься відсутність стандартизованого препарату 5% геля бентоніту.

5.5. Деконтамінація вірусного концентрату

Щоб видалити з вірусних концентратів супровідну мікрофлору (деконтамінувати), матеріал обробляють етиловим ефіром, хлороформом або антибіотиками. Деконтамінацію проводять у випадку, коли вірусний концентрат вносять на культуру клітин з метою виділення та ідентифікації виділеного агенту.

У разі обробки етиловим ефіром його додають до концентрату (проби) у співвідношенні 1 : 1, ретельно перемішують, герметично закривають гумовими пробками і залишають при температурі +4 град. С на 18-24 годин. Утворюються два шари рідини з кільцем жирової субстанції. Піпеткою відбирають водну фазу з дна флакону або пробірки у стерильні чашки Петрі або флакони з ватно-марлевими пробками, залишають у витяжній шафі до повного випаровування ефіру.

За умови обробки антибіотиками до вірусного концентрату додають 200-1000 Од/мл пеніциліну і 200-500 мкг/мл стрептоміцину, після чого витримують при кімнатній температурі 1-2 години. Для досягнення максимального ефекту обидва способи можна поєднувати.

6.1. Стічні води

Дослідження стічної води на наявність патогенних для людини вірусів здійснюють, дотримуючись всіх етапів санітарно-вірусологічного дослідження: відбір проб води, підготовка проб (освітлення та попередня очистка води), концентрація вірусів у пробах; вірусологічне дослідження. Проби відбирають в об'ємі 0,5-1,0 л. Підготовка проб до дослідження, а саме освітлення та попередня очистка води проводиться з урахуванням методу забору проб води (див. Розділ 4).

Для концентрації вірусів у пробах стічної води доцільно застосовувати:

1) метод фільтрації крізь фільтри Петрянова (ФП),

2) метод марлевих тампонів за Moore,

3) адсорбційний бентонітовий метод,

4) метод адсорбції на аеросилі,

5) метод адсорбції на ГГМКК.

Кожний з цих методів має свої позитивні сторони та недоліки. Наприклад, простий та доступний метод марлевих тампонів використовують як для первинного виділення вірусів з потоку стічних вод (метод пасток), так і для первинної концентрації вірусів з доставленої в лабораторію води. Проте цей метод поряд з його технічною простотою та доступністю має меншу ефективність та обмеженість через неможливість стандартизації адсорбенту.

Недоліком методу фільтрації крізь ФП є швидке засмічення пор фільтру та неповна десорбція вірусу з його поверхні. Найбільший досвід в Україні надбано при застосуванні адсорбційних методів концентрації вірусів з проб води. Найкраще зарекомендував себе адсорбційний метод із застосуванням природного сорбенту бентоніту.

Зважаючи на нові вимоги щодо стандартизації адсорбенту, на кафедрі вірусології НМАПО імені П.Л. Шупика розроблено новий метод концентрації вірусів із застосуванням стандартизованого препарату ГГМКК. До позитивних аспектів застосування "ГГМКК" можна віднести ефективність концентрації вірусів (у 50-100 разів), вітчизняне виробництво, доступність, можливість придбання у широкій аптечній мережі будь-якого міста України та низьку собівартість дослідження.

Для концентрації вірусів у пробах стічної води можуть бути використані ще інші методи. Так, наприклад, для виявлення поліовірусів рекомендації ВООЗ ("Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде") дають принципову характеристику двом методам:

1) методу двохфазного розділення із застосуванням двох полімерів - декстрану Т40 та ПЕГ 6000;

2) методу адсорбції на макропористому склі.

Алгоритм дослідження стічних вод представлено на рис. 7.1.

Рис. 7.1. Алгоритм санітарно-вірусологічного дослідження стічної води

6.2. Вода поверхневих та підземних водойм

Дослідження води відкритих (поверхневих) та підземних водойм на наявність патогенних для людини вірусів здійснюють, дотримуючись всіх етапів санітарно-вірусологічного дослідження. Проби відбирають в об'ємі 3,0 л. Оскільки проби води відбирають у скляний посуд, то на етапі підготовки до дослідження, воді дають просто відстоятися при температурі +4 град. С впродовж 30 хв., а потім поверхневий шар води в об'ємі 2,0 л відбирають для подальшої обробки - концентрації вірусів (див. Розділ 5).

Для концентрації вірусів у пробах води відкритих (поверхневих) та підземних водойм доцільно застосовувати:

1) метод фільтрації крізь фільтри Петрянова (ФП),

2) адсорбційний бентонітовий метод,

3) метод адсорбції на ГГМКК,

4) метод осадження сульфатом алюмінію.

Алгоритм дослідження води відкритих (поверхневих) та підземних водойм представлено на рис. 7.2.

Рис. 7.2. Алгоритм санітарно-вірусологічного дослідження проб води поверхневих і підземних водойм

6.3. Питна вода

Дослідження питної води (центрального водопостачання та інших видів) проводять у великих об'ємах - 10 л. У цьому випадку завдання ускладнюється тим, що віруси можуть знаходитись у питній воді значного об'єму у дуже малій кількості. Тому при виборі методу концентрування вірусів з проб питної води важливо враховувати метод забору проб води (через шланги, або безпосередньо у бутилі чи в бідони, чи в інший спосіб), умови транспортування, зручність методу при роботі з великими об'ємами. При дослідженні водопровідної питної води обов'язковим є введення етапу дехлорування натрієм гіпосульфіту з розрахунку 20 мг на 1 л води, або можна застосовувати 15% стерильний розчин тіосульфату натрію із розрахунку 2 мл на кожний 1 л води.

Для концентрації вірусів у пробах питної води доцільно застосовувати:

1) метод адсорбції за допомогою іонообмінних смол АВ-17-8, АВ-17-6, АВ-17НК;

2) адсорбційний аеросіл;

3) осадження ПЕГ 6000;

4) метод адсорбції на ГГМКК;

5) ультрафільтрація.

Алгоритм дослідження питної води представлено на рис. 7.3.

Рис. 7.3. Алгоритм санітарно-вірусологічного дослідження питної води

При концентрації вірусів за допомогою бентоніту чи ГГМКК до проб водопровідної/питної води об'ємом 10-20 л відповідно вносять 2,5-5 мл 5% гелю бентоніту чи 20-40 г ГГМКК.

Не застосовуйте ГГМКК, якщо проба води знаходиться у металевому бідоні! Це утруднює відокремлення його від надосаду!

7.1. Дослідження проб води на наявність ротавірусів

Ротавіруси (РВ) людини у пробах води виявляють після етапу концентрації, застосовуючи методи індикації вірусних антигенів або геномної РНК за допомогою готових наборів/тест-систем. У деяких випадках визначення геномної РНК РВ можливе без попереднього етапу концентрації безпосередньо у відібраних пробах.

Найбільш доступними для практичної вірусологічної лабораторії методами виявлення РВ є ІФА, РНГА та ІХА. Інші методи виявлення РВ - електронна мікроскопія, полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією - зазвичай більш складні у виконанні, вимагають значних фінансових ресурсів (для придбання високовартісного обладнання, тест-систем, реактивів, підготовки приміщення тощо) та відповідної підготовки персоналу лабораторій.

7.1.1. Імуноферментний аналіз

Імуноферментний аналіз (далі ІФА) - високочутливий та специфічний метод, відносно простий у виконанні, дозволяє досліджувати одночасно велику кількість зразків, використовуючи повністю або частково автоматизовані системи: рідер, вошер, термостат тощо. Тривалість дослідження - 4 години. Результат оцінюється якісно як "позитивний" або "негативний".

Особливості підготовки проб води та концентратів (елюатів) для дослідження методом ІФА. Доцільно застосовувати ІФА після проведення етапу концентрації РВ з проб води і в якості зразків вносити на плашку елюат (концентрат РВ), попередньо відновивши рН до нейтральних значень.

Деконтамінацію елюатів ефіром або антибіотиками перед постановкою ІФА не проводити!

Тест-системи для виявлення РВ наведені в табл. 8.1.

Примітка. У таблиці наведені не всі існуючі тест-системи, а тільки найбільш відомі і доступні. Тест-системи не зареєстровані в Україні і ввозяться за разовим дозволом. При застосуванні слід точно дотримуватися інструкції виробника.

7.1.2. Імунохроматографічний аналіз

Доцільним і своєчасним є впровадження в практику роботи вірусологічних лабораторій простих у виконанні, дешевих, чутливих та специфічних тестів, що сконструйовані за принципом імунохроматографічного аналізу (ІХА).

ІХА-тести для виявлення РВ - швидкі, безпечні та зручні у застосуванні. Їх випускають багато фірм-виробників, їх рекомендує до впровадження ВООЗ, "Cito test Rota", виробництва CerTest Biotec. S.L. Іспанія (ТОВ "Фармаско"), та тести "RotaStick", виробництва Novamed Ltd, Ізраїль (ТОВ "Дніпроінвест") зареєстровані в України. Відносна чутливість більшості швидких ІХА-тестів дорівнює 99%, відносна специфічність - близько 98%.

Механізм тестування полягає у наступному: під час тестування зразок наносять на мембрану тесту або сам тест занурюють у досліджуваний зразок. Якщо в досліджуваному матеріалі-елюаті є РВ, то відбувається специфічна імунологічна реакція між РВ і комплексом, який заздалегідь нанесений та висушений на мембрані тесту (антиротавірусні моноклональні антитіла + червоні мікросфери колоїдного золота). Утворений новий комплекс (вірус + моноклональні антитіла + червоні мікросфери колоїдного золота), мігрує вздовж мембрани під дією капілярної сили. У випадку позитивного результату, специфічні поліклональні антитіла, які присутні на мембрані в зоні "Т", будуть захоплювати забарвлене сполучення та утворювати червону смугу в зоні "Т". Просуваючись далі вздовж мембрани до зони "К" (контрольної ділянки тесту) рідина, що вже звільнилась від специфічного імунного комплексу, проявляє лінію зеленого кольору. Наявність зеленої смуги слугує внутрішнім контролем тесту і підтвердженням достатньої кількості використаного зразку, повноти заповнення капілярів мембрани та відповідної якості реагентів. В разі позитивного результату з'являються дві смуги: чітка червона лінія на білій центральній зоні "Т" та чітка зеленої смуга в контрольній зоні.

Особливості підготовки проб води та концентратів (елюатів) для дослідження методом ІХА. Тест проводять відразу після етапу концентації ротавірусів у пробі води. Деконтамінацію елюатів ефіром або антибіотиками перед постановкою ІХА не проводити!

Перед проведенням дослідження значення рН зразків (концентратів) від'юстувати до нейтральних.

Проведення дослідження. Розпакувати тест при кімнатній температурі. Пристроєм, що додається до тесту, або дозатором внести 5 крапель (125 мкл) отриманого концентрату (елюату) у зону Т (тестова зона). Тест залишити на при кімнатній температурі на 5-10 хв. відповідно до інструкції. Облік результатів проводять через 5-10 хв. візуально.

7.1.3. Електронна мікроскопія

Методи електронної мікроскопії є "золотим стандартом" в діагностиці РВІ і дозволяють швидко та надійно ідентифікувати ротавіруси за характерною морфологією, тобто як такі, що нагадують своїм виглядом колесо дитячої машинки (така морфологія вірусу віддзеркалена у назві від лат. Rota - колесо) і мають розміри 70-75 нм. Проте такі дослідження в Україні можливі лише у спеціалізованих лабораторіях, що оснащені електронними мікроскопами.

Деконтамінацію елюатів ефіром або антибіотиками перед дослідженням методами електронної мікроскопії не проводити! Не заморожувати і не розморожувати матеріал!

Проведення дослідження. На опірну сітку, покриту вуглеводно-формваровою плівкою-підкладкою, наносять краплю елюату і залишають на 5-10 хв. За цей час вірус адсорбується на гідрофільній поверхні плівки-підкладки. Надлишок рідини видаляють смужкою фільтрувального паперу, торкаючись краю предметної сітки. Після цього на сітку наносять краплину контрастуючої рідини. Через 30-40 с надлишок вологи видаляють за допомогою фільтрувальної смужки. В якості контрастуючих речовин використовують водні розчини 3% молібдату амонію (рН 7,0), 3% фосфорно-вольфрамову кислоту (рН 6,5-6,8), 1% уранілформіату.

Підсушену сітку досліджують під електронним мікроскопом, наприклад ЕМ-125К, вакуумний універсальний пост ВУП-5 виробництва Україна, м. Суми при інструментальному збільшенні 30-60 тис., продивляючись 40-50 секторів сітки. Належність виявлених часток до ротавірусів визначають за розміром та характерною морфологією.

7.1.4. Реакція непрямої гемаглютинації

Принцип РНГА полягає в тому, що попередньо оброблені формаліном або таніном еритроцити (найчастіше барана), на поверхні яких сорбовані специфічні антитіла (сенсибілізовані еритроцити), у присутності гомологічного антигену утворюють агрегати, що проявляється феноменом аглютинації. Метод високочутливий (виявляє 1-2 нг білку) і специфічний (більше 93%). Метод досить простий у виконанні, не потребує складного обладнання та апаратури і може бути виконаний у будь-якій вірусологічній лабораторії!

До складу тест-систем для РНГА входять, як правило, три компоненти: 1) еритроцитарний діагностикум (ЕД) рідкий, що являє собою 1% суспензію еритроцитів барана, сенсибілізованих імуноглобуліновою фракцією асцитної рідини білих щурів, імунізованих ротавірусом мавп SA-11; 2) імунна асцитна рідина (ІАР) білих щурів, імунізованих ротавірусом мавп SA-11; 3) антиген ротавірусу мавп SA-11 (АГ).

Особливості підготовки проб води та концентратів (елюатів) для дослідження методом РНГА з ротавірусним діагностикумом "Ротатест", виробництва Ростов-на-Дону: дослідження проводять відразу після етапу концентації ротавірусів у пробі води. Деконтамінацію елюатів ефіром або антибіотиками перед постановкою ІХА не проводити!

Перед проведенням дослідження значення pH зразків (концентратів) ад'юстувати до нейтральних.

Проведення дослідження. Реакцію проводять в мікропланшетах для імунологічних реакцій в об'ємі 75 мкл. В кожну лунку двох рядів мікропланшета вносять по 25 мкл досліджуваного зразку (елюату). По 25 мкл додають в перші лунки вказаних рядів, після чого готують його послідовні дворазові розведення (від 1:2 до 1:256). Далі в лунки першого ряду додають по 25 мкл 0,9% розчину NaCl, а в лунки другого ряду - по 25 мкл ІАР. Планшет струшують та залишають при кімнатній температурі на 20 хв. для утворення комплексу антигену з антитілом в лунках другого ряду. Після цього в усі лунки вносять по 25 мкл ЕД. Планшет знову струшують і залишають на 1,5-2 годин для специфічної взаємодії АГ ротавірусу з ЕД.

Реакція супроводжується такими контролями:

- контроль неспецифічної аглютинації ЕД (в 3 лунки вносять по 50 мкл 0,9% розчину NaCl та додають по 25 мкл ЕД в кожну);

- контроль специфічної взаємодії ЕД та ІАР. Його виконують по вищеописаній методиці РНГА, використовуючи АГ ротавірусу мавп SA-11, який входить до складу тест-системи. Цей контроль проводять після отримання комплекту, а потім - у разі необхідності.

Облік результатів в контролях: в першому контролі спонтанна аглютинація ЕД повинна бути відсутня. В контролі специфічної взаємодії ЕД та ІАР в першому ряду ЕД повинен реагувати з антигеном в розведенні не менш ніж 1:256, а в другому ряду ІАР повинна знижувати титр АГ не менше ніж в 4 рази.

Позитивним вважають результат у випадку повного гальмування аглютинації в другому ряду РНГА не менше ніж на 2 розведення (в 4 рази) в порівнянні з першим рядом.

Постановка контролів є обов'язковою при одержанні нової тест-системи!

7.1.5. Полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією

Проведення дослідження можливе за умов наявності певного набору приміщень, що відповідають "Правилам функціонального устрою та експлуатації приміщень лабораторії молекулярно-генетичних досліджень", згідно до методичних вказівок "Застосування полімеразної ланцюгової реакції для виявлення збудників інфекційних захворювань людини" (МВ 9.9.5.101-203, Київ, 2003), високо вартісного обладнання та діагностичних наборів.

Метод ПЛР зі зворотною транскрипцією (транскриптазно опосередкована ампліфікація) включає етапи:

1) виділення вірусної РНК з досліджуваного матеріалу (проби води, концентрат вірусу, елюат після концентрації),

2) зворотну транскрипцію вірусспецифічної ДНК на матриці вірусної РНК,

3) ампліфікацію послідовностей цієї ДНК та детекцію одержаних ампліфікатів методом електрофорезу у агарозному гелі або ПААГ.

Для проведення дослідження використовують сертифіковані на Україні тест-системи.

Матеріал для дослідження: неконцентровані проби води та концентрат вірусів.

Ефективність виявлення ротавірусів вища після концентрації методом адсорбції на ГГМКК!

Етап 1. Виділення РНК проводиться в кімнаті для обробки матеріалу (Зона 1).

1. Лізуючий розчин і розчин для відмивання 1 (якщо вони зберігалися при 2-8 град. С) прогріти при 60-65 град. С до повного розчинення кристалів.

2. Відібрати необхідну кількість одноразових пробірок на 1,5 мл з кришкою, що щільно закривається (включаючи негативний і позитивний контролі виділення). Внести в кожну пробірку 5 мкл внутрішнього контрольного зразка (ВКО Rotavirus-rec), потім по 450 мкл лізуючого розчину. Промаркірувати пробірки.

3. В пробірки з лізуючим розчином і ВКО внести по 100 мкл досліджуваних проб води або концентрату, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром. В пробірку негативного контролю (НК) виділення внести 100 мкл негативного контрольного зразка (НКЗ). В пробірку позитивного контролю (ПК) виділення внести 90 мкл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка (ПКЗ) Rotavirus-rec.

4. Щільно закриті проби ретельно перемішати на вортексі і центрифугувати впродовж 5 с при 5000 об./хв. на мікроцентрифузі для видалення крапель з внутрішньої поверхні кришки пробірки.

5. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. В кожну пробірку окремим наконечником додати по 25 мкл ресуспендованого сорбенту. Перемішати на вортексі, поставити в штатив на 1 хв., ще раз перемішати і залишити на 5 хв.

6. Центрифугувати пробірки для осадження сорбенту при 10 000 об./хв. впродовж 30 с на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

7. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

8. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 3. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. Ценрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

9. Повторити відмивання розчином для відмивання 3, дотримуючись пункту 8.

10. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 4. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Повністю видалити супернатант з кожної пробірки окремими наконечниками, використовуючи вакуумний аспіратор.

11. Помістити пробірки в термостат при +60 град. С на 5-10 хв. для підсушування сорбенту. При цьому кришки пробірок повинні бути відкритими.

12. В пробірки додати по 50 мкл РНК-елюента, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром, вільні від РНКаз. Перемішати на вортексі. Помістити в термостат при температурі +60 град. С на 2-3 хв. Перемішати на вортексі і центрифугувати пробірки на максимальних оборотах мікроцентрифуги (12 000-13 000 об./хв.) 1 хв.

Супернатант (надосад) містить очищені РНК. Проби готові до постановки реакції зворотної транскрипції і ПЛР.

Реакцію зворотної транскрипції слід проводити відразу після отримання РНК-проби. Відбирати розчин РНК для реакції потрібно дуже обережно, не захоплюючи сорбент. Якщо сорбент скаламутився, необхідно осадити його на центрифузі.

Очищена РНК може зберігатися при 2-8 град. С до 4 годин. Для тривалого зберігання препарату, необхідно, не захоплюючи сорбент, відібрати розчин РНК, перенести в стерильну пробірку і зберігати при мінус 70 град. С.

Етап 2. Постановка реакції зворотної транскрипції і проведення ПЛР проводиться в кімнаті для розкапування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації (Зоні 2).

Постановка реакції зворотної транскрипції (загальний об'єм реакції - 20 мкл, об'єм РНК-проби - 10 мкл).

При роботі з РНК необхідно використовувати тільки одноразові стерильні пластикові витратні матеріали, що мають спеціальне маркування "RNase-free", "DNase-free".

1. Відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,2 мл.

2. Приготувати реакційну суміш на 12 реакцій. Для цього в пробірку з ліофілізованим DTT додати 125 мкл RT-mix і ретельно перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.

3. До отриманого розчину додати 6 мкл ревертази, перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.

4. Внести в мікропробірки по 10 мкл готовій реакційній суміші.

5. Використовуючи наконечники з бар'єром, додати 10 мкл РНК-проби в пробірку з реакційною сумішшю. Обережно перемішати.

6. Поставити пробірки в ампліфікатор (термостат) при температурі +37 град. С на 30 хв.

7. Отриману в реакції зворотної транскрипції кДНК для подальшої постановки ПЛР розвести в 2 рази ДНК-буфером (до 20 мкл кДНК окремим наконечником додати 20 мкл ДНК-буфера).

Готовий препарат кДНК можна зберігати при температурі -20 град. С впродовж 1 тижня або при температурі -70 град. С протягом року.

Постановка ПЛР (загальний об'ємреакції - 25 мкл, об'єм кДНК-проби - 10 мкл).

Обов'язково застосовується "арячий старт", який забезпечується розділенням нуклеотидів і Taq-полімерази прошарком воску. Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при температурі +95 град. С, що значно знижує кількість неспецифічних реакцій.

Підготовка пробірок для проведення ПЛР:

1) відібрати необхідну кількість пробірок з ПЛР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб;

2) на поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЛР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЛР-сумішшю-1;

3) зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл).

1. Узяти підготовлені для ПЛР пробірки. Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл кДНК, отриманих в реакції зворотної транскрипції РНК:

позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ПКЗ кДНК;

негативний контроль ПЛР (К-) - внести в пробірку 10 мкл ДНК-буфера.

2. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (дивися інструкцію до набору):

3. Після закінчення реакції пробірки відправити до кімнати для аналізу продуктів ПЛР (Зону 3).

Проби після ампліфікації можна зберігати 16 годин при кімнатній температурі, впродовж тижня - при температурі 2-8 град. С.

Етап 3. Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР-ампліфікації - проводиться в кімнаті для аналізу продуктів ампліфікації (Зоні 3).

1. Пробірки з продуктами ампліфікації виставити в штатив послідовно, відібрати з-під шару масла по 10-15 мкл проб і внести в лунки гелю (якщо для нанесення різних проб використовується один і той самий наконечник, то її необхідно промивати буфером з камери після нанесення кожної проби). В кожному рядку доріжок гелю повинен бути обов'язково представлений К+.

2. Підключити камеру до джерела струму, дотримуючи полярність (ДНК рухається до позитивного електроду), і включити джерело (напруга 250-300 В, стабілізація по напрузі), час електрофорезу - 18-20 хв. Оптимальна напруженість електричного поля при цьому складає 10 В/см.

3. Після закінчення електрофорезу (барвник ксиленцианол при цьому пройде приблизно половину довжини гелю - 1,5 см), вимкнути джерело струму, перенести гель на трансілюмінатор. Отримати зображення гелю на комп'ютері за допомогою відеосистеми, відзначивши порядок нанесення, занести в базу даних.

Робота з ампліфікованими днк повинна проводитися в окремій кімнаті співробітником лабораторії, що не проводить маніпуляцій в Зоні 1 і Зоні 2.

Облік результатів ПЛР-аналізу проводиться за наявності або відсутності на електрофореграмі специфічних смуг ампліфікованої кДНК (рис. 8.1, табл. 8.2).

Рис.8.1. Облік результатів ПЛР-аналізу.

1. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу виділення (ПК), повинні бути дві яскраві помаранчеві смуги, що світяться: специфічна - на рівні 290 п.н. і смуга внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ) - на рівні 514 п.н.

2. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу виділення (НК), повинна бути тільки смуга ВКЗ на рівні 514 п.н.

3. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу ПЛР (К+), повинна бути яскрава специфічна помаранчева смуга на рівні 290 п.н, що світиться.

4. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу ПЛР (К-) не повинне бути ніяких смуг.

5. Позитивними вважаються зразки, які містять специфічну смугу, що світиться, на рівні 290 п.н. більшої або меншої інтенсивності, незалежно від наявності смуги внутрішнього контролю.

6. Негативними вважаються зразки, які містять тільки смугу 514 п.н. більшої або меншої інтенсивності.

7. Окрім смуг 290 п.н. і 514 п.н. в доріжках можуть спостерігатися нечіткі розмиті смуги праймер-димерів, які розташовуються нижче за рівень 100 нуклеотидних пар.

Результати аналізу не підлягають обліку в наступних випадках:

1. Якщо результати аналізу контрольних зразків не співпадають з наведеними в таблиці, то відповідний етап аналізу слід переробити.

2. Якщо в доріжці будь-якої з проб відсутні обидві смуги, і 290 п.н. і 514 п.н., результат аналізу даної проби вважається недійсним, необхідно повторити дослідження із самого початку.

3. В доріжках з'являються неспецифічні смуги на різних рівнях. Можливі причини: відсутність "гарячого старту" або невірний температурний режим в осередках ампліфікатора.

4. Поява специфічної смуги 290 п.н. в будь-якому з негативних контрольних зразків (НК, К-) вказує на контамінацію реактивів або проб. В цьому випадку результати аналізу вважають недійсними. Необхідно повторити аналіз проб, а також вжити заходи щодо виявлення джерел контамінації.

7.2. Дослідження проб на наявність аденовірусів 40-41 типів

Індикацію аденовірусів людини в елюатах, отриманих після концентрування, проводять методами електронної мікроскопії, в РНГА із специфічним рідким діагностикумом "Аденотест", ПЛР, ІХА.

Виділення та ідентифікацію аденовірусів з проб води здійснюють у культурі клітин.

7.2.1. Електронна мікроскопія

Єдиний метод лабораторного дослідження, який дозволяє візуально виявити та ідентифікувати аденовірус за морфологічними ознаками, проте найчастіше застосовується в умовах спеціалізованих вірусологічних лабораторій НДІ.

Для приготування препарату на предметну сітку, вкриту вуглецево-формваровою плівкою-підкладкою, наносять концентрат (елюат). Після негативного контрастування фосфорно-вольфрамовою кислотою препарати досліджують при інструментальному збільшенні у 30-50 тисяч разів (див. Розділ 8.1.3). Належність виявлених часток до аденовірусів визначають за характерною морфологією та розміром.

7.2.2. Реакція непрямої гемаглютинації

Використовують еритроцитарний аденовірусний імуноглобуліновий рідкий діагностикум для РНГА "АДЕНОТЕСТ" для виявлення і кількісного визначення титрів аденовірусів 40-41 типів.

До складу тест-системи "АДЕНОТЕСТ" входять три компоненти:

1) діагностикум еритроцитарний аденовірусний імуноглобуліновий рідкий (ЕД);

2) імунна асцитна рідина (ІАР);

3) антиген аденовірусів (АГ).

Реакцію проводять у мікропланшетах для імунологічних реакцій в об'ємі 75 мкл. В кожну лунку двох рядів мікропланшета вносять по 25 мкл стабілізованого 0,9% розчину NaCl. По 25 мкл концентрату, додають в перші лунки вказаних рядів, після чого готують його послідовні дворазові розведення (від 1:2 до 1:256). Далі в лунки першого ряду додають по 25 мкл 0,9% розчину NaCl, а в лунки другого ряду - по 25 мкл ІАР.

Планшет струшують та залишають при кімнатній температурі на 20 хв. для утворення комплексу антиген-антитіло в лунках другого ряду. Після цього в усі лунки вносять по 25 мкл ЕД. Планшет знову струшують і залишають на 1,5-2 годин для специфічної взаємодії АГ аденовірусу з антиаденовірусними імуноглобулінами ЕД.

Реакція супроводжується такими контролями:

- контроль неспецифічної аглютинації ЕД (в 3 лунки вносять по 50 мкл 0,9% розчину NaCl та додають по 25 мкл ЕД в кожну);

- контроль специфічної взаємодії ЕД та ІАР. Його виконують за вищеописаною методикою РНГА, використовуючи замість досліджуваної проби АГ аденовірусу, який титрують від 1:64 до 1:2048. Антиген входить до складу тест-системи у розведенні 1:32. Цей контроль проводять після отримання комплекту, а потім - за необхідністю.

Облік результатів у контролях: у першому контролі спонтанна аглютинація ЕД повинна бути відсутня. УВ контролі специфічної взаємодії ЕД та ІАР в першому ряду ЕД повинен реагувати з антигеном в розведенні не менш ніж 1:256, а в другому ряду ІАР повинна знижувати титр АГ не менше ніж в 4 рази.

Позитивний результат на наявність аденовірусу дають у випадку повного гальмування аглютинації в другому ряду РНГА не менше ніж на 2 розведення (в 4 рази) в порівнянні з першим рядом.

Постановка контролів є обов'язковою при одержанні нової тест-системи. В разі їх невідповідності тест-система вважається непридатною для застосування.

7.2.3. Полімеразна ланцюгова реакція

ПЛР призначена для виявлення в пробах води або в концентраті (елюаті) фрагментів послідовностей ДНК-геному аденовірусу при багаторазовому збільшенні (ампліфікації) кількості цих фрагментів з подальшим ідентифікуванням їх відомими методами - молекулярною гібридизацією, електрофорезом у агарозному чи поліакриламідному гелі (ПААГ). Принцип реакції полягає у багаторазовому повторенні циклів синтезу вірус специфічної послідовності ДНК за допомогою термостабільного ферменту Tag ДНК-полімерази та двох специфічних затравок (праймерів).

Виявлення ДНК аденовірусів в пробах води методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

Для проведення аналізу використовуються проби води без етапу концентрації вірусу та концентрат (елюат), отриманий після концентрування (див. Розділ 6). Цей зразок в кількості 0,5-1 мл переносять в пробірки типу "еппендорф", що вільні від РНКаз та ДНКаз.

Зберігають проби при 2-8 град. С не більше 1 доби, тривало - при мінус 70 град. С. Допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу.

Доставка проб здійснюється в спеціальному термоконтейнері з охолоджуючими елементами.

Опис етапів ПЛР-аналізу

ПЛР-аналіз складається з трьох етапів:

- виділення ДНК;

- ампліфікація ділянки ДНК - полімеразная ланцюгова реакція (ПЛР);

- електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР та облік результатів ПЛР-аналізу.

Етап 2. Постановка ПЛР (загальний об'єм реакції - 25 мкл, об'єм ДНК-проби - 10 мкл).

Проводиться в Зоні 2 - кімнаті для розпакування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації.

У всіх комплектах АмпліСенс для ампліфікації обов'язково застосовується "гарячий старт", який забезпечується розділенням нуклеотидів і Taq-полімерази прошарком воску. Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при 95 град. С, що значно знижує кількість неспецифічних реакцій.

1. Відібрати необхідну кількість пробірок з ПЛР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб.

2. На поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЛР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЛР-сумішшю-1.

3. Зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл).

1. Узяти підготовлені для ПЛР стерильні одноразові пробірки на 0,5 (0,2) мл (плюс дві контрольні). Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл ДНК, виділеної з проб води/елюатів або контролів етапу виділення.

2. Додаткові пробірки призначаються для контролів етапу ПЛР (див. нижче):

а) негативний контроль (К-) замість ДНК-проби внести в підготовлену пробірку 10 мкл ДНК-буфера;

б) позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ДНК;

3. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (див. табл. 5.1).

1. Лізуючий розчин і розчин для відмивання 1 (якщо вони зберігалися при 2-8 град. С) прогріти при 60-65 град. С до повного розчинення кристалів.

2. Відібрати необхідну кількість одноразових пробірок на 1,5 мл з кришкою, що щільно закривається (включаючи негативний і позитивний контролі виділення). Внести в кожну пробірку по 300 мкл лізуючого розчину. Маркірувати пробірки.

3. В пробірки з лізуючим розчином внести по 100 мкл проб, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром. В пробірку негативного контролю (НК) виділення внести 100 мкл негативного контрольного зразка (НКЗ). В пробірку позитивного контролю (ПК) виділення внести 90 мкл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка (ПКЗ Adenovirus).

4. Щільно закрити проби, ретельно перемішати на вортексі і ценрифугувати впродовж 5 с при 5000 об./хв. на мікроцентрифузі для видалення крапель з внутрішньої поверхні кришки пробірки.

5. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. В кожну пробірку окремим наконечником додати по 25 мкл ресуспендованого сорбенту. Перемішати на вортексі, поставити в штатив на 1 хв., ще раз перемішати і залишити на 5 хв.

6. Центрифугувати пробірки для осадження сорбенту при 10 000 об./хв. протягом 30 с на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

7. Додати в пробірки по 300 мкл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, процентрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

8. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 2. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. Ценрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

9. Повторити відмивання розчином для відмивання 2, згідно з пунктом 8.

10. Повністю видалити супернатант з кожної пробірки окремими наконечниками, використовуючи вакуумний аспіратор.

11. Помістити пробірки в термостат 62 град. С на 5-10 хв. для підсушування сорбенту. При цьому кришки пробірок повинні бути відкритими.

12. В пробірки додати по 50 мкл ТЕ-буфера для елюції ДНК, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром, вільні від РНКаз та ДНКаз. Перемішати на вортексі. Помістити в термостат 62 град. С на 2-3 хв. Перемішати на вортексі і центрифугувати пробірки на максимальних обертах мікроцентрифуги (12-13 000 об./хв.) впродовж 1 хв.

Супернатант містить очищені ДНК. Проби готові до постановки ПЛР.

Відбирати розчин ДНК для реакції потрібно дуже обережно, не захоплюючи сорбент.

Якщо сорбент скаламутився, необхідно осадити його центрифугуванням.

Очищена ДНК може зберігатися при 2-8 град. С до тижня. Для тривалого зберігання препарату, необхідно, не захоплюючи сорбент, відібрати розчин ДНК, перенести в стерильну пробірку і зберігати при мінус 70 град. С.

Етап 2. Постановка ПЛР (проводиться в Зоні 2 - кімнаті для розкапування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації; загальний об'єм реакції - 25 мкл, об'єм кДНК-проби - 10 мкл)

Обов'язково застосовується "гарячий старт". Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при 95 град. С, що значно знижує кількість неспецифічних реакцій.

Підготовка пробірок для проведення ПЛР:

1) відібрати необхідну кількість пробірок з ПЦР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб;

2) на поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЦР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЦР-сумішшю-1;

3) зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл).

1. Взяти підготовлені для ПЦР стерильні одноразові пробірки на 0,2 мл (плюс дві контрольні). Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл ДНК, виділеної з проб або контролів етапу виділення.

2. Додаткові пробірки призначаються для контролів етапу ПЛР:

а) негативний контроль (К-) замість ДНК-проби внести в підготовлену пробірку 10 мкл ДНК-буфера;

б) позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ДНК;

3. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (див. Інструкцію до тест-системи).

Етап 3. Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР-ампліфікації (проводиться в зоні 3 - кімнаті для аналізу продуктів ампліфікації).

Робота з ампліфікованими ДНК повинна проводитися в окремій кімнаті співробітником лабораторії, що не проводить маніпуляцій в Зоні 1 і Зоні 2.

1. Пробірки з продуктами ампліфікації виставити в штатив послідовно, відібрати з-під шару масла по 10-15 мкл проб і внести в лунки гелю (якщо для нанесення різних проб використовується один і той самий наконечник, то її необхідно промивати буфером з камери після нанесення кожної проби). В кожному ряді доріжок гелю повинен бути обов'язково представлений К+.

2. Підключити камеру до джерела струму, дотримуючи полярність (ДНК рухається до позитивного електроду), і включити джерело (напруга 250-300 В, стабілізація по напрузі), час електрофорезу - 18-20 хв. Оптимальна напруженість електричного поля при цьому складає 10 В/см.

3. Після закінчення часу електрофорезу (фарбник ксіленціанол при цьому пройде приблизно половину довжини гелю - 1,5 см), вимкнути джерело струму, перенести гель на трансілюмінатор. Отримати зображення гелю на комп'ютері за допомогою відеосистеми, відзначивши порядок нанесення, занести в базу даних.

При дослідженні гелю і фотографуванні очі повинні бути захищені спеціальною маскою або скляною пластиною!

Облік результатів ПЛР-аналізу проводиться по наявності або відсутності на електрофореграмі специфічних смуг амплифікованої кДНК (табл. 8.3, рис. 8.2).

Рис. 8.2. Електрофореграмма результатів тестування зразків на наявність ДНК Adenovirus

Довжина специфічних смуг амплифікованих фрагментів кДНК: аденовірусу - 462 п.н.

1. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу виділення (ПК), повинні бути дві яскраві оранжеві смуги, що світяться: специфічна - на рівні 462 п.н.

2. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу виділення (НК), не повинно бути смуг.

3. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу ПЛР (К+), повинна бути яскрава специфічна оранжева смуга на рівні 462 п.н., що світиться.

4. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу ПЛР (К-) не повинно бути ніяких смуг.