На виконання рішення колегії МОЗ України від 03.11.98 N 11 "Проблеми гематології, служби крові, профілактики СНІДу в донорстві та запобігання розповсюдженню туберкульозу" та з метою регламентації діяльності закладів служби крові України

1. Затвердити:

1.1. Інструкцію з визначення груп крові за системами AB0 та резус (додається).

1.2. Інструкцію з фракціонування донорської крові на її компоненти (плазма, еритроцити, тромбоцити, лейкоцити) та їх консервування (додається).

1.3. Інструкцію з донорського плазмаферезу (додається).

1.4. Інструкцію з контролю стерильності консервованої крові, її компонентів, препаратів, консервованого кісткового мозку, плазмозаміщуючих та консервуючих розчинів, умов їх заготівлі (додається).

1.5. Інструкцію з переливання крові та її компонентів (додається).

2. Інструкції ввести в дію з 01.11.99 року.

3. Міністру Автономної Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Київської та Севастопольської міських державних адміністрацій забезпечити в підвідомчих закладах служби крові доведення, впровадження та неухильне виконання інструкцій, регламентуючих діяльність закладів служби крові.

4. Вважати такими, що втрачають чинність:

4.1. "Инструкцию по определению группы крови системы AB0 при помощи стандартных изогематоглютинирующих сывороток", затверджена МОЗ СРСР 07.09.90 N 05-М/27.

4.2. "Инструкцию по фракционированию консервированной крови на клеточные компоненты и плазму", затверджена МОЗ СРСР 11.06.87 N 06-14/24.

4.3. "Инструкцию по применению плазмафереза", доповнення N 1 до наказу МОЗ СРСР від 15.02.72 N 132.

"Инструкцию по применению двукратного плазмафереза", затверджена МОЗ СРСР N 06-14/18 1979 р.

4.4. "Инструкцию по контролю стерильности консервированной крови, ее компонентов, препаратов, консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов", затверджена МОЗ СРСР 22.06.89 N 04-14/21-14.

4.5. "Инструкцию по переливанию крови и ее компонентов", затверджена МОЗ СРСР 03.12.88 р.

5. Контроль за виконанням наказу покласти на заступника Міністра В.Л.Весельського.

Групи крові у людини - це система антигенів еритроцитів, яка представлена олігосахаридними структурами, зв'язаними з білками оболонки еритроцитів, котрі здатні викликати утворення специфічних антитіл і вступати з ними в реакцію. Антигенна структура еритроцитів (фенотип) є генетично визначеною (генотип). Характерною властивістю групових антигенів є їх здатність до стимуляції продукції відповідних до них антитіл у людей, які не мають цього антигену. В трансфузіологічній серології відрізняються два типи групових антитіл: природні та імунні.

Відомо більше 20 систем еритроцитарних антигенів. Однак практичне значення мають система AB0 та система Rh, оскільки вони найчастіше є причиною важких посттрансфузійних ускладнень, і їх необхідно, в першу чергу, враховувати при гемотрансфузіях.

Система AB0 представлена двома груповими антигенами A і B (аглютиногенами) та груповим олігосахаридом H, останній знаходиться на еритроцитах групи 0 і не має антигенної детермінанти. У межах антигену A спостерігається дальша антигенна диференціація на підгрупи A1, A2 та інші. Різновиди антигену B з'являються дуже рідко. У сироватці крові людей без відповідного антигену наявні природні (постійні, регулярні) антитіла класу IgM до групових антигенів A і B - анти-A (алоаглютинін, ізоаглютинін, гемаглютинін a(альфа) та анти-B (алоаглютинін, ізоаглютинін, гемаглютинін b(бета). Таким чином, різні співвідношення групових антигенів еритроцитів та алоантитіл (ізоаглютинінів) сироватки крові дають чотири групи крові:

Імунні антитіла анти-A чи анти-B, найчастіше класу IgG з'являються в результаті переливань груповонесумісної крові або внаслідок імунізації матері груповими антигенами плода. Природні та імунні групові антитіла відрізняються рядом фізико-хімічних і біологічних властивостей, з яких найбільше значення мають здатність проходити через плаценту, оптимальна температура та оптимальне середовище реакції з антигенами, теплова чутливість.

Визначення груп крові за системою AB0 грунтується на феномені аглютинації з використанням двох методичних підходів:

1. На еритроцитах визначають наявність антигенів A, B за допомогою:

а) стандартних сироваток із специфічними ізоаглютинінами;

б) моноклональних антитіл (МКА);

2. У сироватці визначають наявність ізоаглютинінів a(альфа) та b(бета) за допомогою стандартних еритроцитів відомої групи крові.

Визначення групи крові у людей проводять лікарі-лаборанти спеціалізованих і відповідно сертифікованих лабораторій з наступним записом результатів в спеціальний журнал та внесенням їх у вигляді штампу в паспорт (згідно діючої інструкції). При надходженні на стаціонарне лікування, первинне визначення групи крові виконують спеціально підготовлені лікарі-лаборанти централізованих (клінічних) лабораторій. Результат визначення групи крові записують у спеціальний журнал та на бланк з вказанням дати та за підписом особи, яка проводила визначення. Цей бланк підклеюють до карти стаціонарного хворого. Крім того, результат, який вказаний на цьому бланку, лікуючий лікар фіксує на титульній сторінці і скріплює підписом з вказанням дати. Доцільно звірити результат з попередніми даними (паспорт, історія хвороби).

У невідкладних випадках, коли хворому необхідна термінова трансфузія компонентів крові, а визначення групи крові лікарем-лаборантом неможливо організувати, визначення групи крові проводить лікуючий лікар з обов'язковим наступним наданням пробірки з кров'ю хворого в лабораторію для остаточного визначення групової належності.

Визначення групи крові в усіх випадках проводиться за допомогою стандартних сироваток обов'язково двох серій кожної групи або моноклональних антитіл. В сумнівних випадках додатково перевіряють присутність ізоаглютинінів за допомогою стандартних еритроцитів.

Групу крові у донорів визначають лікар або лікар-лаборант 2 рази: один раз, коли донор вперше звернувся (за допомогою стандартних сироваток двох різних серій кожної групи або МКА), і другий раз підчас остаточного зарахування в донори (перехресним методом, тобто одночасно за допомогою МКА, стандартних сироваток двох різних серій кожної групи і стандартних еритроцитів). Результат обох визначень записують на титульній сторінці особового журналу та облікової карти донора з вказанням дати і за підписом осіб, що визначали групу крові. В подальшому група крові у донорів визначається під час кожної наступної кроводачі два рази, як зазначено раніше.

1.1. Стандартні сироватки груп 0(I), A(II), B(III)

Стандартні сироватки груп 0(I), A(II), B(III) двох різних серій кожної групи і стандартна сироватка групи AB(IV). Стандартні сироватки для визначення груп крові виготовляють спеціальні лабораторії при установах служби крові. Сироватки зберігають у холодильнику при температурі + (6 +- 2) град. C. Термін зберігання сироватки вказаний на етикетці.

Вихідний контроль якості стандартних сироваток здійснює відділ технічного контролю закладів служби крові, державний контроль лабораторії Державного контролю за якістю препаратів крові та кровозамінників Київського НДІ гематології та переливання крові і Львівського НДІ патології крові та трансфузійної медицини.

1.2 Стандартні еритроцити підгруп 0(I), A(II), B(III)

Стандартні еритроцити готують із крові донорів (див. Інструкцію щодо забору і обліку крові, яку отримують від донорів малими дозами для приготування стандартних еритроцитів). Кров від донорів беруть у кількості 2 - 4 мл у пробірку, що містить 0,25 - 0,50 мл 3,8% або 5,0% розчину натрію цитрату, або гепарин, або консервант крові. Далі в пробірку (на 10,0 мл) до верху доливають 0,9% розчин натрію хлориду, перемішують її вміст і центрифугують протягом 5 хв. при швидкості обертання ротора 1500 об./хв., або відстоюють до повного осадження еритроцитів. Надосад зливають, додають 0,9% розчин натрію хлориду до початкового об'єму крові і використовують як стандарт при визначенні групи крові перехресним методом. Стандартні еритроцити зберігають у холодильнику при температурі + (6 +- 2) град. C. Термін зберігання - до 3 діб.

Стандартні тест-еритроцити можна одержати в готовому вигляді в закладах служби крові, які виготовляють ці стандарти.

1.3. Моноклональні антитіла анти-A, анти-B, анти-AB.

1.4. Ізотонічний (0,9%) розчин натрію хлориду.

1.5. Білі порцелянові або інші пластини, предметні скельця з змочуваною поверхнею.

1.6. 3,8% - 5% розчин натрію цитрату, гепарин, консервант крові.

1.7. Пробірки.

1.8. Піпетки.

1.9. Скляні палички.

1.10. Вата гігроскопічна.

Визначення проводять у приміщенні з задовільним освітленням при температурі від +15 до +25 град. C. Використовують цільну кров, відмиті еритроцити, еритроцити в плазмі, сироватці або в 0,9% розчині натрію хлориду. У хворих на анемію кров стабілізують гепарином.

2.1.1. Позначити на площині групу крові зліва направо "0", "A", "B".

2.1.2. Під відповідними позначками нанести по одній великій краплі (0,1 мл) кожної сироватки двох серій.

2.1.3. Поряд з кожною сироваткою нанести по 1 маленькій краплі (0,01 мл) досліджуваної крові (еритроцитів).

2.1.4. Змішати окремими скляними паличками кожну краплю крові (еритроцитів) з відповідною сироваткою.

2.1.5. Змішавши всі краплі, пластину погойдують, потім на 1 - 2 хв. залишають у спокої і знову погойдують. Спостереження за ходом реакції проводять не менше як 5 хв., хоча аглютинація починається вже протягом перших 10 - 30 с. Спостереження необхідно продовжувати далі - до 5 хв., тому що можлива пізня аглютинація, наприклад, з еритроцитами групи A2.

2.1.6. Через 3 - 4 хв. до крапель суміші сироватки з еритроцитами, де відбулась аглютинація, додають по 1 краплі (0,05 мл) 0,9% розчину натрію хлориду і продовжують спостерігати до 5 хв. при періодичному погойдуванні пластини.

Реакція ізогемаглютинації в кожній краплі може бути позитивною і негативною.

У разі позитивної реакції (звичайно протягом перших 10 - 30 сек. від початку змішування) в суміші з'являються видимі неозброєним оком дрібні червоні зернятка (аглютинати), які складаються з склеєних еритроцитів. Дрібні зернятка поступово склеюються в більш великі зерна, а інколи - в пластівці неправильної форми, в результаті чого сироватка зовсім або частково знебарвлюється.

У разі негативної реакції рідина весь час (5 хв.) залишається рівномірно забарвленою і в ній не спостерігається зернистості (аглютинатів).

Результати реакції в краплях з сироватками однієї і тієї ж групи (двох серій) мають співпадати.

Результати реакцій з сироватками трьох груп: 0(I), A(II) і B(III) можуть дати чотири різні комбінації (табл. 1).

2.3.1. Визначення групи крові перехресним методом базується на паралельному визначенні наявності або відсутності групових антигенів на еритроцитах і наявності або відсутності групових ізоаглютинінів у сироватці обстежуваної крові. Паралельне визначення ізоаглютинінів у сироватці з стандартними еритроцитами A та B обов'язкове у донорів і реципієнтів.

2.3.2. Для визначення групи крові використовують стандартні сироватки груп 0a(альфа)b(бета)(I), Ab(бета)(II) і Ba(альфа)(III) двох серій кожної групи, сироватку групи AB0(IV) і стандартні еритроцити груп 0(I), A(II) і B(III).

2.3.3. Під відповідними позначками груп крові на пластинку наносять по одній великій краплі (0,1 мл) стандартних сироваток груп 0(I), A(II) і B(III) послідовно зліва направо.

2.3.4. На нижню частину пластинки (третій ряд) під відповідними написами наносять по одній маленькій (0,01 мл) краплі стандартних еритроцитів у такій послідовності зліва направо: 0(I), A(II) і B(III) (табл. 2).

2.3.5. З пробірки, що містить кров хворого, піпеткою знімають сироватку і наносять її по одній великій краплі (0,1 мл) на підготовлені стандартні еритроцити (третій ряд). Після цього тією ж піпеткою набирають з дна пробірки еритроцити обстежуваної крові і наносять їх по маленькій краплі (0,01 мл) в 6 точок (другий і перший ряд) - по одній краплі поряд з кожною краплею підготовленої стандартної сироватки.

2.3.6. У всіх краплях сироватку старанно перемішують з еритроцитами сухою скляною паличкою, ретельно промиваючи її 0,9% розчином натрію хлориду і витираючи ватою після кожного перемішування. Пластинку періодично погойдують, проводячи спостереження за ходом реакції протягом 5 хв.

2.3.7. У процесі аглютинації, але не раніше ніж через 3 хв., в ті краплі, в яких вона з'явилася, додають по одній краплі (0,05 мл) 0,9% розчину натрію хлориду і продовжують спостереження при погойдуванні пластинки до 5 хв.

Трактування результатів реакцій проводять за оцінкою і співставленням результатів, отриманих за допомогою стандартних сироваток (два верхні ряди) і за допомогою стандартних еритроцитів (нижній ряд).

Результати реакцій, отриманих за допомогою стандартних сироваток і стандартних еритроцитів, повинні співпадати, тобто вказувати на наявність аглютиногенів та аглютинінів відповідно до однієї й тієї ж групи крові. Можливі чотири комбінації результатів (табл. 3).

Примітка. При встановленні групи крові AB(IV) необхідно провести контрольне дослідження цих еритроцитів з сироваткою групи AB(IV). Підтвердженням належності до цієї групи є відсутність аглютинації.

Моноклональні антитіла анти-A та анти-B призначені для визначення груп крові людини за системою AB0 замість стандартних ізогемаглютинуючих сироваток.

Визначення груп крові за системою AB0 у донорів і реципієнтів перехресним методом включає виявлення антигенів A і B в еритроцитах людини за допомогою МКА анти-A та анти-B, виявлення ізоаглютинінів a(альфа) і b(бета) у сироватці або плазмі досліджуваної крові стандартними тест-еритроцитами всіх груп.

Моноклональні антитіла анти-A і анти-B продукуються двома різними гібридомами і є розведеною асцитичною рідиною мишей-носіїв відповідної гібридоми, в якій знаходяться специфічні імуноглобуліни класу M (IgM), спрямовані проти груповоспецифічних антигенів A і B людини.

МКА не мають антитіл іншої специфічності і тому не викликають неспецифічної поліаглютинації еритроцитів.

МКА анти-A та анти-B перевірені всіма поширеними методами визначення груп крові - паралельно з ізогемаглютинуючими сироватками AB0. Результати довели надійність визначення груп крові у разі застосування моноклональних реагентів. Авідність, тобто час настання реакції аглютинації, її яскравість, у МКА анти-A та анти-B набагато вища, ніж у стандартних сироваток, особливо у випадку слабко виражених антигенів еритроцитів.

Визначення груп крові за системою AB0 проводиться в крові, як стабілізованій за допомогою консервантів (глюгіцир, цитроглюкофосфат, гепарин, натрію цитрат), так і в крові без консерванту. Визначення групи крові проводять у приміщенні з добрим освітленням при температурі від +15 до +25 град. C.

Реагенти не можна зберігати у відкритому вигляді, тому що у разі висихання активність антитіл знижується. Заборонено користуватися реагентами, якщо в них знаходяться нерозчинні пластівці або є помутніння. Для кожного реагенту використовують свою маркіровану (анти-A або анти-B) піпетку.

Визначення групи крові за системою AB0 реагентами МКА проводять звичайними методами виявлення антигенів еритроцитів під час масового визначення в установах служби крові - на планшетах або автоматичних системах, у разі індивідуального визначення - на білій порцеляновій або будь-якій іншій пластинці зі змочуваною поверхнею.

Беручи до уваги високу активність і авідність реагентів МКА, а також повну їх стандартність, для кожного визначення групи крові (крім випадку, коли група крові визначається вперше) достатньо застосовувати по одній серії реагентів анти-A і анти-B. У такому випадку необхідно використовувати МКА анти-AB, оскільки цей реагент служить додатковим контролем. Якщо реагенту анти-AB немає, слід проводити визначення двома серіями МКА анти-A і анти-B.

На планшет або пластинку МКА анти-А і анти-В наносять по одній великій краплі (0,1 мл) під відповідними написами: "анти-A" або "анти-B". Поряд з краплями антитіл наносять досліджувану кров по одній маленькій краплі, приблизно в 10 разів меншій від краплі антитіл (0,01 мл).

Під час визначення групи крові на планшеті антитіла і кров змішують ретельно вимитою сухою кулькою, погойдуючи планшет; у разі визначення на пластинці - скляною паличкою, яку промивають і насухо витирають після розмішування кожної краплі. Спостереження за перебігом реакцій з МКА проводять за легкого погойдування пластинки чи планшета не більше 3 хв. Результат реакції в кожній краплі може бути позитивним або негативним. Позитивний результат виражається в аглютинації (склеюванні) еритроцитів. Аглютинати помітні неозброєним оком у вигляді дрібних червоних агрегатів, що швидко зливаються і утворюють більші пластівці аж до великого аглютинату.

У разі негативної реакції крапля залишається рівномірно забарвленою, аглютинати в ній не виявляються. Аглютинація з МКА анти-A і анти-B звичайно настає в перші 3 сек.

Оцінку результатів реакції аглютинації з МКА анти-A і анти-B представлено в табл. 4, в яку також включено результати визначення ізоаглютинінів в сироватці (плазмі) реципієнтів і донорів за допомогою стандартних тест-еритроцитів.

Можливі чотири комбінації результатів:

3.4.1. Аглютинації немає (-) ні з МКА анти-A, ні з МКА анти-B. Таким чином, досліджувані еритроцити не мають антигенів АК і B, отже кров належить до групи 0(I). Це підтверджується наявністю аглютинінів a(альфа) та b(бета) і в досліджуваній сироватці (плазмі) за результатами позитивної реакції аглютинації зі стандартними еритроцитами груп A(II) і B(III).

3.4.2. Аглютинація (+) спостерігається тільки з МКА анти-A. Відповідно досліджувані еритроцити містять антиген A, отже кров належить до групи A(II). Це підтверджується наявністю аглютинінів b(бета) в досліджуваній сироватці (плазмі): позитивній реакції аглютинації зі стандартними еритроцитами групи B(III).

3.4.3. Аглютинація (+) спостерігається тільки з МКА анти-B. Отже, досліджувані еритроцити містять тільки антиген B, і кров належить до групи B(III). Це підтверджується наявністю аглютинінів a(альфа) у досліджуваній сироватці (плазмі): за результатами позитивної реакції аглютинації зі стандартними еритроцитами групи A(II).

3.4.4. Аглютинація (+) спостерігається як з МКА анти-A, так і з МКА анти-B. Відповідно досліджувані еритроцити містять обидва антигени (A і B), отже кров належить до групи AB(IV). Це підтверджується відсутністю аглютинінів a(альфа) та b(бета) у досліджуваній сироватці (плазмі): реакція аглютинації зі стандартними еритроцитами груп A(II) і B(III) негативна.

УВАГА. Для запобігання перехресному забрудненню реагентів не слід плутати піпетки, а використане при дослідженні групи крові обладнання (планшети, пластинки, кульки, палички та ін.) після роботи слід ретельно мити і висушувати.

Реагенти МКА для визначення груп крові виготовлені на 0,9% розчині натрію хлориду, який перешкоджає спонтанній аглютинації еритроцитів. Однак для виключення аутоаглютинації, котра може спостерігатися у деяких хворих (мієломна хвороба, опікова хвороба), а також у пуповинній крові новонароджених, у випадку позитивної реакції аглютинації еритроцитів з обома моноклональними реагентами анти-A і анти-B, тобто встановлення групи крові AB(IV), необхідно провести додаткове контрольне дослідження даного зразка крові з 0,9% розчином натрію хлориду. Для цього змішують одну велику краплю (0,1 мл) 0,9% розчину натрію хлориду з маленькою (0,01 мл) краплею досліджуваної крові. Відсутність аглютинації в досліджуваній крові свідчить, що кров належить до групи AB(IV).

За наявності спонтанної аглютинації (позитивна реакція в контрольній краплі) рекомендується повторити визначення групи крові, використовуючи відмиті еритроцити даного зразка крові.

У випадку розбіжності результатів визначення групи крові у донорів за допомогою МКА і стандартних еритроцитів, використання такої крові для переливання хворим не дозволяється, і кров направляють для детального дослідження до спеціалізованої лабораторії.

Моноклональні реагенти анти-A, анти-B та анти-AB випускаються у флаконах або ампулах по 20, 50, 100 і 200 доз (1 доза = 0,1 мл), в яких, крім реагенту, знаходиться також консервант (0,1% натрію азид) і відповідний барвник.

Термін зберігання - 2 роки в холодильнику при температурі +(6 +- 2) град. C. Реагенти можуть зберігатись протягом одного місяця в темному приміщенні при температурі від 10 до 25 град. C та відносній вологості (65 + 15)%.

Якщо результати двох тестів не співпадають у разі дослідження крові донора, то цю кров не можна використовувати для трансфузії до з'ясування причин неспівпадання. Якщо це явище встановлене в крові реципієнта, якому необхідне термінове переливання крові, то в цьому випадку йому можна перелити резус-сумісну еритроцитну масу групи 0(I) або резус-негативну еритроцитарну масу групи 0(I).

- помилковий порядок розміщення стандартних сироваток або еритроцитів у штативах; помилковий порядок розміщення моноклональних реагентів;

- помилковий порядок нанесення їх на пластинку;

- неправильне співвідношення кількості сироватки і еритроцитів, а також кількості моноклональних реагентів і еритроцитів;

- недотримання часу, необхідного для проведення реакції;

- проведення реакції при температурі в приміщенні, вищій 25 град. C (псевдонегативний результат);

- невикористання контрольної реакції з сироваткою групи AB(IV); або ізотонічного розчину натрію хлориду при роботі з МКА;

- забруднення або використання мокрих піпеток, пластинок, паличок;

- використання недоброякісних стандартів, наприклад, перетермінованих сироваток (недостатньо активних), забруднених або частково висушених, які можуть викликати неспецифічну реакцію аглютинації. Те ж саме відноситься і до моноклональних реагентів.

Поряд з цим слід звернути увагу на режим центрифугування: надмірне центрифугування еритроцитів під час їх відмивання може спричинити псевдопозитивний результат, а недостатнє - псевдонегативний.

У всіх випадках нечіткого або сумнівного результату необхідне повторне визначення групи крові за допомогою стандартних алоімунних сироваток двох серій, моноклональних реагентів, а також перехресним методом.

- слабкі форми антигену A (частіше) або B (рідко).

У цьому випадку сироватка може вміщувати надмірні антитіла, а відповідний антиген на еритроцитах не виявляється. Необхідно провести повторне тестування еритроцитів, використовуючи інші серії реагентів та інший лабораторний посуд. Доцільно також декілька разів відмити досліджувані еритроцити та подовжити час реєстрації реакції. Якщо при повторному визначенні результати знову не співпадають, таку кров слід направляти до спеціалізованої серологічної лабораторії;

- поліаглютинабельність еритроцитів, коли всі AB0-реагенти викликають однакову аглютинацію.

У цьому випадку слід перевірити, чи відбувається аглютинація тестованих еритроцитів у стандартній сироватці групи AB(IV) (якщо типування здійснювали за допомогою алоімунних сироваток) або в 0,9% розчині натрію хлориду (якщо використовували моноклональні антитіла). Поліаглютинацію вдається усунути шляхом повторного відмивання еритроцитів, хоч і не завжди.

Утворення "монетних стовпчиків" можна також прийняти за аглютинацію. У цьому випадку до реагента з еритроцитами слід додати 1 - 2 краплі 0,9% розчину натрію хлориду і погойдати площину - уявна аглютинація звичайно зникає;

- змішана аглютинація (кров'яна химера), коли частина еритроцитів зібрана в аглютинати, а решта - лишається вільною від аглютинації. Найчастіше це явище зустрічається у хворих, або у новонароджених при замінних переливаннях крові, що мають групу крові A, B або AB, яким 1 - 3 місяці тому переливали кров групи 0(I), а також після трансплантації кісткового мозку групи 0(I), рідше - у різногрупних близнюків. Завдяки ретельно зібраному анамнезу, це явище знаходить свої пояснення;

- при гемолітичній хворобі новонароджених, аутоімунних та інфекційних захворюваннях еритроцити хворих можуть спонтанно піддаватися аглютинації ізоімунними сироватками внаслідок сенсибілізації антитілами та комплементом.

У цьому випадку необхідно повторити визначення з моноклональними антитілами та в прямій пробі Кумбса.

- стандартні еритроцити в присутності досліджуваної сироватки утворюють "монетні стовпчики", що імітує позитивний результат.

До тестованої сироватки з еритроцитами слід додати 1 - 2 краплі фізіологічного розчину натрію хлориду та погойдати площину, і "монетні стовпчики" розпадуться, тоді як дійсна аглютинація залишиться сталою. Аномальний результат підтверджує реакція тестованої сироватки з стандартними еритроцитами групи 0(I);

- сироватка не має ізогемаглютинінів. Це спостерігається у новонароджених та у пацієнтів з тяжкими порушеннями імунної системи. Висновок щодо групи крові роблять на підставі дослідження еритроцитів з алоімунними сироватками чи з МКА. У цих випадках єдиним способом для підбору крові є проба на сумісність, якщо немає можливості визначити специфічність антитіл та підібрати типовані еритроцити.

Система резус включає 3 пари антигенів еритроцитів: D(Rh0) і d(Hr0), C(rh') і c(hr'), E(rh'') і e(hr''), які генетично зумовлені і представлені трьома парами алеломорфних генів на парі хромосом. Різні комбінації антигенів системи Rh на поверхні еритроцитів створюють 18 теоретично можливих фенотипів, тобто груп крові за системою Rh.

У трансфузіологічній практиці підлягають обліку, в першу чергу, три антигени - D(Rh0), C(rh') і E(rh''). Особливе значення має антиген D, який є сильним імуногеном. Ці антигени можуть знаходитися на еритроцитах людей разом або окремо, утворюючи сім різних співвідношень, а також можуть бути взагалі відсутніми (генотип ccddee). Ці відмінності дозволяють умовно розділити еритроцити людей на 8 груп. З них 4 групи, в яких знаходиться антиген D(Rh0), є резус-позитивними (Rh+), а 4 групи, які не мають антигену D(Rh0), - резус-негативними (Rh-).

На відміну від системи AB0, у сироватці крові людей практично не буває природних антитіл до антигенів системи Rh. Антитіла системи Rh мають виключно імунний характер і утворюються в результаті Rh-несумісної трансфузії чи вагітності.

Врахування груп крові за системою Rh є важливим для практики трансфузійної медицини.

Визначення резус-належності проводить спеціально підготовлений лікар або лікар-лаборант, який має посвідчення встановленого зразка, видане спеціалізованою установою або закладом (профільним НДІ, центром крові).

Визначення резус-належності проводять у реакції аглютинації за допомогою алоімунних сироваток або моноклональних реагентів.

Особи, які мають D(Rh0)-антиген умовно називаються резус-позитивними (їх 85% серед білого населення Європи), а ті, які його не мають - резус-негативними (Rh-).

Визначення резус-належності крові донорів проводять у два етапи: спочатку кров донорів досліджують стандартною сироваткою анти-D(Rh0) або моноклональними реагентами анти-D-супер, а потім кров тих донорів, які дали негативну реакцію з сироваткою анти-D(Rh0), досліджують додатково із стандартними сироватками антирезус, що містять, крім анти-D(Rh0), антитіла анти-C(rh') і анти-E(rh''). Антитіла анти-C(rh') і анти-E(rh'') можуть знаходитись у сироватці як у чистому вигляді, так і в суміші з антитілами D(Rh0), наприклад: анти-D(Rh0) + C(rh'), анти-D(Rh0) + E(rh'') або анти-D(Rh0) + С(rh') + E(rh'').

У відсотках представлено частоту поширення резус-позитивних і резус-негативних варіантів, які зустрічаються серед населення європейського регіону (табл. 5).

Дослідження фенотипу резус необхідно проводити у жінок з підозрою на ізосенсибілізацію та у вагітних жінок з підозрою на резус-конфліктну вагітність.

Результат визначення резус-належності крові донорів фіксують в особовому журналі та на титульній сторінці донорської картки з вказанням дати і за підписом осіб, які проводили визначення.

Результат визначення резус-належності крові хворих та інших осіб записують у спеціальний журнал та на бланк з вказанням дати та за підписом особи, яка проводила визначення. Цей бланк підклеюють до історії хвороби і, крім того, результат, який вказаний на цьому бланку, лікуючий лікар фіксує на титульній сторінці історії хвороби і скріплює підписом з зазначенням дати.

Сироватки антирезус виготовляють звичайно у вигляді універсальних, тобто позбавлених групових антитіл. Такі сироватки придатні для визначення резус-належності крові людей будь-якої групи за системою AB0. Однак за певних обставин сироватки антирезус виготовляють з крові різних груп за системою AB0. У цих випадках у разі визначення резус-фактора необхідно враховувати групову специфічність сироватки. Сироваткою антирезус групи 0(I) визначається резус-фактор тільки в еритроцитах групи 0(I); сироваткою антирезус групи A(II) визначається резус-фактор тільки в еритроцитах 0(I) і A(II); сироваткою антирезус групи B(III) визначається резус фактор тільки в еритроцитах груп 0(I) і B(III); сироваткою антирезус групи AB(IV) і спеціально виготовленою - універсальною, визначається резус-фактор в еритроцитах групи AB(IV) і будь-якої іншої групи крові.

Під час кожного дослідження для перевірки специфічності і активності сироватки антирезус необхідно ставити контроль.

Для контролю застосовують стандартні резус-позитивні еритроцити групи 0(I) або тієї ж групи, що і досліджувана кров, і стандартні резус-негативні еритроцити обов'язково тієї ж групи, що і досліджувана кров.

Стандартні сироватки для визначення резус-належності можуть мати різні за формою резус-антитіла - повні і неповні. Кожні з цих антитіл активні тільки в особливих умовах, тому методика визначення резус-фактора залежить від того, які резус-антитіла знаходяться в стандартній сироватці.

Визначення резус-фактора обов'язково треба проводити двома серіями стандартних сироваток антирезус. Якщо стандартні сироватки активні в різних умовах (наприклад, одна з них містить повні антитіла і тому активна в сольовому середовищі, а друга містить неповні антитіла і активна в колоїдному середовищі - в желатині або поліглюкіні), то визначення резус-належності слід проводити різними методами, як вказано в супровідній інструкції для кожної серії сироватки.

Таким чином, метод визначення резус-фактора залежить від форми резус-антитіл у стандартній сироватці та способу її виготовлення.

Видаючи сироватку антирезус, до неї прикладають коротку супровідну інструкцію з описом того методу, для якого призначена ця сироватка.

Стандартні сироватки антирезус з неповними антитілами. Стандартні еритроцити для контролю. Центрифужні або будь-які інші тонкостінні пробірки ємністю 10 - 15 мл. Водяна баня при температурі від 46 до 48 град. C або сухоповітряний термостат при температурі від 46 до 48 град. C. 10% розчин желатину. Желатин можна зберігати з консервантами: натрію сульфацилом (альбуцидом) з розрахунку 100 мг альбуциду на 10 мл 10% розчину желатину або з натрію азидом з розрахунку 10 мг на 10 мл 10% розчину желатину.

Кров для дослідження слід брати в кількості 2 - 5 мл в пробірку без стабілізатора. На пробірці підписати прізвище, ініціали і групу крові особи, від якої взято кров.

Звичайно після зсідання крові на дні пробірки лишається невелика кількість вільних еритроцитів, які слід використовувати для дослідження. Якщо цих еритроцитів недостатньо, слід струснути згусток для відділення більшої кількості еритроцитів.

Якщо брати кров з 3,8 - 5,0% розчином натрію цитрату (0,25 мл натрію цитрату на 1 мл крові), гепарином або іншим стабілізатором, еритроцити необхідно відмити, для чого в пробірку доливають до верху 0,9% розчин натрію хлориду, вміст її перемішують і центрифугують при 1500 об./хв. протягом 5 хв. при кімнатній температурі. Для дослідження потрібно використовувати відмиті еритроцити.

Для визначення резус-належності кров можна брати з місця проколу пальця скляною паличкою і негайно вводити в пробірку з сироваткою антирезус, змішаною з желатином у співвідношенні 1:2.

Для визначення резус-належності кров можна зберігати в холодильнику протягом трьох діб при температурі + (6 +- 2) град. C.

У разі використання двох серій сироватки антирезус у штативі розміщують три ряди центрифужних або будь-яких інших пробірок (об'ємом не менше 10 мл) у кожному ряді за числом досліджуваних зразків еритроцитів і по дві пробірки для стандартних резус-позитивних і резус-негативних еритроцитів. На кожній з трьох пробірок надписують прізвище та ініціали особи, кров якої буде досліджено. В однаково позначені пробірки (три ряди) вводять по одній краплі (0,05 мл) досліджуваних еритроцитів, а в контрольні - по одній краплі (0,05 мл) стандартних (Rh0+) і (Rh0-) еритроцитів.

У всі пробірки додають по дві краплі (0,1 мл) 10% розчину желатину, попередньо підігрітого до розчинення на водяній бані при температурі від 46 до 48 град. C.

У всі пробірки першого ряду додають по одній краплі (0,05 мл) сироватки антирезус однієї серії, у всі пробірки другого ряду - по 1 краплі (0,05 мл) сироватки антирезус другої серії. Третій ряд є контролем для виключення можливого неспецифічного склеювання досліджуваних еритроцитів, наприклад, за рахунок ауто-, теплових або холодових антитіл, і туди сироватку антирезус не додають.

Вміст пробірок перемішують струшуванням, і штатив з пробірками ставлять на водяну баню при температурі від 46 до 48 град. C на 5 - 10 хв. або в сухо-повітряний термостат при тій же температурі на 30 хв.

Після виймання пробірок з водяної бані або з термостату до них додають 5 - 8 мл 0,9% розчину натрію хлориду і перемішують вміст шляхом 1 - 2-кратного перевертання пробірок.

Пробірки переглядають на світлі неозброєним оком або через лупу з двократним збільшенням. Результат оцінюють за наявністю або відсутністю аглютинації еритроцитів.

За умови позитивного результату аглютинати легко розрізняються у вигляді червоних грудочок на прозорому, майже знебарвленому, тлі рідини.

За умови негативного результату в пробірці видно рівномірно забарвлену в світло-червоний колір, дещо опалесціюючу, рідину.

Зразки еритроцитів, що дали аглютинацію з сироваткою анти-D(Rh0), є резус-позитивними (Rh0+).

Зразки еритроцитів, що не дали аглютинації з сироваткою анти-D(Rh0), - резус-негативні (Rh0).

Однак результати враховують як вірогідні за умови співпадання їх в обох серіях сироватки антирезус і після перевірки контрольних зразків, які підтверджують специфічність і активність сироватки антирезус, тобто за відсутності аглютинації зі стандартними резус-негативними еритроцитами однойменної групи і наявності аглютинації зі стандартними резус-позитивними еритроцитами однойменної групи і групи 0(I). У пробірках третього (контрольного) ряду аглютинації не повинно бути.

Наявність аглютинації в будь-якій пробірці контрольного ряду свідчить про неспецифічність реакції. За цих умов позитивний результат з сироваткою антирезус не може бути врахований як вірогідний. У таких випадках для визначення резус-належності слід використовувати сироватку антирезус з повними антитілами або попередньо відмити еритроцити теплим 0,9% розчином натрію хлориду для вимивання з них аутоантитіл. За сумнівного результату необхідно проводити мікроскопічне дослідження.

- стандартний універсальний реагент антирезус - анти-Rh0(D);

- стандартні еритроцити для контролю;

- центрифужні або інші пробірки місткістю 8 - 10 мл.

Попередня обробка досліджуваної крові не потрібна. Може бути використана кров, взята безпосередньо перед дослідженням з місця уколу пальця, консервована кров і осад еритроцитів в пробірці після утворення згустку крові, взятої без стабілізатора.

Дозволяється зберігати кров протягом 3 діб при температурі + (6 +- 2) град. C.

У штатив ставлять 2 ряди пробірок за кількістю досліджуваних зразків еритроцитів у кожному ряді і по 2 пробірки для контрольних досліджень - стандартних резус-позитивних і резус-негативних еритроцитів. На пробірках надписують прізвище і ініціали особи, кров якої досліджують. Відповідно позначають і контрольні пробірки.

У всі пробірки 1-го ряду вносять по 2 краплі (0,1 мл) стандартного універсального реагенту антирезус.

У всі пробірки 2-го ряду вносять по 2 краплі (0,1 мл) 0,9% розчину натрію хлориду і по одній краплі (0,05 мл) 33% розчину поліглюкіну.

У кожну пару пробірок вносять відповідно до позначення по 1 краплі (0,05 мл) досліджуваної крові, стандартних резус-позитивних і резус-негативних еритроцитів.

Вміст пробірок перемішують струшуванням і потім поволі повертають по осі, нахиляючи майже до горизонтального положення так, щоб вміст розпливався по стінках. Таке розпливання крові по стінках пробірок робить реакцію більш вираженою. Як правило, аглютинація настає вже протягом 1-ї хвилини, але для утворення стійкого комплексу антиген - антитіло і чітко вираженої реакції, а також зважаючи на можливість сповільненої реакції у разі слабкої аглютинабельності еритроцитів, контакт еритроцитів з реагентом при повертанні пробірок має тривати не менше 3 хв.

Через 3 хв. в пробірки додають по 2 - 3 мл 0,9% розчину натрію хлориду і перемішують вміст 2 - 3-кратним повертанням пробірок (не струшувати!).

Пробірки передивляються на світлі неозброєним оком або через лупу з 2-кратним збільшенням. Результат оцінюють за наявністю або відсутністю аглютинації еритроцитів.

За наявності аглютинації у вигляді великих грудочок або пластівців із склеєних еритроцитів на тлі освітленої рідини досліджувану кров можна вважати резус-позитивною (Rh+). У разі відсутності аглютинації (в пробірці зберігається гомогенне забарвлення) досліджувану кров можна вважати резус-негативною (Rh-). Однак ці результати слід вважати вірогідними тільки після перевірки контрольних зразків, тобто у разі позитивної реакції зі стандартними резус-позитивними еритроцитами і негативної - з резус-негативними, а також після перегляду результатів у 2-му контрольному ряді.

У всіх пробірках 2-го контрольного ряду аглютинації не повинно бути.

Наявність аглютинації в будь-якій пробірці контрольного ряду вказує на неспецифічне склеювання еритроцитів і не дозволяє враховувати результат дослідження як вірогідний.

У таких випадках для визначення резус-належності слід застосовувати іншу сироватку антирезус, включаючи сироватку з повними антитілами, або відмити еритроцити теплим 0,9% розчином натрію хлориду для вимивання з них аутоантитіл.

- стандартні сироватки антирезус з повними антитілами;

- стандартні еритроцити для контролю;

- пробірки висотою 2 - 2,5 см і діаметром 0,5 - 0,6 см з гладким дном заокругленої форми або планшети з заглибинами такої ж конфігурації;

- лупа з 6 - 8-кратним збільшенням;

- термостат (37 град. C).

Кров для дослідження беруть у кількості 2 - 3 мл у звичайні пробірки, в яких знаходиться 0,25 мл (5 крапель) 3,8 - 5,0% розчину натрію цитрату або іншого стабілізатора. На пробірці надписують прізвище, ініціали та групу крові особи, від якої взято кров.

Еритроцити необхідно відмити, для чого в пробірки доливають доверху 0,9% розчин натрію хлориду, вміст їх перемішують і центрифугують при швидкості обертання ротора 1500 об./хв. протягом 5 хв.

Можна брати кров без стабілізатора. У такому разі після зсідання в пробірці залишається деяка кількість вільних еритроцитів. Одержані за такою методикою еритроцити відмивають, як вказано вище.

З відмитих еритроцитів готують 2% завис, для чого одну краплю еритроцитів переносять у відповідно позначену пробірку, в якій знаходиться 49 крапель 0,9% розчину натрію хлориду.

Припустимо зберігати кров у холодильнику протягом 3 діб при температурі +(6 +- 2) град. C.

У штатив встановлюють два ряди маленьких пробірок, в кожному ряді за кількістю досліджуваних зразків еритроцитів і дві - для контролю. Попередньо штатив накривають аркушем паперу. На ньому злегка наколюють отвори, крізь які і встановлюють пробірки.

Проти кожної пари пробірок на папері надписують прізвище, ініціали особи, кров якої будуть досліджувати.

У всі пробірки першого ряду вносять по 1 краплі (0,05 мл) сироватки антирезус однієї серії, у всі пробірки другого ряду - по 1 краплі (0,05 мл) сироватки антирезус другої серії, у всі пробірки обох рядів - по 1 краплі 0,9% розчину натрію хлориду.

У відповідно позначені пари пробірок додають по 1 краплі (0,05 мл) 2% завису досліджуваних еритроцитів, а в контрольні пробірки - по 1 краплі (0,05 мл) 2% завису контрольних (стандартних резус-позитивних і резус-негативних) еритроцитів.

Вміст пробірок ретельно перемішують струшуванням, і штатив з ними ставлять у термостат за температури 37 град. C на 1 год. За цей час еритроцити осідають на дно, попередньо увійшовши в контакт з сироваткою антирезус.

Пробірки слід розглядати по повздовжній осі над джерелом світла, закритим матовим склом. Результат оцінюють за наявністю або відсутністю аглютинації еритроцитів, що проявляється в різній формі їх осаду на дні пробірки. У разі позитивного результату осад еритроцитів розташовується на дні пробірки нерівномірним шаром. Видно шорсткість, губчастість або зернистість його структури. Контури осаду ніколи не бувають рівними, вони зігнуті, іноді згорнуті до середини. У деяких випадках еритроцити розташовуються у вигляді хвилястого віночка навколо більш світлої центральної частини.

У разі негативного результату осад еритроцитів розташовується рівномірним шаром без шорсткостей, інколи з невеликим просвітленням у центрі. Межі його являють собою правильно окреслене коло.

Діаметр осаду у разі негативного результату завжди менший, ніж у разі позитивного.

Зразки еритроцитів, що дають аглютинацію із сироваткою анти-D(Rh0), є резус позитивними (Rh+), зразки еритроцитів, що не дають аглютинації з сироваткою анти-D(Rh0) - резус-негативні (Rh-). Однак результат враховують як вірогідний за умови співпадання їх в обох серіях сироватки антирезус і після перевірки контрольних зразків, які підтверджують специфічність і активність сироватки антирезус, тобто за відсутності аглютинації зі стандартними резус-негативними еритроцитами однойменної групи і наявності аглютинації зі стандартними резус-позитивними еритроцитами однойменної групи або групи 0(I).

Примітка. Повні антитіла не виявляють слабкий різновид фактора D^U.

Після визначення резус-фактора з усіх пробірок обережно відсмоктують сироватку (еритроцити залишаються на дні) і збирають її в ампулу або в пробірку.

Цю сироватку можна повторно декілька разів застосовувати для визначення резус-фактора, поки активність її не вичерпається, тобто поки вона буде давати чітку аглютинацію зі стандартними резус-позитивними еритроцитами і негативну - зі стандартними резус-негативними еритроцитами.

1.5.1. Під час визначення резус-належності двома серіями стандартних сироваток у тих випадках, коли вони використовуються різними методами, результат враховують як вірогідний за умови співпадання його в обох серіях досліджень після перевірки контрольних зразків, які підтверджують специфічність і активність кожної серії сироватки антирезус, тобто за відсутності аглютинації зі стандартними резус-негативними еритроцитами однойменної групи і наявності аглютинації зі стандартними резус-позитивними еритроцитами однойменної або групи 0(I) і в контрольних пробах без сироватки (реагенту) антирезус.

1.5.2. Якщо під час визначення резус-належності спостерігається слабка або сумнівна реакція, то слід повторно досліджувати кров даної особи тими ж та іншими серіями сироватки антирезус або моноклональними реагентами, а також використовувати сироватку, що вміщує повні антитіла.

Якщо за таких умов усі серії сироваток, що містять неповні антитіла, дадуть також слабку або сумнівну реакцію, а з повними антитілами реакція буде негативною, це означає, що еритроцити мають слабку різновидність антигену резус, так званий фактор D^U, який зустрічається в популяції з частотою близько 1%. У цих випадках резус-належність крові хворого або вагітної жінки оцінюють, як резус-негативну (Rh-), а резус-належність крові донора - як резус-позитивну (Rh+), не допускаючи, таким чином, переливання його крові резус-негативним реципієнтам.

1.5.3. Інколи зустрічаються зразки еритроцитів, що дають слабко виражену реакцію. У цих випадках слід повторно досліджувати їх кількома серіями сироваток антирезус високої активності або моноклональними антитілами (реагенти анти-D-супер).

1.5.4. Для визначення резус-належності крові донорів недостатньо розділення їх тільки на резус-позитивних і резус-негативних за сироваткою анти-D(Rh0), а необхідно додатково досліджувати сироватками, що мають антитіла анти-C(rh') і анти-E(rh''), або моноклональними антитілами.

До числа резус-негативних донорів зараховують тільки тих осіб, кров яких не має жодного з вказаних антигенів.

1.5.5. Визначення антигенів резус-C(rh'), E(rh''), c(hr') і e(hr'') проводять сироватками, що мають антитіла відповідної специфічності, або моноклональними реагентами. Ці антитіла можуть бути в сироватці як у чистому вигляді, так і в різних співвідношеннях.

Ці дослідження проводять тими ж методами, що і визначення резус-фактора - D(Rh0). Як позитивний контроль використовують стандартні еритроцити, що мають відповідний антиген.

Моноклональні реагенти (антитіла) призначені для виявлення окремих антигенів системи резус на еритроцитах людини. Їх можна застосовувати замість ізоімунних сироваток або паралельно з ними.

Моноклональні тест-реагенти - це моноклональні антитіла, які виробляються гетерогібридомою. Одержують моноклональні антитіла з культуральної рідини гібридомних клітин-продуцентів. Технологія виготовлення тест-реагентів виключає можливість їх контамінації патогенними для людини вірусами.

Моноклональні антитіла анти-D-супер призначені для виявлення на еритроцитах людини антигену D(Rh0) і використовуються в серологічних тестах замість або паралельно з імунною анти-D-сироваткою.

Моноклональні анти-D-антитіла випускають у вигляді повних (IgM) та неповних (IgG) антитіл.

Оскільки IgM-антитіла не аглютинують деякі зразки еритроцитів із слабким варіантом D (зокрема, D^U), необхідно такі "негативні" еритроцити додатково досліджувати в желатиновому тесті або непрямій пробі Кумбса з використанням анти-D-реагентів, що мають IgG-антитіла. Такими реагентами є поліклональні сироватки або моноклональні анти-D-IgG-реагенти.

Анти-D-IgM-антитіла викликають пряму аглютинацію еритроцитів, які мають D-антиген, і можуть використовуватись в будь-якій модифікації прямої аглютинації: в пробірках, на площині, в мікроплатах.

Моноклональні антитіла анти-C-супер вміщують антитіла, здатні викликати пряму аглютинацію еритроцитів, що несуть на собі C(rh')-антиген системи резус. Даний реагент не має антитіл іншої специфічності і тому придатний для виявлення C-антигену в еритроцитах будь-якої групи крові за системою AB0.

Моноклональні анти-C-антитіла можуть бути використані в реакціях прямої аглютинації в пробірках, на площині, в мікроплатах. У разі застосування тесту на площині, скло необхідно попередньо злегка підігріти.

Моноклональні анти-CDE антитіла виготовляють із моноклональних антитіл (IgM та IgG) для виявлення в еритроцитах антигену C (один IgM-клон), D-антигену (один IgM-клон та один IgG-клон) і антигену E (один IgM-клон) шляхом прямої аглютинації в пробірках, на площині та в мікроплатах.

Слід підкреслити, що D^U-позитивні еритроцити також аглютинуються цим реагентом. Проте в разі негативної реакції слабкий DU фенотип можна виявити в непрямому тесті Кумбса з використанням IgG-компонентів анти-CDE моноклональних антитіл.

Реакцію з моноклональними анти-резус-тест-реагентами можна ставити в пробірках, на площині та в мікроплатах.

2.2.1. Одну краплю 3 - 5% завису еритроцитів сполучають з краплею моноклонального рідкого тест-реагенту.

2.2.2. Пробірки струшують до повного перемішування реагентів, після чого центрифугують при швидкості ротора 1000 об./хв. протягом 1 хв. Допускається попередня (перед центрифугуванням) інкубація при кімнатній температурі або при температурі 37 град. C протягом 30 хв.

2.2.3. Обережно струшують осад у пробірках.

У разі негативного результату осад еритроцитів легко розбивається, створюючи гомогенну непрозору суспензію.

Якщо результат позитивний, осад не розбивається, залишаючись у вигляді одного або декількох великих аглютинатів на тлі прозорої рідини.

2.3.1. На скляну площину зі змочуваною поверхнею наносять дві краплі тест-реагенту анти-резус (0,1 мл), 1 краплю досліджуваної крові (0,05 мл) і ретельно змішують.

2.3.2. Через 20 - 30 сек. починають погойдувати площину. Чітка аглютинація починається і спостерігається досить чітко за 60 сек. Результат реакції слід враховувати через три хвилини, уникаючи висихання краплини.

2.4.1. В комірку мікроплати капають одну краплину тест-реагенту анти-резус і додають до неї одну краплю 3 - 5% завису еритроцитів. Ретельно перемішують вручну або вібратором для мікроплат.

2.4.2. Центрифугують при швидкості обертання ротора 1000 об./хв. протягом 1 хв. або попередньо інкубують 30 хв. при кімнатній (від 20 до 27 град. C) температурі.

2.4.3. Злегка струшують мікроплату. Якщо результат негативний, осад розбивається у вигляді рівномірного забарвлення рідини.

У разі позитивного результату осад залишається у вигляді великих аглютинатів.

2.4.4. Відчитування результатів необхідно проводити у прохідному світлі з дзеркалом або з використанням спеціального обладнання, наприклад, апарату автоматичного обліку мікроплат.

2.5.1. Готують 3 - 5% суспензію досліджуваних еритроцитів в 0,9% розчині натрію хлориду.

2.5.2. У пробірці сполучають 1 краплю суспензії еритроцитів з 1 краплею моноклональних анти-CDE-антитіл і ретельно перемішують реагенти.

2.5.3. Ставлять на водяну баню при температурі 37 град. C на 15 хв.

2.5.4. Після інкубації еритроцити тричі відмивають 0,9% розчином натрію хлориду. Для цього в пробірки доливають до верху 0,9% розчин натрію хлориду, вміст їх перемішують і центрифугують при швидкості 1500 об./хв. протягом 5 хв.

2.5.5. Додають до осаду еритроцитів 2 краплі антиглобулінової сироватки Кумбса, ретельно перемішують.

2.5.6. Центрифугують протягом 1 хв. при швидкості обертання ротора 1000 об./хв. при кімнатній температурі.

2.5.7. Струшують пробірку та враховують аглютинацію.

2.5.8. Аглютинація еритроцитів свідчить про наявність антигена D^U.

У разі негативного результату реакції ставлять паралельний контроль з D-позитивними та D-негативними еритроцитами в пробі Кумбса.

Примітка. Інші антигени за системою резус, такі, наприклад, як C(rh'), c(rh'), E(rh''), e(hr''), а також антигени інших систем (Келл) виявляються ізоімунними сироватками, що мають відповідну специфічність. У перспективі розвитку біотехнології можлива заміна ізоімунних сироваток повністю моноклональними реагентами, переваги яких на сьогодні цілком очевидні.

- неправильний вибір антирезусних сироваток за груповою належністю;

- помилковий порядок розміщення сироваток, реагентів або дослідної крові у штативах;

- неправильне співвідношення між сироваткою і еритроцитами (еритроцитів повинно бути приблизно в 10 разів менше ніж сироватки);

- недотримання необхідної температури в водяній бані (при температурі нижчій від 42 град. C аглютинація може не наступити, при вищій від 48 град. C краплини швидко висохнуть);

- недотримання часу, необхідного для проведення реакції;

- висновок робиться з висохлої краплі;

- використання для визначення резус-фактора старої, гемолізованої або інфікованої крові;

- визначення резус-належності за допомогою однієї серії антирезусної сироватки.

- використання протермінованих сироваток;

- використання малоактивних сироваток;

- використання забруднених, інфікованих сироваток.

- феномен поліаглютинабельності еритроцитів. Поліаглютинацію вдається усунути за допомогою відмивання еритроцитів, хоч і не завжди;

- наявність антигену D^U (слабка різновидність антигену D). Еритроцити з цим аглютиногеном дають дуже нечітку аглютинацію зі стандартними антирезусними сироватками та з МКА. Реципієнтів з антигеном DU рахують резус-негативними, донорів - резус-позитивними;

- зниження рівня резус-аглютиногенів при деяких захворюваннях (хвороби системи крові, печінки, нирок, імунної системи).

Антитіла системи AB0 - ізоаглютиніни a(яльфа) і b(бета) у людей є нормальними (природними) антитілами. Вони належать до повних антитіл-аглютинінів, добре реагують у сольовому середовищі, краще виявляються при кімнатній температурі +(22 +- 2) град. C і погано - при температурі +37 град. C. Додавання в реакцію колоїдних речовин не посилює активності цих антитіл, непряма проба Кумбса їх не виявляє.

Нормальні антитіла a(альфа) і b(бета) легко абсорбуються груповими субстанціями A і B. Вони чутливі до дії високої температури: прогрівання при температурі 70 град. C протягом 10 хв. достатньо, щоб антитіла повністю втратили активність.

Крім нормальних (природних) антитіл a(альфа) і b(бета) в людини можуть з'явитися імунні антитіла анти-A і анти-B. Імунні антитіла практично відсутні в крові людей, але можуть з'явитися внаслідок ізоімунізації у разі парентерального попадання в організм несумісного в груповому відношенні антигену, наприклад, у разі AB0-несумісної вагітності, під час помилкового переливання крові, несумісної за системою AB0, а також під час проведення деяких щеплень та імунізації.

У разі AB0 - несумісної вагітності, яка стала причиною гемолітичної хвороби плода, імунні антитіла анти-A або анти-B майже завжди наявні в крові матері до моменту народження хворої дитини. Звичайно це супроводжується високим титром нормальних антитіл a(альфа) і b(бета).

Після помилкового переливання несумісної крові імунні антитіла анти-A і анти-B з'являються звичайно на 5-ту - 7-му добу, досягаючи максимуму до 15 - 25-ї доби з наступним зниженням їх титру. У крові таких хворих одночасно підвищується титр нормальних антитіл a(альфа) і b(бета) на 3 - 8 ступенів також з наступним зниженням після 25 - 30-ї доби.

Імунні антитіла анти-A і анти-B можуть бути як у формі повних, так і неповних антитіл. Вони активні при температурі 37 град. C, можуть мати дещо більш високий титр у разі проведення реакції в колоїдному середовищі порівняно з сольовим і виявляються в непрямій пробі Кумбса. Імунні антитіла не абсорбуються при додаванні групонеспецифічної субстанції. Вони стійкі до температурного впливу і зберігають активність під час прогрівання сироватки протягом 10 хв. при температурі 70 град. C, тобто за умов, коли нормальні антитіла a(альфа) і b(бета) повністю інактивуються.

Виявлення імунних антитіл може бути цінною діагностичною ознакою, зокрема, при вирішенні питання про причини гемотрансфузійних ускладнень і гемолітичної хвороби новонароджених. Ці дослідження рекомендують для використання на практиці. Найбільш демонстративною відмінністю нормальних антитіл a(альфа) і b(бета) від імунних антитіл анти-A і анти-B є їх поведінка під дією високої температури.

На врахуванні цих відмінностей грунтується застосування різних методів для виявлення нормальних антитіл та імунних антитіл анти-A і анти-B.

Стандартні еритроцити (або суміш еритроцитів) груп A(II) і B(III) двічі відмивають 0,9% розчином натрію хлориду шляхом центрифугування, при швидкості ротора 1500 об./хв. протягом 5 хв. при кімнатній температурі, після чого на дні пробірки залишається еритроцитна маса, з якої готують 2 - 3% завис окремо кожної групи.

Досліджувану сироватку в кількості 0,5 мл розводять у чотири рази 0,9% розчином натрію хлориду, щоб уникнути коагуляції під час нагрівання, потім розливають порівну в дві пробірки, одну з них прогрівають протягом (10 +- 1) хв. при температурі +(70 +- 0,5) град. C, точно дотримуючи температуру і час.

Таким чином, отримуємо дві порції сироватки - нативної і прогрітої, кожна з яких розведена 1:4.

Визначення антитіл починається реакцією аглютинації в сольовому середовищі в маленьких пробірках. Якщо цим методом повних імунних антитіл не виявлено, дослідження далі доповнюють непрямою пробою Кумбса.

Під час дослідження сироватки групи A(II) або B(III) в штативі розміщують в один ряд 12 маленьких пробірок. У разі дослідження сироватки групи 0(I) - два ряди по 12 пробірок. Штатив попередньо накривають аркушем паперу, в якому проколюють отвори для пробірок. У разі дослідження крові вагітної жінки використовують для дослідження еритроцити її чоловіка. Під час дослідження сироватки породіллі використовують еритроцити її дитини.

На папері надписують прізвище і групу крові особи, чию сироватку досліджують, групу крові стандартних еритроцитів і на кожній пробірці - ступінь розведення сироватки (1:4; 1:8; 1:16 і т. д. до 1:8000).

У всі пробірки кожного ряду, починаючи з другої, накапують по 2 краплі 0,9% розчину натрію хлориду. Потім у першу і в другу пробірки (кожного ряду) накапують по дві краплі приготовленої непрогрітої сироватки, розведеної в чотири рази.

У другій пробірці кожного ряду сироватку змішують з 0,9% розчином натрію хлориду і дві краплі цієї суміші переносять у третю пробірку, з третьої (також після перемішування) - в четверту і т. д. до останньої, з якої дві краплі виливають. Таким чином у пробірках утворюється розведення сироватки від 1:4 до 1:8000.

У другому штативі готують розведення попередньо прогрітої сироватки, за такої умови достатньо розмістити по 6 пробірок (розведення сироватки від 1:4 до 1:128).

Після приготування розведеної сироватки у всі пробірки додають по одній краплі 2 - 3% завису стандартних еритроцитів іншої групи: якщо досліджується сироватка групи B(III) - еритроцити групи A(II), якщо сироватка A(II) - еритроцити групи B(III) і у разі дослідження сироватки групи 0(I) в один ряд пробірок додають еритроцити групи A(II), а в другий ряд - еритроцити групи B(III).

Вміст пробірок старанно перемішують, після чого штативи залишають в спокої на 1 год.: з нативною сироваткою - при кімнатній температурі, з прогрітою - при температурі 37 град. C.

Результат оцінюють за формою осаду еритроцитів на дні пробірки, проглядаючи його над джерелом світла через лупу з 6 - 8-кратним збільшенням.

За наявності аглютинації осад розміщується у вигляді грудочок нерівномірним шаром із зігнутими, інколи загорнутими всередину, краями. За умови відсутності аглютинації осад еритроцитів розміщується рівномірним шаром у центрі дна пробірки у вигляді правильно окресленого кола.

Результати зазначають на папері біля кожної пробірки знаком (+) або (-).

Наявність аглютинації свідчить про присутність повних антитіл, а останнє розведення, у якому вона спостерігається, - про їх титр.

Титр антитіл нативної (не прогрітої) сироватки відноситься до аглютинінів (a(альфа) і b(бета), титр антитіл в прогрітій сироватці - до імунних антитіл анти-A (або анти-B).

У тому випадку, коли аглютинація спостерігається у всіх пробірках, дослідження треба повторити, продовжуючи розведення сироватки.

Негативний результат у всіх пробірках з прогрітою сироваткою свідчить про відсутність повних імунних антитіл.

Стандартні еритроцити A(II) і B(III) двічі відмивають 0,9% розчином натрію хлориду (п. 1.1), після чого на дні пробірок залишаються еритроцити, які використовують для дослідження.

У разі дослідження сироватки A(II) або B(III) в штатив вставляють 6 пробірок, при дослідженні сироватки групи 0(I) - два ряди по 6 пробірок. Пробірки нумерують. Штатив попередньо накривають аркушем паперу, в якому роблять отвори для пробірок. На папері роблять позначки, вказуючи на кожній пробірці її номер та всі інші відомості, як сказано вище, для реакції сольової аглютинації.

У всі пробірки, починаючи з N 2, накапують по три краплі (0,15 мл) 0,9% розчину хлориду натрію, а потім у пробірки N 1 і N 2 - по три краплі (0,15 мл) досліджуваної, заздалегідь прогрітої, сироватки і далі готують її розведення, як це зазначено вище, для методу сольової аглютинації, але в об'ємі трьох крапель.

У всі пробірки пастерівською піпеткою додають по одній маленькій краплі (0,01 мл) еритроцитів іншої групи, змішують сироватку з еритроцитами і штатив ставлять для інкубації в термостат на 45 хв. при температурі 37 град. C. За цей час імунні антитіла, якщо вони є в сироватці, фіксуються на еритроцитах.

Після інкубації відмивають еритроцити, для чого в пробірки доливають 0,9% розчин натрію хлориду, перемішують вміст і центрифугують при швидкості ротора 1500 об./хв. протягом 5 хв. при кімнатній температурі. Надстійну рідину відливають. Таке відмивання повторюють тричі (при об'ємі пробірок 10 мл достатньо дворазового відмивання).

Після відмивання в кожну пробірку додають 3 - 5 (0,15 - 0,25 мл) крапель 0,9% розчину натрію хлориду для одержання приблизно 5% завису еритроцитів і з кожної пробірки по одній краплі такого завису переносять на білу пластинку, яка має змочувану поверхню, пронумерувавши попередньо місця на пластинці відповідно до номерів пробірок. До кожної краплі додають по одній краплі сироватки для проби Кумбса і перемішують їх скляною паличкою. Далі протягом 10 хв. спостерігають результат при періодичному похитуванні пластинки.

2.5. Результат оцінюють за наявністю або відсутністю аглютинації, яку видно неозброєним оком на білому тлі пластинки. Настання аглютинації позначають на папері на кожній пробірці знаком "+" із зазначенням часу її прояву в хвилинах і секундах. Відсутність аглютинації позначають знаком "-".

Наявність аглютинації свідчить про присутність імунних антитіл анти-A або анти-B неповної форми, а останнє розведення, в якому воно спостерігається, - про їх титр. Оскільки непряма проба Кумбса ставиться як доповнення тільки при хибно-негативному результаті в сольовому середовищі, контроль щодо можливого хибно-позитивного результату за рахунок повних антитіл проводити немає необхідності.

У тому випадку, якщо аглютинація спостерігається у всіх пробірках, слід повторити дослідження, продовживши розведення сироватки.

Негативний результат у всіх пробірках свідчить про відсутність імунних антитіл неповної форми в даній порції досліджуваної сироватки.

У ході вищеописаних досліджень визначають три види антитіл:

- нормальні повні антитіла-аглютиніни a(альфа) і b(бета) (термолабільні);

- імунні повні антитіла анти-A і анти-B (термостабільні);

- імунні неповні антитіла анти-A і анти-B (термостабільні).

Загальне заключення роблять на основі співставлення результатів усіх досліджень:

а) наявність імунних (термостабільних) антитіл повної або неповної форми свідчить про те, що мало місце попадання в організм людини антигену, несумісного за системою AB0. Титр цих антитіл звичайно буває нижчим, ніж нормальних повних (термолабільних) ізоантитіл a(альфа) і b(бета), найчастіше 1:8 - для імунних повних антитіл і 1:32 - для імунних неповних антитіл;

б) високий титр нормальних повних антитіл-ізоаглютинінів a(альфа) і b(бета) (a вище за 1:256 і b(бета) вище за 1:128 за даного методу дослідження) навіть за відсутності імунних термостабільних антитіл у момент дослідження свідчить про стан підвищеної сенсибілізації організму і дозволяє зробити припущення про попередні надходження антигену, несумісного за системою AB0;

в) відсутність імунних термостабільних антитіл анти-A і анти-B у разі титру нормальних антитіл a(альфа) не вище за 1:256 і b(бета) не вище за 1:128 (за даним методом дослідження) свідчить про відсутність у людини ізоімунізації груповими факторами системи AB0 до моменту даного дослідження.

Сироватки з імунними повними гемаглютинуючими антитілами від алоімунізованих донорів можуть бути використані для визначення груп крові за системою AB0 як стандартні типуючі реагенти.

Гемолізини - антиеритроцитарні антитіла класу IgG, імунної природи, які здатні активувати систему комплементу, викликаючи гемоліз еритроцитів. Найчастіше вони виявляються вперше у вагітних жінок з групою крові 0(I), коли чоловік має групу крові A(II), або B(III), або AB(IV), і тоді антитіла мають характеристику відповідно: анти-A або анти-B імунних гемолізинів. У вперше вагітних жінок з групою крові A(II) можлива поява анти-B гемолізинів (якщо чоловік має групу крові B(III) або AB(IV), але вірогідність імунізації значно менша. Якщо вагітна має групу крові B(III), а чоловік - A(II) або AB(IV), то можлива поява анти-A імунних гемолізинів, але ще з меншою вірогідністю.

У лабораторних умовах гемолізини виявляють шляхом реакції досліджуваної сироватки з тест-еритроцитами в присутності комплементу (проба на виявлення гемолізинів є комплементзалежною реакцією).

4.1.1. Обладнання: пробірки скляні, пастерівські піпетки, вата, штативи лабораторні, термостат, центрифуга ЦКЛ, холодильник побутовий, водяна баня.

Реагенти: усе необхідне для визначення груп крові за системою AB0 (перехресним методом) та резус, досліджувана сироватка, еритроцити:

а) панель стандартних еритроцитів усіх груп крові за системою AB0;

б) еритроцити чоловіка (для вагітних) або дитини (для породіль);

в) еритроцити досліджуваної особи;

г) 0,9% розчин натрію хлориду, комплемент або щойно одержана сироватка крові як його джерело або від людини, що має AB(IV) групу крові, або від кролика або від гвінейської свинки.

Комплемент застосовують у тому випадку, коли досліджувана сироватка зберігалась більш як 48 год. до моменту дослідження, і внаслідок цього активність комплементу знизилась або зникла. Через це можливий псевдонегативний результат.

4.2.1. Спочатку визначають групову та резус-належність досліджуваної особи, а також групову належність тест-еритроцитів (донорів, чоловіка, дитини), якщо вони не відомі.

4.2.2. У штатив вміщують три ряди пробірок (відалівських або звичайних). Якщо досліджувана сироватка відноситься до 0(I) групи, тобто має ізогемаглютиніни a(альфа) + b(бета), то слід встановити 4 ряди пробірок:

1 ряд (дослід) - 10 пробірок;

2 ряд (контроль еритроцитів) - за кількістю зразків тест-еритроцитів;

3 ряд (контроль комплементу) - 1 - 2 пробірки.

Обов'язково ставлять контроль досліджуваної сироватки з тестеритроцитами донора 0(I) групи.

4.2.3. Готують 5% завис тричі відмитих еритроцитів:

а) чоловіка або дитини;

б) донорських еритроцитів 0(I), A(II), B(III) груп.

Щоб одержати 5% завис, у пробірці сполучають 0,25 мл відмитих еритроцитів з 5 мл 0,9% розчину натрію хлориду, або спрощено: 1 краплю тест-еритроцитів поєднують з 19 краплями 0,9% розчину натрію хлориду.

4.2.4. Дослідження починають з того, що в першу пробірку 1 ряду штативу вносять 3 краплі цільної сироватки, а в усі наступні - по 3 краплі ізотонічного розчину натрію хлориду.

У другу пробірку 1 ряду вносять 3 краплі цільної сироватки і починають її титрувати, переносячи з 2-ї в 3-ю пробірку по 3 краплі суміші досліджуваної сироватки з 0,9% розчином натрію хлориду і так до кінця ряду - із 3-ї в 4-ту, із 4-ї в 5-ту ..., а з останньої пробірки 3 краплі виливають. У результаті одержують розведення сироватки: цільна, 1:2; 1:4; 1:8; 1:16 і т. д. до 1:512.

4.2.5. У всі пробірки 1-го ряду вносять по 1 краплі 5% завису тест-еритроцитів (донора, чоловіка або дитини).

Під час виконання проби слід додержуватись такого правила: вносити краплю еритроцитів просто в сироватку, а не давати їй стікати по стінках пробірки; у такому разі можливі сліди гемолізу внаслідок підсихання еритроцитів.

4.2.6. Якщо пробу виконують з комплементом, то досліджувану сироватку прогрівають на водяній бані при температурі 56 град. C протягом 30 хв., після чого титрують (п. 5.2.4), в усі пробірки додають завис еритроцитів (1 краплю) і комплемент (по 3 краплі в кожну пробірку).

4.2.7. Пробірки 2-го ряду в штативі призначені для контролю еритроцитів: 1 крапля 5% завису тест-еритроцитів + 3 краплі 0,9% розчину натрію хлориду. Контролю піддають всі зразки тест-еритроцитів, що були в дослідженні.

4.2.8. Пробірки 3-го ряду - контроль комплементу. В пробірку вносять 1 краплю 5% завису тест-еритроцитів і додають 3 краплі комплементу. Контроль комплементу здійснюють на всіх зразках тест-еритроцитів, які були в дослідженні. Якщо досліджується свіжа сироватка хворого і комплемент не використовується, то 3-й ряд пробірок в штатив не ставиться.

4.2.9. 4-й ряд пробірок у штативі - обов'язковий контроль досліджуваної сироватки з тест-еритроцитами донора 0(I) групи крові. В пробірку вносять 1 краплю 5% завису тест-еритроцитів 0(I) групи крові від інтактного донора і додають 3 краплі досліджуваної суцільної сироватки.

4.2.10. Штатив струшують і ставлять у термостат при температурі 37 град. C на 1 год. для інкубації.

4.2.11. Після інкубації пробірки виймають з термостата, струшують та центрифугують 1 хв. при швидкості обертання ротора від 1000 до 1500 об./хв. при кімнатній температурі.

Результати реакції враховують візуально за наявністю або відсутністю гемолізу. Завдяки тому, що дослідження проводили у різних розведеннях, є можливість визначити титр ізоімунних гемолізинів при позитивній реакції. Титром імунних гемолізинів вважають те розведення сироватки, де спостерігається гемоліз. Виразність реакції (інтенсивності гемолізу) оцінюють за плюсовою системою.

Реакція позитивна (+++): на дні пробірки осаду немає, надосадова рідина інтенсивно забарвлена в червоний колір.

Реакція позитивна (++): на дні пробірки невеликий осад, надосадова рідина має значний шар забарвленої рідини.

Реакція позитивна (+): на дні пробірки осад значний, над ним тонкий шар ледве забарвленої рідини.

Реакція негативна (-): усі еритроцити знаходяться на дні пробірки, надосадова рідина незабарвлена.

Контроль: у контрольних пробірках гемолізу не повинно бути. Якщо він є, необхідно повторити дослідження, додержуючись методики, та додатково залучити інші реагенти.

4.4. Приклад формулювання відповіді (результату аналізу)

4.4.1. У досліджуваній сироватці крові (прізвище та ініціали) виявлено імунні гемолізини до еритроцитів (чоловіка, дитини, донора - непотрібне викреслити) анти-A або анти-B в титрі... ("+" або "++" або "+++").

4.4.2. У досліджуваній сироватці крові (прізвище та ініціали) імунні гемолізини до еритроцитів (чоловіка, дитини, донора - непотрібне викреслити) анти-A або анти-B не виявлено.

Резус-антитіла належать до ізоімунних антитіл, яких в нормі немає в сироватці людини, а з'являються в крові резус-негативних людей тільки внаслідок імунізації.

Умовами, що сприяють утворенню антитіл, є введення резус-негативній людині резус-позитивної крові або вагітність резус-негативної жінки резус-позитивним плодом.

Визначення резус-антитіл разом з визначенням резус-належності хворого і донора необхідне для запобігання імунному конфлікту внаслідок переливання резус-несумісної крові, а також для діагностики резус-конфлікту вагітних і можливого захворювання плода або новонародженого на гемолітичну хворобу.

Визначення резус-антитіл важливе також при відборі матеріалу для приготування сироватки анти-резус.

Резус-антитіла бувають різні за специфічністю: анти-D(Rh0), антиC(rh'), анти-E(rh''), анти-c(hr'), анти-e(hr'') і за формою: повні і неповні.

Специфічність антитіл визначається тим, з якими із резус-антигенів вони реагують. Форма антитіл визначається тим, яким чином вони реагують з еритроцитами, що несуть на собі специфічні для них резус-антигени.

Повні антитіла, що з'єднуються з резус-антигенами еритроцитів, викликають аглютинацію (склеювання) цих еритроцитів під час реакції в сольовому середовищі. Неповні антитіла в цих умовах тільки з'єднуються з еритроцитами, але не викликають аглютинації, так що зовні ця реакція нічим не проявляється.

Для того, щоб встановити, чи пройшла реакція між неповними резус-антитілами і еритроцитами, необхідні спеціальні умови, зокрема, додавання колоїдних розчинів (желатину, поліглюкіну) або використання сироватки для проби Кумбса, яка реагує з імуноглобулінами людини (непряма проба Кумбса). За всіх зазначених умов реакція між резус-антитілами і еритроцитами, що мають резус-антиген, у кінцевому результаті також проявляється у вигляді аглютинації еритроцитів.

Різні методи визначення резус-антитіл вимагають різних оптимальних для них температурних умов.

З метою забезпечення трансфузійної терапії, профілактики посттрансфузійних ускладнень гемолітичного типу необхідно проводити переливання крові, беручи до уваги алосенсибілізацію донорів і реципієнтів антигенами еритроцитів.

Кров донорів, вагітних жінок і хворих рекомендовано досліджувати на наявність антитіл до антигенів еритроцитів незалежно від їх резус-належності. Якщо виявлено антитіла, цільну кров або плазму донора не можна використовувати для переливання.

Титр і специфічність виявлених антитіл досліджують під час кожної кроводачі. Донори, які не мають в сироватці антитіл до антигенів еритроцитів, проходять кожен рік повторне дослідження.

Первинне дослідження антитіл у крові донорів здійснюють лабораторії закладів служби крові з допомогою реакції конглютинації з 10% розчином желатину та сумішшю еритроцитів 3 - 5 донорів групи 0(I) Rh+ і 3 - 5 донорів 0(I) Rh- з оцінкою результату під мікроскопом.

У тому випадку, коли антитіла до антигенів еритроцитів виявляли (або не виявляли, але в анамнезі були множинні гемотрансфузії або ускладнення вагітності), дослідження антитіл повторювали в антиглобуліновому тесті в лабораторії, яка має панель типованих еритроцитів.

У разі імунізації резус-негативних людей повторними трансфузіями крові або під час вагітності утворюються антитіла анти-D(Rh0), але за цих умов можуть утворюватись і інші резус-антитіла.

Тому під час визначення антитіл у сироватці крові людини цю сироватку досліджують зі стандартними резус-позитивними еритроцитами, що обов'язково мають три резус-антигени: D(Rh0), C(rh'), E(rh'').

Якщо антигени C(rh') і E(rh'') в еритроцитах спеціально не визначали, то число резус-позитивних зразків повинно бути не менше 20 для того, щоб серед них обов'язково зустрілись ці три резус-антигенти.

Як контроль на специфічність реакції, а також для виявлення антитіл анти-c(hr') і e(hr'') в дослідження включають стандартні резус-негативні cde(rh0) еритроцити і, якщо можливо, власні еритроцити особи, сироватку якої досліджують.

Таке дослідження є попереднім. Для уточнення специфічності потрібні додаткові специфічні дослідження.

Найчастіше у разі імунізації факторами групи Rh утворюються неповні антитіла; інколи одночасно з ними утворюються і повні. Крім того, зустрічаються випадки, коли у людини утворюються тільки повні резус-антитіла.

Тому визначення резус-антитіл слід проводити не менш як двома методами, одним з яких обов'язково повинен бути метод сольової аглютинації, що виявляє повні антитіла, а другий - будь-який метод, що виявляє неповні антитіла.

Існують різні методи дослідження сироваток. З них непряма проба Кумбса, реакція із застосуванням желатину і реакція із застосуванням поліглюкіну виявляють неповні резус-антитіла, і з цією метою може бути використаний будь-який з них.

Метод дослідження сироватки в сольовому середовищі виявляє повні резус-антитіла і обов'язково має використовуватись одночасно з будь-яким із згаданих вище.

Кров для приготування еритроцитів беруть у кількості 0,5 - 1,0 мл у звичайні пробірки місткістю не менше 10 мл, в які налито 0,25 мл 3,8 - 5,0% розчину натрію цитрату. Пробірки нумерують і пишуть на них прізвище, ініціали, групу крові і резус-належність особи, від якої взято кров. Пробірки доливають доверху 0,9% розчином натрію хлориду, потім вміст пробірок перемішують, центрифугують і відсмоктують відмивну рідину. Таке відмивання повторюють двічі.

Після відмивання на дні пробірки залишаються відмиті еритроцити, які і застосовують для дослідження сироватки.

2.2.1. В штатив вставляють і нумерують пробірки за числом і нумерацією зразків еритроцитів, з якими досліджують сироватку.

2.2.2. У всі пробірки вводять по 3 краплі (0,15 мл) досліджуваної сироватки.

2.2.3. З дна кожної пробірки, що містить відмиті стандартні еритроцити, дуже тонкою пастерівською піпеткою набирають 1 маленьку краплю (0,01 мл) еритроцитів і переносять її в пробірку з досліджуваною сироваткою відповідно з нумерацією пробірок.

2.2.4. Вміст пробірок старанно перемішують шляхом струшування і ставлять для інкубації в термостат на 45 хв. при температурі 37 град. C. За цей час резус-антитіла, якщо вони є в досліджуваній сироватці, фіксуються на еритроцитах.

2.2.5. Після інкубації в пробірки доливають доверху ізотонічний розчин натрію хлориду, вміст пробірок перемішують і центрифугують за швидкості ротора 1500 об./хв. протягом 5 хв. при кімнатній температурі, після чого надосадову рідину відсмоктують. Таке відмивання еритроцитів повторюють 3 - 4 рази.

2.2.6. У кожну пробірку до відмитих таким чином еритроцитів додають 4 - 7 крапель ізотонічного розчину натрію хлориду для одержання 5% завису.

2.2.7. Одну краплю (0,05 мл) завису еритроцитів із кожної пробірки переносять на білу порцелянову або будь-яку іншу білу пластинку зі змочуваною поверхнею і до кожної краплі додають по одній краплі (0,05 мл) сироватки, заготовленої для проби Кумбса.

2.2.8. Сироватку старанно перемішують з еритроцитами (скляною паличкою або кутом предметного скла), після чого пластинку злегка похитують, спостерігаючи результат (наявність або відсутність аглютинації еритроцитів).

Аглютинація звичайно починається протягом 10 - 30 сек., але при низькому титрі резус-антитіл може настати значно пізніше, тому спостереження слід продовжувати до 20 хв.

Аглютинація в цих випадках відбувається внаслідок того, що сироватка для проби Кумбса з'єднується з антитілами, а поскільки останні фіксовані на еритроцитах, то еритроцити також втягуються в реакцію, яка проявляється у вигляді аглютинації.

Наявність аглютинації в краплях і зразками резус-позитивних еритроцитів і відсутність її з резус-негативними і власними еритроцитами вказує на присутність в сироватці неповних резус-антитіл.

Відсутність аглютинації з усіма зразками еритроцитів вказує на те, що неповні резус-антитіла - анти-D(Rh0), C(rh'), E(rh''), c(hr'), e(hr'') - не виявлено.

2.4.1. В штатив встановлюють 10 пробірок з позначками: 1:2, 1:4, 1:8 і т. д. до 1:1024.

2.4.2. У всі пробірки вводять по 3 краплі (0,15 мл) 0,9% розчину натрію хлориду.

2.4.3. У першу пробірку (з позначкою 1:2) вводять 3 краплі (0,15 мл) досліджуваної сироватки. З першої пробірки після перемішування її вмісту переносять 3 краплі в наступну і т. д. до останньої пробірки, з якої 3 краплі виливають. У результаті в пробірках утворюється розведення досліджуваної сироватки від 1:2 до 1:1024.

2.4.4. У всі пробірки пастерівського піпеткою додають по одній маленькій краплі (0,01 мл) стандартних резус-позитивних еритроцитів або суміш еритроцитів, одержаних від 4 - 5 резус-позитивних осіб і приготовлених так само, як готують стандартні еритроцити.

2.4.5. Вміст пробірок перемішують і штатив ставлять на 45 хв. у термостат при температурі 37 град. C.

2.4.6. Після інкубації еритроцити відмивають і з них готують 5% завис в 0,9% розчині натрію хлориду. Потім з кожної пробірки переносять одну краплю (0,05 мл) завису на білу пластинку і до кожної краплі зависі додають одну краплю (0,05 мл) сироватки проби Кумбса, котру змішують з еритроцитами. Далі протягом 15 - 20 хв. спостерігають результат при похитуванні пластинки.

2.4.7. Останнє розведення, в якому спостерігається аглютинація (час спостереження 5 хв.), приймають за титр виявлених неповних резус-антитіл. Якщо аглютинація еритроцитів спостерігається у всіх розведеннях сироватки, це означає, що титр резус-антитіл вищий за 1:1024. У цих випадках слід продовжувати розведення сироватки і далі проводити дослідження, як вказано вище.

Кров для приготування еритроцитів беруть не більше ніж за 2 - 3 доби до дослідження в кількості 3 - 5 мл у звичайні пробірки без стабілізатора. Пробірки нумерують і пишуть на них прізвище, ініціали, групу крові і резус-належність особи, від якої взято кров. У такому разі звичайно після зсідання крові на дні пробірки залишається незначна кількість еритроцитів, які і використовують для дослідження. Еритроцити беруть з дна пробірки пастерівською піпеткою; якщо у такий спосіб захоплюється невелика кількість власної сироватки, це не впливає на хід реакції.

Якщо еритроцитів, що після зсідання крові залишилися вільними, недостатньо, то припускається інтенсивне струшування згустку для виділення додаткової кількості еритроцитів.

Можна брати кров з натрію цитратом. У цьому випадку еритроцити необхідно відмити 0,9% розчином натрію хлориду.

3.2.1. У штатив вставляють тонкостінні пробірки висотою 10 см, які нумерують. Число і нумерація пробірок повинні відповідати числу і нумерації зразків еритроцитів, з якими досліджують сироватку.

3.2.2. У пробірки відповідно до нумерації вводять по одній краплі (0,05 мл) еритроцитів, приготованих як стандарти.

3.2.3. У всі пробірки додають по 2 краплі (0,1 мл) 10% розчину желатину, підігрітого до розрідження на водяній бані при температурі від 46 до 48 град. C. (Розчин желатину необхідно старанно перевірити перед застосуванням. У разі помутніння, появи пластівців, а також втрати властивості застигати при температурі від +4 до +8 град. C розчин желатину не придатний).

3.2.4. Після цього у всі пробірки вводять по 2 краплі (0,1 мл) досліджуваної сироватки, пробірки струшують для перемішування їх вмісту і ставлять на водяну баню при температурі від 46 до 48 град. C на 10 хв. або в сухоповітряний термостат на 30 хв. при температурі від 46 до 48 град. C.

3.2.5. У пробірки, вийняті з водяної бані, наливають 5 - 8 мл 0,9% розчину натрію хлориду. Вміст пробірок перемішують шляхом однодворазового перевертання їх і спостерігають результат за наявності чи відсутності аглютинації еритроцитів.

3.2.6. Обов'язковий контроль власної сироватки з власними еритроцитами.

Результат реакції переглядають на світло неозброєним оком або під мікроскопом.

Наявність аглютинації в пробірках із зразками резус-позитивних еритроцитів і відсутність її з резус-негативними і власними еритроцитами вказує на наявність в досліджуваній сироватці неповних резус-антитіл.

Відсутність аглютинації з усіма зразками еритроцитів вказує на те, що неповні резус-антитіла анти-D(Rh0), C(rh') і E(rh''), а також c(hr') і e(hr'') не виявлено.

3.4.1. У штатив вставляють 10 пробірок з позначеннями 1:2, 1:4, 1:8 і т. д. до 1:1024.

3.4.2. У всі пробірки вносять по 2 краплі (0,1 мл) 0,9% розчину натрію хлориду.

3.4.3. У першу пробірку цією ж піпеткою вносять 2 краплі (0,1 мл) досліджуваної сироватки. З першої пробірки, після перемішування, дві краплі переносять в другу, з другої - в третю, з третьої - в четверту і так до останньої пробірки, з якої 2 краплі (0,1 мл) виливають. У результаті в пробірках утворюється розведення сироватки від 1:2 до 1:1024.

3.4.4. У всі пробірки додають по одній краплі (0,05 мл) суміші еритроцитів, одержаних від 4 - 5 резус-позитивних осіб і приготовлених, як вказано вище.

3.4.5. У всі пробірки вносять по 2 краплі (0,1 мл) 10% розчину желатину, попередньо підігрітого до розрідження в теплій воді при температурі від 46 до 48 град. C.

3.4.6. Пробірки струшують і вміщують на водяну баню при температурі від 46 до 48 град. C на 10 хв. або в сухоповітряний термостат на 30 хв.

3.4.7. Після виймання пробірок з водяної бані в них доливають по 5 - 8 мл 0,9% розчину натрію хлориду і спостерігають результат. Останнє розведення, в якому спостерігається аглютинація, приймають за титр виявлених резус-антитіл.

Якщо аглютинація еритроцитів спостерігається у всіх розведеннях сироватки, це означає, що титр резус-антитіл вище за 1:1024.

У цих випадках слід продовжити розведення сироватки і далі проводити дослідження, як вказано вище.

Примітка. Для спрощення титрування за допомогою цього методу можна об'єднати операції, що описані в пунктах 3.4.4 і 3.4.5, і приготувати завис еритроцитів, одержаних від 4 - 5 резус-позитивних осіб, безпосередньо в розчині 10% желатину. Еритроцитів повинно бути приблизно 10 - 20% по відношенню до загального об'єму. Цей завис додають по 2 краплі (0,1 мл) у всі пробірки з розведеннями досліджуваної сироватки антирезус і далі роблять, як вказано вище.

Кров для приготування стандартних еритроцитів беруть в кількості 1 - 2 мл в пробірки місткістю 8 - 10 мл, в яких знаходиться 3,8 - 5,0% розчин натрію лимоннокислого (з розрахунку 0,25 мл на 1,0 мл крові). Пробірки нумерують і пишуть на них прізвище та ініціали особи, від якої взято кров.

Після взяття крові в пробірки доливають доверху ізотонічний розчин натрію хлориду, вміст перемішують, центрифугують і відсмоктують відмивну рідину за швидкості ротора 1500 об./хв. протягом 5 хв. при кімнатній температурі. Таке відмивання повторюють двічі.

Можна брати кров і без стабілізатора. У цьому випадку після зсідання крові в пробірці звичайно залишається деяка кількість вільних еритроцитів. Якщо цих еритроцитів недостатньо, слід інтенсивно струснути згусток для відділення деякої кількості еритроцитів. Одержані таким чином еритроцити відмивають, як вказано вище.

З відмитих еритроцитів готують 2% завис в інших пробірках, взятих за кількістю зразків стандартних еритроцитів і відповідно пронумерованих.

Для приготування 2% завису в ці пробірки капають по 2,5 мл (49 крапель) 0,9% розчину натрію хлориду і в кожну пробірку відповідно до її нумерації переносять одну краплю еритроцитів. Вміст пробірок перемішують для одержання рівномірного 2% завису еритроцитів, який використовують для дослідження сироватки.

4.2.1. В штатив вставляють ряд маленьких пробірок (висотою 2 - 2,5 см з внутрішнім діаметром 0,5 - 0,6 см, з гладким дном заокругленої форми) за кількістю зразків еритроцитів, з якими досліджують сироватку. Попередньо штатив покривають аркушем паперу, в якому роблять отвори для пробірок. Проти кожної пробірки на папері пишуть порядковий номер, а також прізвище, ініціали, групу крові і резус-належність особи, сироватку якої досліджують.

4.2.2. У всі пробірки вводять по одній краплі (0,05 мл) досліджуваної сироватки і по одній краплі 0,9% розчину натрію хлориду. Пробірки струшують для перемішування їх вмісту.

4.2.3. У пробірки, згідно з їх нумерацією і позначенням, вводять по одній краплі (0,05 мл) 2% завису стандартних еритроцитів.

4.2.4. Вміст пробірок знову перемішують і штатив з ними ставлять для інкубації в термостат при температурі 37 град. C на 1 год.

4.2.5. Після інкубації штатив з пробірками виймають і спостерігають результат у вигляді наявності чи відсутності аглютинації еритроцитів.

4.2.6. Обов'язковий контроль аглютинації власних еритроцитів у разі додавання власної сироватки. При цьому аглютинації не повинно бути.

Результат реакції визначають за допомогою лупи з 6 - 8-кратним збільшенням за формою осаду еритроцитів на дні пробірки.

Наявність аглютинації в пробірках з резус-позитивними зразками еритроцитів і відсутність її з резус-негативними і власними еритроцитами вказує на наявність в сироватці повних резус-антитіл. Відсутність аглютинації зі всіма зразками еритроцитів вказує на те, що повні резус-антитіла анти-D(Rh0), C(rh'), E(rh''), а також c(hr') і e(hr'') не виявлені.

Проводиться аналогічно до реакції конглютинації з додаванням желатину з використанням 2% завису тест-еритроцитів.

За умови дуже високого ступеня імунізації організму резус-антитіла, що утворились, інколи дають феномен зони. Цей феномен полягає в тому, що не розведена або в незначному розведенні (1:2) сироватка крові таких осіб може не дати або дати слабку позитивну реакцію у разі взаємодії з резус-позитивними еритроцитами. Однак, якщо таку сироватку розвести, то у разі деякого розведення (частіше всього 1:8, 1:16, а іноді і більше) резус-антитіла в ній стають активними і дають добре виявлену позитивну реакцію. Найрідше феномен зони буває вираженим підчас випробування сироватки непрямою пробою Кумбса. Тому, а також у зв'язку з великою її чутливістю, проба Кумбса є дуже цінною реакцією для виявлення неповних резус-антитіл.

Якщо всі методи, включаючи непряму пробу Кумбса, не виявляють в сироватці резус-антитіл, а в анамнезі у особи, кров якої досліджують, є дані щодо сенсибілізації до резус-фактора, то для виключення феномена зони слід випробувати цю сироватку в розведеннях. Для цього сироватку розводять і випробовують, як вказано для кожного методу в розділах "Титрування сироватки".

Якщо під час спостереження результату в будь-яких розведеннях сироватки зазначається позитивна реакція, це означає, що в досліджуваній сироватці є антитіла. У цих випадках для подальшого дослідження сироватки її слід розвести, вибравши те розведення, в якому спостерігається найбільш виявлена позитивна реакція.

Розводити сироватку слід 0,9% розчином натрію хлориду. Дослідження розведеної сироватки проводять, як вказано вище, для кожного методу. Під час встановлення висоти титру враховують загальне розведення нативної сироватки починаючи з 1:2.

Сироватки, що дали позитивний результат з усіма зразками резуспозитивних еритроцитів, можуть мати як виключно антитіла антиD-(Rh0), так і одночасно антитіла до декількох антигенів: анти-C + D(Rh0'), анти-D + E(Rh0'') або анти-C + D + E(Rh0''').

У деяких випадках досліджувані сироватки, що мають резус-антитіла, можуть викликати аглютинацію вибірково - не всіх резус-позитивних еритроцитів. Це може бути пов'язано з тим, що в досліджуваній сироватці є антитіла не анти-D(Rh0) (які найчастіше зустрічаються), а анти-C(rh') або анти-E(h'').

Позитивний результат може також спостерігатись і з резуснегативними еритроцитами за рахунок інших антигенів за системою резус-c(hr'), e(hr'') або антигенів інших систем.

Для встановлення специфічності резус-антитіл необхідно спеціальне дослідження сироватки з набором стандартних еритроцитів, включаючи рідкі фенотипи: cDe(Rh0), Cde(rh') і cdE(rh''), а також резуснегативні зразки, включаючи ті, що містять, і ті, що не містять антигенів Келл (K) і Даффі (Fy). З ними ж проводять і титрування сироватки.

Висновок щодо наявності в сироватці резус-антитіл можна зробити у разі позитивного результату, одержаного при будь-якому методі дослідження.

Висновок щодо відсутності у сироватці резус-антитіл можна зробити тільки у разі негативного результату, одержаного при дослідженні не менш ніж двома методами, одним з яких є будь-який метод виявлення неповних резус-антитіл, а другим - реакція аглютинації в сольовому середовищі, що виявляє повні резус-антитіла. У такому разі слід ураховувати можливий феномен зони.

Кожна установа переливання крові, а також лабораторії в інших лікувально-профілактичних закладах, де проводять визначення груп крові, кількості еритроцитів і лімфоцитів, виготовлення, стандартизацію і контроль групоспецифічних, антирезус або лейкоцитарних типуючих сироваток, повинні мати постійних донорів, у яких береться кров малими дозами для виготовлення відповідних стандартів.

Стандартні еритроцити застосовують як контроль під час визначення групи крові, резус-належності і антитіл, а також для виробництва стандартних сироваток, що використовують для визначення груп крові і резус-належності.

1.1. Під час визначення групи крові необхідно мати контрольні еритроцити донорів груп 0, A (підгрупа A1) і B.

1.2. У разі виготовлення стандартних ізогемаглютинуючих сироваток слід використовувати кров донорів, які зазначені в пункті 1.1, і додатково мати ще одного донора групи A (підгрупа A2).

1.3. Для визначення резус-фактора - D(Rh0) необхідно мати контрольні еритроцити 6 донорів. У такому разі слід використовувати кров донорів, які зазначені в пункті 1.1, і залежно від їх резус-належності додатково підібрати 3-х донорів груп 0, A і B так, щоб серед усіх 6 зразків крові було по одному резус-позитивному (Rh+) і одному резус-негативному (Rh-) зразку кожної групи крові. За відсутності резус-позитивних донорів груп A(II) і B(III) як позитивний контроль припускають використання резус-позитивних еритроцитів групи 0(I).

1.4. Для виготовлення стандартних сироваток антирезус і під час визначення резус-антитіл необхідно мати контрольні еритроцити донорів, зазначених у пункті 1.3. Цих донорів треба більш детально обстежити на наявність у них антигенів резус. Залежно від цього число донорів має бути поповнено за рахунок донорів групи 0(I) так, щоб в їх крові обов'язково містились три антигени резус-D(Rh0), C(rh') і E(rh'') - окремо або в різних сполученнях.

2.1. Кров для приготування стандартних еритроцитів беруть у донорів з пальця або з вени не частіше 3 разів на тиждень у кількості 2 - 3 мл залежно від потреби.

2.2. Кров для приготування стандартних лімфоцитів з метою визначення лейкоцитарних антигенів або в інших науково-дослідних цілях беруть у донорів з вени у кількості 10 - 20 мл (залежно від потреби) не частіше 1 разу на тиждень.

2.3. Кожний донор, у якого беруть кров малими дозами, повинен знаходитись на обліку у відділенні донорських кадрів, де на нього заводять донорський журнал за такою формою:

Якщо лабораторія, для якої донор дає кров малими дозами, не входить до складу установи служби крові, донор знаходиться на обліку безпосередньо в цій лабораторії. При зарахуванні в донори і далі, кожні 1,5 - 2 місяці донора оглядає лікар-терапевт. У донора перевіряють вміст гемоглобіну і кількість еритроцитів. Взяття крові можливе за умови вмісту гемоглобіну не нижче за 120 г/л - для жінок і 130 г/л - для чоловіків.

2.4. В лабораторіях, де беруть у донорів кров малими дозами, повинна бути заведена книга реєстрації із зазначенням кожного взяття крові за такою формою: прізвище, ім'я, по батькові, група крові, резус-належність та інші антигенні маркери (що визначають) донора, в якого береться кров малими дозами.

2.5. Взяття крові кількісно підраховують за 1,5 - 2,0 місяці і виводять загальний обсяг взятої крові. Підсумок підписує керівник лабораторії або відділу, для потреб якого брали кров.

2.6. Керівник лабораторії або відділення на основі запису в книзі взяття крові видає донору довідку, де вказано кількість взятої крові і за який проміжок часу вона взята. Довідку підписує керівник лабораторії або відділення.

2.7. На донорів, у котрих беруть кров малими дозами, розповсюджуються всі пільги, передбачені Урядом України для донорів, які дають кров для переливання хворим. Вихідний день надається донорам за умови взяття крові в кількості не менше 100 мл.

Фракціонування консервованої крові на компоненти та диференційоване застосування їх у лікувальній практиці дозволяє раціонально використовувати донорську кров.

Основний клітинний компонент крові - еритроцитна маса (ЕМ) за фізіологічними, функціональними та лікувальними властивостями має перевагу над цільною консервованою кров'ю. Менший об'єм еритроцитної маси вміщує таку ж кількість еритроцитів, але значно менше цитрату, продуктів розпаду клітин, білкових антигенів та антитіл. Трансфузії ЕМ мають посісти провідне місце у гемотерапії, спрямованій на поповнення дефіциту червоних клітин у разі гострої та хронічної анемій різної етіології.

Переливання концентратів тромбоцитів та лейкоцитів є засобом терапії тяжких захворювань, які супроводжуються дефіцитом цих клітин.

Оптимальне та раціональне фракціонування донорської крові на компоненти передбачає їх виділення у максимально можливій кількості та збереження у функціонально повноцінному стані протягом визначеного періоду для кожного компонента.

За допомогою фракціонування з дози консервованої крові 500 мл може бути одержано біля 250 мл нативної плазми та 250 мл концентрату еритроцитів від 0,65 х 10^11/л до 0,9 х 10^11/л (у середньому 0,7 х 10^11/л тромбоцитів та від 0,8 х 10^9/л до 1,3 х 10^9/л (у середньому 1,1 х 10^9/л)) лейкоцитів.

Консервовану донорську кров заготовлюють згідно з Інструкцією з заготівлі крові та медичного обстеження донорів крові, плазми.

1.1. При обстеженні донорів, кров яких призначена для одержання концентрату тромбоцитів, особливу увагу необхідно звернути на відсутність у них ознак кровоточивості (петехій, синців тощо) та виключити можливість прийому ними аспірину, принаймні, протягом доби до кроводачі.

1.2. Донорську кров заготовляють у полімерні контейнери або (скляні флакони місткістю 500 мл, 400 мл чи 250 мл) на одному з консервантів, що застосовують в службі крові.

1.3. Консервовану кров, що призначена для фракціонування, зберігають в холодильниках при температурі (4 +- 2) град. C (для подальшого виділення плазми, еритроцитів) протягом 3 діб, чи при температурі (22 +- 2) град. C (для виділення тромбоцитів та лейкоцитів) не більше 1 доби.

1.4. Консервована кров, призначена для фракціонування на компоненти, повинна відповідати таким вимогам:

- час зберігання крові, призначеної для виділення тромбоцитів та лейкоцитів, повинен бути обмеженим 4 - 6 год. після заготівлі від донора, для заготівлі еритроцитів - до 7 діб;

- для виготовлення антигемофільної плазми чи кріопреципітату рекомендовано використовувати плазму, одержану в стаціонарних умовах, до 2 год. від моменту заготівлі, а при умові використання плазми, одержаної з крові, заготовленої у виїзних умовах, - до 4 год. від моменту заготівлі, для одержання свіжозамороженої плазми - до 4 - 6 год.; для виготовлення з плазми білкових препаратів - до 21 доби (згідно з регламентом їх виробництва);

- кров, що зберігалася, повинна мати чітко виражену межу між плазмою та клітинами крові;

- плазма консервованої крові має бути прозорою, солом'яно-жовтого кольору без каламуті, пластівців, прожилків фібрину та ознак гемолізу, глобулярний шар крові повинен бути рівномірним, без нерівностей на поверхні.

1.5. Фракціонування крові, заготовленої в скляні флакони, проводять з дотриманням правил асептики в боксованій операційній, що оброблена згідно з Інструкцією з заготівлі консервованої донорської крові.

1.6. Фракціонування крові, заготовленої у полімерні контейнери, може проводитися у небоксованому приміщенні з дотриманням правил асептики, так як процес розділення крові на компоненти у полімерних контейнерах відбувається в закритій системі.

Для одержання еритроцитної маси застосовують методи спонтанного відстоювання (седиментації) еритроцитів чи центрифугування крові.

2.1.1 Флакони з консервованою кров'ю зберігають у вертикальному положенні в холодильниках при температурі (4 +- 2) град. C.

2.1.2. Виділення плазми проводять в боксованій операційній з додержанням усіх правил асептики. Підготовку боксів для роботи проводять згідно з Інструкцією з контролю стерильності консервованої крові, її компонентів, препаратів, кровозамінників та консервуючих розчинів. Для попередження забруднення повітря тривалість роботи у боксі не повинна перевищувати 3-х годин. Флакони з кров'ю, призначені для виділення плазми, та штативи протирають 3% розчином хлораміну. З тубусів флаконів знімають пергаментні ковпачки, відгинають стулки металевих ковпачків та обпалюють тубуси тампоном, змоченим 96% спиртом. Після цього штатив із флаконами передають у бокс, де гумові корки обпалюють повторно. Виділення плазми із флакону проводять шляхом переміщення її у другий флакон за допомогою вакууму чи підвищеного тиску у флаконі з кров'ю.

Гумовий корок флакону з кров'ю проколюють двома голками: короткою голкою з натягненою на неї полівінілхлоридною (ПВХ) трубкою довжиною 5 см та довгою голкою системи для виділення плазми. Система складається з двох голок (I - 114) та з'єднувальної ПВХ трубки (довжиною 15 см); другою голкою системи проколюють корок порожнього стерильного флакону, в який буде переміщено плазму. Для виходу повітря з цього флакона корок проколюють короткою голкою. Аспірацію плазми закінчують, коли над шаром еритроцитів залишається шар плазми висотою (1 +- 0,2) см 10 - 15 мл у флаконах місткістю 250 мл та 20 - 30 мл у флаконах місткістю 450 - 500 мл.

Одержана ЕМ повинна мати гематокритне число 0,70 - 0,80 л/л.

2.1.3. По закінченні фракціонування крові на плазму та еритроцитарну масу з флаконів витягують голки, обробляють поверхню 5% розчином йоду, потім місце проколу заливають колодієм та проводять герметизацію корків шляхом занурення тубуса флакону у розплавлений стерильний парафін. Крім того, тубус флакону покривають пергаментом та фіксують гумовим кільцем.

2.1.4. На флакон з плазмою наклеюють етикетку "нативна плазма", на якій зазначають назву установи-заготовлювача, об'єм, дату заготівлі, термін зберігання, групу крові донора, реєстраційний номер та прізвище лікаря.

Плазму зберігають у холодильнику при температурі (4 +- 2) град. C не більше 3 діб, використовують для переливання хворим чи направляють на переробку для виготовлення препаратів. Для тривалого зберігання нативну плазму заморожують в холодильних прилавках при температурі від мінус 25 до мінус 30 град. C одразу ж після заготівлі, але не пізніше 24 год., та зберігають при таких умовах до використання.

2.1.5 На флакон, в якому залишилася ЕМ, наклеюють додаткову етикетку "еритроцитна маса", на якій вказують назву установи-заготовлювача, об'єм, дату заготівлі, групу крові та резус-фактор донора, назву гемоконсерванта, прізвище лікаря. Зберігають ЕМ в холодильнику при температурі (4 +- 2) град. C 21 добу (з часу заготівлі крові).

2.1.6. ЕМ може бути використана для отримання відмитих еритроцитів, кріоконсервованих згідно з методичними рекомендаціями "Методи довгострокового зберігання в замороженому стані еритроцитів, призначених для трансфузій". Для ресуспендування еритроцитів використовують один з плазмозамінюючих розчинів, затверджених МОЗ України. Термін зберігання такої еритроцитної завісини (ЕЗ) визначається відповідною інструкцією.

2.1.7. Етикетування ЕЗ проводять як у п. 2.1.5, вказуючи у назві "Еритроцитна завісина".

2.2.1 Контейнери з кров'ю зберігають у холодильнику при температурі (4 +- 2) грах. C (п. 1.4).

2.2.2. Для заготівлі плазми та еритроцитної маси полімерний контейнер з осадженими форменними елементами крові обережно вміщують у плазмоекстрактор етикеткою до задньої його пластини, притискають передньою рухомою пластиною, знімають затискач з трубки, що веде до додаткового порожнього контейнера та переводять плазму в нього. Коли межа розділу плазми та клітин крові опиняється біля вхідного отвору головного контейнера, на трубку накладають затискач на відстані 2 - 5 см від контейнера з плазмою. При відсутності плазмоекстрактора полімерний контейнер з кров'ю підвішують на штативі, порожній контейнер розміщують на столі. Послабивши затискач на з'єднувальній трубці, обережно стискують рукою нижню частину контейнера з кров'ю та переводять плазму у порожній контейнер. Накладають затискач на з'єднувальну трубку на відстані 2 - 5 см від контейнера з кров'ю. Контейнери, що містять плазму та еритроцитну масу, герметизують за допомогою запаювання ПВХ трубок чи іншими способами (накладають металеві кільця, зав'язують руками два тугих вузла).

2.2.3. Трубку посередині між ділянками герметизації розрізують. Контейнер з плазмою від'єднують, етикетують та зберігають як вказано у п. 2.1.4.

2.2.4. Контейнер з ЕМ етикетують, зберігають та використовують, як вказано у п. 2.1.5 - 2.1.7.

2.3.1. Скляні флакони з консервованою кров'ю перевіряють на герметичність, відсутність тріщин.

2.3.2. Кров ретельно, повільно перемішують для рівномірного розподілу клітин у флаконі.

2.3.3. Флакони з кров'ю вкладають у центрифужні склянки з гумовими вкладками, зрівноважують водою та центрифугують при відцентровому прискоренні 1170 g протягом 12 хв. (див. додаток 1) при температурі (+4 +- 2) град. C.

2.3.4. Обробку флаконів з кров'ю для заготівлі ЕМ та плазми, виділення плазми, герметизацію, паспортизацію флаконів з цими компонентами, зберігання та використання їх проводять, як зазначено у п. 2.1.2 - 2.1.7.

2.3.5. ЕМ може бути використана для приготування еритроконцентрату (ЕК) з гематокритом 0,80 - 0,90 л/л. Для цього голку, витягнуту з флакону з плазмою (після її виділення), вводять у порожню стерильну ємкість, в яку за допомогою відсмоктування з флакону з ЕМ переводять залишок плазми з лейкоплівкою та еритроцитами загальним об'ємом до (30 +- 5) мл.

2.3.6. ЕК використовують для одержання ЕМ, збідненої лейкоцитами та тромбоцитами, чи для одержання еритроцитної завісини, як зазначено у п. 2.1.6.

2.4.1. Перевіряють герметичність з'єднувальної трубки між головним та додатковим контейнерами.

2.4.2. Кров ретельно, повільно перемішують для рівномірного розподілу клітин в контейнері.

2.4.3. Контейнери з кров'ю вміщують у центрифужні склянки, зрівноважують водою та центрифугують при відцентровому прискоренні 1250 g протягом 20 хв. при температурі (+4 +- 2) град. C (див. додаток 1).

2.4.4. Подальше виділення плазми та ЕМ, герметизацію та етикетування контейнерів з цими компонентами, зберігання та використання їх проводять, як зазначено у пп. 2.2.2 - 2.2.4; 2.3.5 - 2.3.6.

Трансфузії еритроцитної маси, збіднілої лейкоцитами та тромбоцитами (ЕМЗЛТ), показані сенсибілізованим хворим, які мають лейкоцитарні, тромбоцитарні антитіла, з метою попередження негемолітичних післятрансфузійних реакцій. Збідненою вважається ЕМ, з якої вилучено 70% та більше лейкоцитів від початкової кількості у цільній крові.

Найефективнішим методом одержання ЕМЗЛТ є кріоконсервування еритроцитів з подальшим їх розморожуванням та відмиванням від кріофілактиків. Цей метод дозволяє одержати трансфузійне середовище, практично повністю (на 98% і більше) позбавлене лейкоцитів та тромбоцитів. Переливання еритроцитів, що їх заготовляють у такий спосіб, чинить найбільш сприятливу дію у хворих, сенсибілізованих до антигенів лейкоцитів та тромбоцитів.

Одержання ЕМЗЛТ можливе також шляхом центрифугування крові та відмивання еритроцитів при температурі (7 +- 2) град. C.

Всю свіжозаготовлену (до 2 - 4 год.) консервовану кров фракціонують з метою одержання ЕМЗЛТ, концентратів тромбоцитів та лейкоцитів. Центрифугують її у цьому випадку при температурі (22 +- 2) град. C.

Відмиваючим розчином є стерильний апірогенний 0,9% розчин натрію хлориду (без антибіотиків).

Заготівлю вищезазначених компонентів крові здійснюють заздалегідь згідно з поданими заявками лікувальних закладів. У лікувальні заклади необхідно видавати тільки еритромасу зі зменшеною кількістю лейкоцитів.

3.1.1. Флакони з кров'ю, що зберігалися протягом 1 - 7 діб після взяття крові від донора за температури (4 +- 2) град. C, вміщують у центрифужні склянки з гумовими вкладками, зрівноважують попарно та центрифугують при відцентровому прискоренні 1700 g протягом 11 хв. (див. додаток 1) за температури (5 +- 2) град. C.

3.1.2. Виділення плазми, герметизацію її, етикетування, зберігання та використання проводять, як зазначено в пп. 2.1.2 - 2.1.4.

3.1.3. Біля (1 +- 0,2) см (15 - 20 мл) плазми та шар лейкоцитів з осадженими еритроцитами висотою (1 + 0,2) см (15 - 20 мл), що залишилися у флаконі, переводять стерильною системою під вакуумом в інший стерильний флакон. Виділені таким чином лейкоцити йдуть на виготовлення інтерферону.

3.1.4. До еритроцитів, що залишилися, додають через стерильну систему під вакуумом 0,9% розчин натрію хлориду (співвідношення об'єму розчину і еритроцитів приблизно 4:1), ретельно перемішують та центрифугують при 2000 g протягом 5 хвилин при температурі (5 +- 2) град. C (див. додаток 1).

3.1.5. Після центрифугування флакони обережно переносять у бокс, знову обробляють поверхню корка та горловину флакона тампоном, змоченим 96% етиловим спиртом та відсмоктують розчин натрію хлориду з залишками лейкоцитів, що розташовуються шаром сіруватого кольору на поверхні еритроцитів висотою (0,5 +- 0,2) см (10 - 15 мл).

3.1.6. Процедуру відмивання повторюють ще двічі, якщо використовували свіжозаготовлену кров (до 1 доби зберігання), чи один раз, якщо кров зберігалась 2 - 7 діб.

3.1.7. Корок флакону з ЕМЗЛТ обробляють 5% розчином йоду, місце проколу заливають колодієм та герметизують стерильним розплавленим парафіном.

3.1.8. На флакон з еритроцитами, одержаними після 3- чи 2-разового відмивання, зверху етикетки для крові наклеюють етикетку "Еритроцити, зі зменшеною кількістю лейкоцитів", на якій вказують назву закладу-виготовлювача, кількість лейкоцитів в 1 мл еритроцитної маси, дату заготівлі крові, дату відмивання, групу крові та резус-фактор, прізвище донора та прізвище лікаря, який проводив відмивання. Термін зберігання ЕМЗЛТ - 24 години за температури (4 +- 2) град. C.

3.1.9. Для контролю стерильності проводять бактеріологічний посів ЕМЗЛТ з одного флакону від кожної серії, заготовленої в один день. Якщо серія складається з 20 чи більше флаконів, посів проводять з кожного 20-го флакону з відмитими еритроцитами.

3.2.1. Консервовану кров, заготовлену в полімерні контейнери, не більше 4 год. зберігання при кімнатній температурі (+22 +- 2) град. C, піддають фракціонуванню на компоненти. Для одержання ЕМЗЛТ може бути використана кров одразу ж після заготівлі (паралельно з виділенням концентратів тромбоцитів (КТ), концентратів лейкоцитів (КЛ) та плазми) або кров 2 - 7 діб зберігання при температурі (4 +- 2) град. C.

3.2.2. Контейнери з консервованою кров'ю, призначеною для одержання ЕМЗЛТ, після ретельного повільного перемішування вміщують у центрифужні склянки, зрівноважують та центрифугують при відцентровому прискоренні 1250 g протягом 20 хв. (див. додаток 1). При використанні свіжозаготовленої крові (не більше 4 год. зберігання), призначеної для заготівлі концентратів тромбоцитів та лейкоцитів, при центрифугуванні встановлюють температуру (22 +- 2) град. C. Кров, яка зберігалася більше 4 год., центрифугують при температурі (5 +- 2) град. C. При такому режимі еритроцити осідають на дно контейнера, над ними розташовується лейкоцитарно-тромбоцитарний шар (ЛТШ) сіро-білого кольору, зверху якого знаходиться бідна клітинами плазма (БКП).

3.2.3. Після зупинки центрифуги контейнер з кров'ю (N 1), з'єднаний з іншими порожніми контейнерами (N 2 та N 3) обережно витягують з центрифуги, передають у бокс та вміщують у плазмоекстрактор, етикеткою, повернутою до його задньої пластини.

У разі заготівлі крові у одинарний контейнер, в його штуцер вводять голку контейнера без консерванту.

3.2.4. Передньою рухомою пластиною плазмоекстрактора натискують на контейнер з кров'ю. Послаблюють затискач на з'єднувальній трубці між контейнерами N 1 та N 2 та переводять плазму у контейнер N 2. Коли в контейнері N 1 над еритроцитами залишається шар плазми висотою 2 - 3 см, об'ємом біля 40 - 50 мл (при фракціонуванні крові, призначеної для виділення КТ), на з'єднувальну трубку накладають затискач на відстані 2 - 5 см від контейнера N 2. Під час заготівлі ЕМЗЛТ з крові, що зберігалася, не призначеної для виділення КТ, затискач на з'єднувальну трубку між контейнерами накладають в той момент, коли межа між плазмою та еритроцитами буде біля вихідного отвору контейнера N 1.

3.2.5. Плазму, що залишилася в контейнері N 2, разом із шаром еритроцитів висотою 1 - 2 см (загальним об'ємом 30 - 40 мл) переводять у другий додатковий чи приєднаний контейнер.

3.2.6. На з'єднувальну трубку на відстані 2 - 5 см від контейнера N 1 та на такій же відстані від контейнера N 3 накладають затискач. Герметизують та роз'єднують контейнери з еритроцитами, плазмою та ЛТШ.

3.2.7. Контейнер з плазмою направляють для заморожування чи приготування препаратів плазми.

3.2.8. Контейнер з ЛТШ направляють на повторне центрифугування з метою одержання КТ та КЛ.

3.2.9. До еритроцитів, що залишились у головному контейнері (N 1), за допомогою системи, що складається з голки, з'єднаної з полівінілхлоридною (ПВХ) трубкою та введеною у штуцер контейнера N 1, додають стерильний 0,9% розчин натрію хлориду, заповнюючи контейнер та ретельно змішують. Трубку, що веде до контейнера, герметизують шляхом зв'язування двох тугих вузлів чи запаюванням. Контейнер вміщують у центрифужну склянку, зрівноважують та центрифугують при відцентровому прискоренні 2000 g протягом 5 хв. при температурі (5 +- 2) град. C (див. додаток 1).

3.2.10. Після центрифугування контейнер обережно переносять у бокс. Кінець трубки обробляють 5% розчином йоду та 96% етиловим спиртом, відсікають герметизуючі вузли, трубку контейнера з'єднують стерильно з системою флакона, що залишився після відмиваючого розчину. За допомогою плазмоекстрактора в цей флакон переміщують надосад - залишок лейкоцитів та шар еритроцитів висотою (0,5 +- 0,2) см (10 - 15 мл). Не порушуючи принципу закритого методу відмивання, приєднують інший флакон з 0,9% розчином натрію хлориду.

3.2.11. Процедуру відмивання повторюють ще двічі.

3.2.12. Етикетування, зберігання та контроль стерильності проводять згідно з пп. 3.1.8 - 3.1.9.

3.3.1. Еритроцитну масу зберігають в холодильнику при температурі (4 +- 2) град. C від 2 до 7 діб.

3.3.2. Для заготівлі ЕМЗЛТ краще використовувати ЕМ чи еритроконцентрат, що зберігався протягом 2 - 7 діб.

3.3.3. Етикетування, зберігання та контроль стерильності проводять згідно з пп. 3.1.8 - 3.1.9.

4.1. Консервовану кров, призначену для виділення КТ, зберігають при кімнатній температурі (22 +- 2) град. C не довше 4 - 6 год. з моменту заготівлі.

4.2. Перед центрифугуванням крові перевіряють герметичність контейнера (флакону) з кров'ю, а також перекриття з'єднувальної трубки між головним та додатковими контейнерами.

4.3. Кров в контейнерах (флаконах) ретельно перемішують, вміщують у центрифужні склянки та центрифугують при відцентровому прискоренні: контейнери - 680 g протягом 13 хв.; флакони - 1380 g протягом 6 хв. або 680 g протягом 20 хв. (див. додаток 1) при температурі (22 +- 2) град. C. Таким чином, кров поділяється на збагачену тромбоцитами плазму (ЗТП) та ЕМ; ЗТП та ЕМ відділяють у контейнери 300/300 без консерванту.

4.4. Контейнер (флакон) з ЕМ від'єднують від контейнера з плазмою, етикетують та вміщують у холодильник за температури (4 +- 2) град. C. Термін зберігання еритроцитної маси для переливання - 21 день. Подальше використання ЕМ проводять згідно з пп. 2.1.5 - 2.1.7; 2.3.5 - 2.3.6.

4.5. Контейнери із ЗТП центрифугують при відцентровому прискоренні 2400 g протягом 20 хв. при температурі (4 +- 2) град. C (див. додаток 1). При такому режимі тромбоцити з плазми осідають на дно контейнера, а над ними розташовується бідна клітинами плазма (БКП).

4.6. Після зупинки центрифуги контейнери обережно витягують з центрифужних склянок та вміщують між пластинами плазмоекстрактора чи підвішують на штатив у вертикальному положенні; додатковий порожній контейнер розташовують на столі.

4.7. Відкривають затискач на з'єднувальній трубці між контейнерами. Тиском пластини плазмоекстрактора на контейнер більшу частину БКП вміщують у порожній контейнер. Коли над тромбоцитами залишається 40 - 60 мл плазми, необхідної для подальшого їх ресуспендування, з'єднувальну трубку перекривають затискачем на відстані 2 - 5 см від контейнера з концентратом тромбоцитів (КТ).

4.8. Контейнер з КТ, виймають з плазмоекстрактора та, послаблюючи затискач на трубці, витискають повітря з нього в з'єднувальну трубку чи контейнер з БКП. Наявність повітря в контейнері з КТ може привести до їх агрегації. Контейнери герметизують.

4.9. Контейнер з плазмою після етикетування зберігають та використовують згідно з п. 2.1.4.

4.10. Контейнер з КТ залишають без змішування у спокійному стані на 1 год. при температурі (22 +- 2) град. C. У такому стані відбувається спонтанна дезагрегація тромбоцитів. Спроба ресуспендувати тромбоцити одразу ж після відділення бідної клітинами плазми може привести до незворотньої агрегації клітин, внаслідок чого тромбоконцентрат виявиться непридатним для переливання.

4.11. Через 1 год. тромбоцити ресуспендують обережним розмішуванням до гомогенної зависі без видимих агрегатів у плазмі, що залишилась в контейнері після відділення БКП.

4.12. Контейнер з КТ етикетують (на етикетці вказують назву установи-заготовлювача, об'єм та кількість тромбоцитів (не менше 0,5 х 10^9/л), дату та час їх заготівлі, термін зберігання, групу крові та резус-фактор донора, реєстраційний номер, дату та час заготівлі крові). Для визначення об'єму КТ від ваги контейнера з клітинами віднімають масу порожнього контейнера, що дорівнює (23,0 +- 1,0) г.

5.1. Кров заготовлюють у полімерні контейнери.

5.2. Контейнери з консервованою кров'ю, після перевірки на герметичність та ретельного змішування в них крові, вміщують у центрифужні склянки, центрифугують при відцентровому прискоренні 2150 g протягом 20 хв. при температурі (22 +- 2) град. C (див. додаток 1). При такому режимі еритроцити осідають на дно контейнера, над ними розташовується лейкоцитарно-тромбоцитарний шар (ЛТШ) сірувато-білого кольору, зверху якого знаходиться БКП.

5.3. Контейнер з кров'ю (N 1), з'єднаний з іншими порожніми контейнерами, обережно витягують з центрифужної склянки, не порушуючи межу між шарами, та вміщують у плазмоекстрактор етикеткою до його задньої пластини.

5.4. Переводять плазму у контейнер N 2 згідно з п. 2.2.2. Коли у контейнері N 1 над еритроцитами залишається шар плазми висотою 4 - 5 см об'ємом 65,0 - 75,0 мл, на з'єднувальну трубку накладають затискач на відстані 2 - 5 см від контейнера N 2. Масу контролюють зважуванням.

5.5. Для виділення ЛТШ на з'єднувальну трубку між контейнерами N 1 та N 3 послаблюють затискач та переводять увесь ЛТШ разом з плазмою, що залишилась, та невеликим шаром еритроцитів об'ємом 50,0 +- 15,0 мл у контейнер N 3. Об'єм переведеної плазми лейкоцитів та тромбоцитів складає приблизно 115 - 125 мл. На з'єднувальну трубку на відстані 3 - 5 см від контейнера N 1 та на такій же відстані від контейнера N 3 накладають затискач. При використанні контейнера 500/300 (450/300) для виділення ЛТШ до контейнера N 1 приєднують контейнер 300/300 без консерванту.

5.6. Контейнер N 1, в якому міститься концентрат еритроцитів (КЕ) з гематокритним числом (0,80 - 0,90) л/л, частково позбавлений лейкоцитів та тромбоцитів, від'єднують від контейнера N 3 та герметизують, етикетують, зберігають згідно з пп. 2.1.5 - 2.1.7.

5.7. Контейнер N 2, в якому міститься БКП, етикетують, зберігають та використовують згідно з п. 2.1.4.

5.8. Контейнер N 3, який містить ЛТШ з домішкою плазми та еритроцитів, у парі з іншим контейнером з ЛТШ вміщують у центрифужні склянки у вертикальному положенні, зрівноважують та центрифугують при відцентровому прискоренні 190 g протягом 10 хв. при температурі (+22 +- 2) град. C. У центрифужні склянки вкладають тверді пластини-вкладки, які здавлюють контейнери з боків, для забезпечення постійної товщини шару по всій висоті контейнера під час центрифугування та фіксують їх гумовими кільцями. При такому режимі еритроцити та лейкоцити осідають на дно контейнера, а концентровані тромбоцити в стані зависі у плазмі розташовуються над ними.

5.9. Після зупинки центрифуги контейнер N 3 обережно витягують та вміщують у плазмоекстрактор у вертикальному положенні, приєднують до нього контейнер N 4 без консерванту, який розташовують нижче на столі. Послаблюють затискач на з'єднувальній трубці між контейнерами та повільно переміщують КТ з контейнера N 3 у контейнер N 4. Коли у вихідного отвору трубки контейнера N 3 з'явиться шар лейкоцитів, накладають затискачі на відстані 2 - 5 см від контейнерів. Проводять герметизацію та роз'єднання контейнерів.

5.10. Контейнер N 3, що містить концентрат лейкоцитів (КЛ) з домішкою еритроцитів, від'єднують. На етикетці вказують назву закладу-заготовлювача, об'єм КЛ та кількість лейкоцитів (не менше 0,8 х 10^9/л), дату та час його заготівлі, термін зберігання, групу крові та резус-фактор донора, реєстраційний номер, дату та час заготівлі крові.

5.11. Контейнер N 4, що містить концентрат тромбоцитів, етикетують згідно з п. 4.12.

6.1. Бактеріологічний контроль компонентів крові.

Контроль стерильності крові проводять відповідно до Інструкції з контролю стерильності консервованої крові, її компонентів, кровозамінників та консервуючих розчинів.

6.2. Перед тим, як видати компоненти крові для трансфузії, проводять оцінку їх якості. Критеріями придатності для нативної плазми, концентрату тромбоцитів та лейкоцитів під час візуального огляду є прозорість плазми (відсутність каламуті, пластівців, прожилків фібрину), гомогенність зависі клітин, відсутність агрегатів; еритроцитної маси, еритроцитної зависі та ЕМЗЛТ - прозорість надстою, рівномірність еритроцитного шару, відсутність видимих згустків; у всіх компонентів - цілість та герметичність полімерних контейнерів та скляних флаконів, наявність на них оформлених етикеток із зазначенням терміну придатності.

6.3. Зберігання та облік КТ, одержаного з свіжозаготовленої крові у полімерних контейнерах, проводять при кімнатній температурі (+22 +- 2) град. C протягом 24 год. чи при умові постійного перемішування на автоматичних мішалках протягом 72 год. при тій же температурі. Можливе також зберігання КТ протягом 24 год. в холодильниках при температурі (4 +- 2) град. C, особливо в тих випадках, коли умови не дають можливості забезпечити режим кімнатної температури. Вийнятий з холодильника полімерний контейнер з КТ може вміщувати видимі агрегати тромбоцитів, які зникають при температурі (+22 +- 2) град. C протягом 1 год. у спокої та при подальшому обережному перемішуванні. КТ, одержаний із свіжозаготовленої крові, зберігають у скляних флаконах при температурі (+22 +- 2) град. C протягом 24 год. У КТ, отриманому з дози консервованої крові, повинно бути не менш як 0,5 х 10^11/л тромбоцитів в об'ємі плазми не більше 75 мл.

Зберігання КЛ проводять при температурі (+22 +- 2) град. C чи в умовах холодильника при температурі (4 +- 2) град. C протягом 24 год. У КЛ повинно бути не менш як 0,8 х 10^9/л клітин в об'ємі плазми не більше 75 мл. Об'єм концентрату клітин визначають зважуванням контейнера з КТ та КЛ, з маси якого віднімають вагу порожнього контейнера, що становить в середньому (23 +- 1) г.

Еритроцитну масу, еритроцитну завись зберігають при температурі (4 +- 2) град. C у холодильнику протягом терміну, визначеного рецептурою консервуючого і ресуспендуючого розчинів для крові та ЕМ. Термін зберігання ЕМЗЛТ - 24 год. при температурі (4 +- 2) град. C. Нативну плазму зберігають при температурі (4 +- 2) град. C протягом 3 діб з моменту заготівлі чи у замороженому стані при температурі від мінус 25 до мінус 30 град. C протягом 12 місяців.

Переливання компонентів крові проводять за допомогою систем для переливання крові та її компонентів, які зареєстровані та дозволені до застосування в Україні.

Перед проведенням трансфузії компонентів крові лікар зобов'язаний перевірити на герметичність контейнер (флакон), та провести макроскопічну (візуальну) оцінку якості КТ, КЛ та КЕ. Трансфузію необхідно проводити, враховуючи групову та резус-належність донора та хворого, відповідно до Інструкції з переливання крові та її компонентів. При трансфузії КЛ необхідно враховувати антигенну сумісність донора та хворого за системою HLA.

Концентрати тромбоцитів та лейкоцитів необхідно використовувати в оптимальний термін - у день заготівлі. У такий спосіб забезпечується функціональна повноцінність клітин та максимальна лікувальна ефективність.

Примітка. g - відцентрове прискорення;

R - радіус ротора центрифуги до середини центрифужної склянки. При використанні центрифужних склянок радіус ротора 27 см.

Сучасним ефективним методом заготівлі плазми крові від донорів є плазмаферез. Він передбачає одержання від донора плазми з поверненням (ретрансфузією) власних формених елементів. Плазмаферезом за один сеанс від одного донора отримують значно більшу кількість плазми ніж при звичайному взятті крові. Плазмаферез не шкодить здоров'ю донора. Кожний сеанс плазмаферезу повинен контролювати лікар, а донор завчасно має бути ознайомлений з особливостями цієї процедури.

Залежно від частоти отримання плазми, її об'єму, а також часу відновлення концентрації білків крові донора, плазмаферез має три ступені інтенсивності. Перший ступінь інтенсивності - одноразовий плазмаферез - передбачає проведення плазмаферезу 1 - 2 рази на рік. Другий ступінь інтенсивності - багаторазовий плазмаферез - 1 - 2 рази на місяць при об'ємі вилученої плазми 10 - 15 л на рік, та третій ступінь - при якому плазмаферез проводять 1 раз на тиждень, але об'єм вилученої плазми не повинен перевищувати 30,0 л на рік.

В залежності від способу проведення, донорський плазмаферез поділяється на ручний (мануальний) і апаратний (автоматизований). При ручному плазмаферезі кров забирають у ємність і центрифугують після взяття. Його можна проводити одноразово і дворазово. Застосування дворазового плазмаферезу дозволяє протягом однієї операції отримувати від спеціально відібраних донорів вдвічі більше плазми, ніж при одноразовому. Відновлення білків плазми при цьому проходить досить швидко і, як правило, протягом доби.

При апаратному плазмаферезі кров безперервним потоком поступає у фракціонатор де розділяється на компоненти. Плазму відбирають, а концентрат еритроцитів ретрансфузують. При його проведенні застосовуються спеціальні системи, які дозволяють зберігати весь екстракор-поральний контур повністю закритим протягом всієї процедури. Ці системи мають багатозначні індивідуальні номери, за якими можна ідентифікувати донора і його форменні елементи.

Донорський плазмаферез дозволяє отримати свіжозаморожену плазму, а також плазму, придатну для виготовлення антигемофільних препаратів, гама-глобулінів, тромбіну, альбуміну тощо. Для отримання плазми з високою концентрацією специфічних антитіл плазмаферез проводять у донорів, які перенесли відповідні захворювання або щеплення.

До одноразового плазмаферезу допускаються донори, які пройшли медичний огляд за встановленим порядком.

1.1. При підборі донорів до багаторазового плазмаферезу (з інтервалом 7 - 14 діб) враховують вимоги цієї Інструкції та обов'язково перед кожною плазмодачею проводять:

а) визначення рівня гемоглобіну (для чоловіків - в межах 130 - 160 г/л, для жінок - 120 - 140 г/л);

б) визначення показника гематокриту (не менше 38%);

в) визначення загальної кількості білка крові методом рефрактометрії (не нижче 60,0 - 90,0 г/л).

1.2. Взяття зразків крові для:

а) повного клінічного аналізу, який проводиться один раз на кожні 5 плазмодач;

б) підрахування кількості тромбоцитів (1 раз на кожні 2 плазмодачі);

в) підрахування кількості ретикулоцитів (1 раз на кожні 5 плазмодач);

г) функціональних проб печінки (вміст білірубіну в крові не вище 20,5 мк моль/л; тимолова проба - 0 - 5 од.; активність аланінаміно-трансферази від 0,10 до 1,36 ммоль/л);

д) імуноферментного дослідження на: HBs-антиген, наявність антитіл до HCV та ВІЛ, сифіліс.

1.2.1. Термометрія (припустимі межі температури тіла (36,6 +- 0,3)) град. C.

1.2.2. Вимірювання артеріального тиску (систолічний тиск має бути в межах від 100 до 160 мм рт. ст., діастолічний - в межах від 60 до 90 мм рт. ст).

1.2.3. Підрахування пульсу донора (повинен бути ритмічним в межах 60 - 80 пульсацій за 1 хвилину).

1.2.4. Фізикальний огляд донора терапевтом та дерматовенерологом.

1.3 Плазмаферез протипоказаний особам, які зловживають алкоголем та вживають наркотичні речовини.

1.3.1. Донорів плазми недоцільно допускати до кроводачі, тому що це порушує циклічність плазмаферезів. В той же час у донора крові може бути проведений плазмаферез.

1.3.2. У разі проведення апаратного плазмаферезу доза вилученої плазми залежить від маси тіла донора, росту, загальної кількості білка крові та показників гематокриту. Єї визначають за співвідношеннями між показниками, які приведені у таблицях 1 і 2 - для чоловіків та 3 і 4 - для жінок (додаток 1).

1.3.3. До плазмаферезу допускаються донори усіх груп крові.

1.3.4. Доцільно створювати спеціальні групи кадрових донорів, у яких можна вилучати плазму з частотою 1 раз на 7 діб, але не частіше.

1.3.5. При використанні мануального та апаратного плазмаферезів роблять перерву на 1 місяць після вилучення кожних 9,0 л плазми. За 1 рік можна вилучити від одного донора не більше 30,0 л плазми.

1.4. Контроль за станом здоров'я донора в процесі плазмаферезу

1.4.1. Повторні плазмаферези слід проводити під спостереженням, що включає детальний огляд донорів терапевтом і весь комплекс лабораторних досліджень, перерахований в розділі 2 (крім протеїнограми, загального аналізу крові та сечі, що проводять після кожної перерви).

1.4.2. У випадку відхилення від нормальних величин будь-якого з перелічених показників, донора тимчасово не допускають до плазмаферезу.

2.1.1. Рефрижераторна центрифуга із стаканами місткістю 0,75 - 1,0 л.

2.1.2. Високочастотні генератори для запаювання трубок або алюмінієві кільця та затискачі.

2.1.3. Екстрактори для плазми.

2.1.4. Ваги.

2.1.5. Різноважки.

2.1.6. Штатив для підвішування мішків з форменними елементами крові, які призначені для повернення донору.

2.1.7. Медичні інструменти і білизна, необхідні для проведення плазмаферезу за допомогою пластикатних контейнерів.

2.1.7.1. Бікс із необхідним набором стерильного матеріалу.

2.1.7.2. Бинти, вата, липкий пластир.

2.1.7.3. Пакет із стерильними кровозупинними затискачами (Пеана) та ножицями.

2.1.8. Пластикатні контейнери (одинарні, подвійні, потрійні тощо).

2.1.9. Системи для проведення двократного плазмаферезу.

2.1.10. Стерильний апірогенний 0,9% розчин натрію хлориду, придатний для внутрішньовенного введення: по 1 флакону (200,0 мл) при одноразовому взятті плазми і 400,0 мл - при дворазовому.

2.1.11. Нитки (товсті).

2.1.12. Етикетки для контейнерів і флаконів з плазмою та кров'ю.

Обробку (миття) посуду, інструментів та іншого обладнання проводять згідно з додатком 1 Інструкції із заготівлі консервованої донорської крові.

2.3.1. При наявності однієї кімнати для взяття крові та її компонентів або одного плазмаферезного залу, взяття крові, або проведення плазмаферезу дозволяється здійснювати одночасно у декількох донорів однієї групи крові і резус-належності, але не більше тієї кількості, яку можна одночасно центрифугувати.

2.3.2. Повертати власні формені елементи крові слід послідовно кожному донору даної групи. Пробу на сумісність проводять перед кожною реінфузією.

2.3.3. При використанні спеціальних систем для плазмаферезу, які мають багатозначні індивідуальні номери на з'єднувальних трубках, пробу на сумісність не проводять, а ідентифікацію донора і його формених елементів здійснюють за спеціальною методикою, яка наведена в пунктах 3.6, 4.4 та 4.5 розділу 3.

2.3.4. В разі систематичного проведення плазмаферезу у одних і тих же донорів доцільно виділити окремі дні для кожної групи.

3.1. У донора беруть кров у пластикатну тару (контейнер), відділяють формені елементи крові шляхом центрифугування і переводять плазму із контейнерів з кров'ю в контейнер-приймальник плазми, відділяють контейнер з форменими елементами, ідентифікують з донором і реінфузують. Для проведення двократного плазмаферезу після закінчення реінфузії першої дози формених елементів зразу ж приступають до взяття другої дози крові. В періоди центрифугування донору крапельно вводять 200,0 - 250,0 мл 0,9% розчину натрію хлориду.

3.2. Для прискорення реінфузії в контейнер з форменими елементами необхідно вводити 50,0 - 100,0 мл 0,9% розчину натрію хлориду. Процедура плазмаферезу повинна виконуватись шляхом однієї венепункції. Для цього застосовують спеціально виготовлені для проведення плазмаферезу одноразові полівінілхлоридні системи. Весь процес дворазового плазмаферезу, від початку взяття першої дози крові до закінчення реінфузії другої дози формених елементів, повинен займати не більше 2 годин.

3.3. Процес взяття крові у донора

3.3.1. Перед початком взяття крові необхідно з'ясувати у донора його прізвище, ім'я та по батькові, групу крові, резус-належність і звірити їх з записами на карті донора і на етикетках тари, в яку буде проводитись забір крові.

3.3.2. Перевірити герметичність пластикатного контейнера, термін зберігання виробу, здійснити контроль цілості первинної та вторинної упаковки. У випадку спадіння пакета при його стисканні перевірити його цілість, звертаючи особливу увагу на герметичність мембран штуцерів. При наявності консервуючого розчину над мембраною штуцера контейнера, його бракують.

3.3.3. При використанні спарених контейнерів перевести весь консервуючий розчин у контейнер місткістю 450 - 500 мл та накласти затискач на з'єднувальну трубку між контейнерами.

3.3.4. На донорській трубці на відстані 15 - 20 см від контейнера зробити петлю вузла та накласти затискач між вузлом і голкою. Перенести контейнер на ваги чи на апарат для дозованого взяття та змішування крові з консервуючим розчином, які розташовують на 50 - 60 см нижче рівня руки донора.

3.3.5. Накласти джгут, обробити шкіру ліктьового згину руки донора антисептиком.

3.3.6. Зняти ковпачок з голки та провести венепункцію, зняти затискач з трубки. Кров, що надходить у контейнер, повинна ретельно змішуватись з консервуючим розчином. Після взяття дози крові накласти затискач на трубку ближче до голки, затягнути туго вузол на донорській лінії системи і відрізати ножицями трубку між вузлом та затискачем ближче до вузла. На відрізку трубки, що залишилася біля контейнера, зав'язати ще два вузли.

3.3.7. Зняти затискач з трубки. Наповнити кров'ю дві пробірки, маркіровані перед венепункцією. Одну з них залишити для проведення проби на сумісність перед реінфузією донору власних формених елементів крові, другу відправити на клініко-біохімічні дослідження. На контейнер з кров'ю наклеїти етикетку (паспортизацію контейнерів з кров'ю необхідно проводити нанесенням даних на етикетку паспорта контейнера).

3.3.8. Після від'єднання контейнера з кров'ю від вени донора та взяття крові в пробірки необхідно герметизувати донорський кінець трубки накладанням вузла. Джгут зняти. Для попередження тромбування системи взяття крові необхідно відразу почати інфузію 200,0 мл 0,9% розчин натрію хлориду.

3.4. Центрифугування пластикатних контейнерів з кров'ю.

3.4.1. Контейнер з кров'ю, запакований у поліетиленовий мішок, вміщують у металевий стакан центрифуги. Цетрифужні стакани зрівноважують водою на вагах.

3.4.2. Для отримання плазми і еритроцитів пластикатні контейнери з кров'ю центрифугують 12 - 15 хв. в режимі 980 - 1000 qv при температурі 0 - 30 град. C.

Примітки:

1. Оберти ротора центрифуги встановлюють не більше тих, що вказані в паспорті ротора та на самому роторі.

2. Центрифугування крові проводять при температурі від 0 до 30 град. C протягом 12 - 15 хв. в режимі 980 - 1000 g.

3.5. Відокремлення плазми.

3.5.1. Після центрифугування пластикатний контейнер обережно, щоб не збовтати кров, підвішують на штатив. На 15 - 20 см нижче, на цьому ж штативі, підвішують контейнер-приймач з наклеєною етикеткою. Знімають затискач. Легким натиском руки на мішок з відцентрифугованою кров'ю заповнюють з'єднувальну трубку плазмою, яка за принципом сполучених посудин, самопливом надходить в контейнер-приймач. Плазму можна перевести в контейнер за допомогою плазмаекстрактора. Для цього контейнер з відцентрифугованою кров'ю поміщають між пластини плазмаекстрактора, знімають запобіжник і переводять плазму у контейнер-приймач. Не допускається переведення у плазму формених елементів крові. Відомості про плазму вписують в етикетку.

3.5.2. У боксі в асептичних умовах можуть працювати не більше трьох осіб (лікар та дві медичні сестри). Реєстратор та препаратор працюють у передбоксі.

3.5.3. Під час масової заготівлі плазми методом плазмаферезу рекомендується мати 2 бокси, що експлуатуються почергово.

3.5.4. Вихід плазми з однієї дози взятої крові повинен становити не менше 50% її об'єму. Якщо під час ексфузії у донора з тої чи іншої причини не одержано запланованої кількості крові, то їх необхідно описати у донорському журналі та зробити відповідну позначку на етикетці.

3.6. Повернення (реінфузія) донору власних формених елементів крові

3.6.1. Реінфузію власних формених елементів проводять у тому ж приміщенні, де здійснювалося взяття крові.

3.6.2. Використання індивідуально пронумерованих систем і контейнерів при плазмаферезі дозволяє здійснювати ідентифікацію донора і його формених елементів крові без проведення проб на сумісність, що скорочує час перебування донора в центрі крові.

3.6.3. Паспортизацію пластикатного контейнера проводять до початку взяття крові у донора записами прізвища та ініціалів, групи крові, резус-фактора, номера ліжка або крісла донора на паспорті контейнера, наклеєного заводом-виготівником. На контейнер наклеюють марку з номером плазмодачі. Таку ж марку з номером плазмодачі прикріплюють до зап'ястя руки донора.

3.6.4. Перед початком реінфузії необхідно виконати наступні дії:

3.6.4.1. Запитати прізвище у донора та звірити його з прізвищем, написаним на етикетці контейнера.

3.6.4.2. Звірити номер ліжка чи крісла з номером на етикетці контейнера.

3.6.4.3. Звірити номер марки плазмодачі на етикетці контейнера з номером марки на зап'ясті донора.

3.6.4.4. З'єднати кінці трубок, що залишилися після від'єднання контейнера з кров'ю від системи, так, щоб всі цифри співпадали і перевірити відповідність трубок по кожній цифрі їх номерів.

3.6.4.5. Якщо все співпадає, то необхідно показати донору його контейнер з форменими елементами крові та запитати: "Це Ваше прізвище та ім'я?". При його відповіді "Так" - розпочати реінфузію за описаною нижче методикою. Якщо донор сказав "Ні", необхідно з'ясувати всі обставини, що викликали таку відповідь.

3.7. Лікар повинен занести в журнал донора всі відомості щодо проведення плазмаферезу та поставити свій підпис.

3.8. Переливання власних формених елементів крові з пластикатних контейнерів донору:

3.8.1. Перевірити етикетку на флаконі з 0,9% розчином натрію хлориду (придатність до внутрішньовенного введення, дату заготівлі чи термін придатності).

3.8.2. Обробити трубку контейнера з форменими елементами крові 70% етиловим спиртом, приєднати до нього через систему разового використання флакон або контейнер з 0,9% розчином натрію хлориду і ввести його у ємкість з клітинами крові в кількості, яка дорівнює 5,0% їх об'єму.

3.8.3. Обережно змішати формені елементи крові з фізіологічним розчином натрію хлориду. Не дозволяється використовувати цей же флакон з фізіологічним розчином натрію хлориду для ресуспензії формених елементів крові іншого донора.

3.8.4. Накласти затискач на трубку пластикатного контейнера до місця з'єднання з системою, від'єднати систему, обробити трубку контейнера 70% спиртом, з'єднати її з одноразовою системою для переливання і заповнити її форменими елементами крові.

3.8.5. При використанні V-подібних систем для переливання крові приєднати до вільної голки контейнер з форменими елементами крові. За допомогою трьох затискачів, розміщених на трубках системи, ввести зазначену вище кількість 0,9% розчину натрію хлориду в контейнер, змішати формені елементи крові з розчином, відкрити затискач і розпочати їх реінфузію.

3.8.6. Лікар, який проводить реінфузію, повинен перевірити етикетку, запитати у донора його прізвище, ім'я та по батькові, групу крові та резус-належність і звірити з відповідними написами на етикетці.

3.8.7. Провести пробу на сумісність з сироваткою донора (з пробірки) та концентратом еритроцитів. При відповідності групової належності еритроцитного концентрату та крові і відсутності аглютинації, приступити до реінфузії формених елементів донору.

3.8.8. Власні формені елементи крові вводять донору без проведення біологічної проби. Під час реінфузії лікар постійно контролює самопочуття донора. При виникненні ускладнень реінфузію формених елементів крові миттєво припиняють, з'ясовують їх причину і донору надають медичну допомогу.

3.8.9. При виконанні дворазового плазмаферезу взяття другої дози крові починають після повернення всього об'єму формених елементів крові донору. По завершенні процедури плазмаферезу, голку з вени донора витягують та накладають асептичну пов'язку.

3.8.10. Після закінчення реінфузії провести герметизацію флакона чи контейнера і зберігати їх протягом доби в холодильнику при температурі (6,0 +- 2,0) град. C для контролю у випадку виникнення будь-яких ускладнень в посттрансфузійний період у донора.

Апаратний плазмаферез може виконуватись в одному приміщенні одночасно донорам різних груп крові.

4.1. До початку плазмаферезу необхідно перевірити відповідність прізвища та номера карти особи, якій проводять плазмаферез. Перед кожним плазмаферезом донора зважують. Особі, маса тіла якої менше 50,0 кг, згідно рекомендаціям ВООЗ, відмовляють у донорстві. При зменшенні маси тіла донора протягом двох місяців більше 4,5 кг, його повинен оглянути лікар.

4.1.1. Отримання плазми сучасними апаратами здійснюють згідно інструкцій до них. Об'єм взяття плазми визначають за таблицями 1 і 2 у чоловіків та 3 і 4 у жінок (додаток 1).

У більшості апаратів плазмозбираюча система працює за стандартними параметрами. Швидкість взяття крові у донора не повинна перевищувати 70,0 мл/хв. (при необхідності вона може бути знижена, але не нижче 60,0 мл/хв.). Ці ж параметри визначають швидкість реінфузії компонентів крові. Швидкість центрифугування в апараті є параметром незмінним. Процес підготовки апарату до плазмаферезу включає низку етапів.

4.2.1. Сепаратор, з'єднувальні трубки та голки перевірити на прохідність і герметичність.

4.2.2. Встановити сепаратор у центрифугу.

4.2.3. Асептично приєднати до нього з'єднувальні трубки і пакет для плазми.

4.2.4. Зафіксувати сепаратор.

4.2.5. Встановити фільтрувальну камеру.

4.2.6. Заповнити систему антикоагулянтом.

4.2.7. Вставити трубку у помпу для антикоагулянта.

4.2.8. Вставити трубку у помпу для крові.

4.2.9. Включити помпу подачі антикоагулянту та взяття крові і заповнити ними відповідні системи.

4.3. Перед проведенням венепункції медична сестра повинна:

4.3.1. Перевірити ідентичність номера на пакетах для плазми і ємкостях для зразків крові, правильність запису призначеної дози взяття плазми.

4.3.2. Приладнати пакет до ваг зважування плазми і запрограмувати апарат на своєчасне припинення плазмаферезу, керуючись записом лікаря в донорській карті про об'єм вилучення плазми.

4.4.1. Ватні тампони, марлеві кульки і затискачі, якими їх утримують, повинні бути стерильними.

4.4.2. Розчини повинні бути стерильними.

4.4.3. Затискачі зберігають розкритими у ємкості, заповненій 70% етиловим спиртом.

4.5.1. Записати марку і номер апарату до карти донора.

4.5.2. Провести венепункцію з додержанням правил асептики.

4.5.3. Взяти зразок цільної крові для дослідження.

4.5.4. Приєднати голку до системи, додержуючись правил асептики, розпочати взяття крові, натиснувши кнопку "Пуск".

4.6.1. Після досягнення визначеної ваги плазми процедура (на сучасних апаратах) автоматично закінчується.

4.6.2. Відмітити кінцеву вагу плазми у карті донора.

4.6.3. У разі невідповідності кінцевої ваги плазми, визначеній більш ніж на 5,0 г або менше ніж на 20,0 г, зміну ваги отриманої плазми зазначити у графі "Коментарі" карти донора.

4.6.4. У разі відхилення апарату від програми, необхідно записати номер апарату, причину відхилення, заходи, що проведені (наприклад, додаткова калібровка), у відповідну форму, що ведеться для кожного апарату окремо.

4.6.5. Якщо причину відхилень не встановлено, перед подальшим використанням апарату необхідно пересвідчитися у правильній калібровці його ваг, використовуючи стандартні ваги. Записати результати у відповідну форму.

4.6.6. Кров, що залишилася у системі, повернути донору.

4.6.7. Після цього від'єднати систему від донора за такою схемою: видалити стрічку пластиря, що фіксує голку; покласти стерильний ватний тампон на голку; видалити голку; притиснути стерильний тампон до місця венепункції; накласти пов'язку на руку донора; голку відрізати і помістити у контейнер для знезараження. Донор повинен залишатися в кріслі (ліжку) протягом 5 - 10 хвилин для попередження можливого розвитку трансфузійних реакцій.

4.6.8. Після закінчення процедури вийняти з центрифуги сепаратор, фільтруючу камеру і трубки з помпи крові та детекторів повітря. Сепаратор, фільтруючу камеру і трубки підняти вище ліктьового згину донора. Залишки формених елементів крові з системи повернути в судинне русло донора. Закрити затискач на трубці біля голки.

4.6.9. У донорів плазми для тестування на ВІЛ, гепатити, сифіліс тощо бажано використовувати не кров, а плазму, оскільки навіть вилучення незначної кількості крові при систематичних плазмаферезах може привести до виникнення анемії.

4.6.10. Для взяття 2-х зразків плазми необхідно: зняти ковпачок з трубки від пакету з плазмою, видалити повітря з пакету через відкритий отвір трубки; закрити отвір цієї трубки; заповнити трубку плазмою; промаркувати всі зразки етикетками з контрольними номерами і пересвідчитися, що всі вони мають той самий номер, що й пакет з плазмою (довжина трубки кожного зразка повинна бути 25 - 30 см). Один зразок плазми передають в лабораторію; другий - зберігають в плазмоцентрі при температурі (22 +- 2) град. C 21 добу.

4.6.11. Кінцевий об'єм зібраної плазми записати на пакеті в карті донора та операційному журналі, переводячи одиниці ваги (г) в одиниці об'єму (мл).

4.6.12. Якщо під час проведення плазмаферезу з будь-яких причин донор втратив 50,0 мл цільної крові або 25,0 мл еритроцитної маси, необхідно звільнити його від плазмодачі на 2 місяці. У карті донора зробити запис про дату поновлення взяття плазми та причини цього звільнення. Повторний плазмаферез проводять після оцінки клініко-біохімічних показників.

4.7. Поновлення процедури плазмаферезу.

Етапи підготовки апарату до повторного взяття плазми визначені в Інструкції до нього.

4.7.1. В більшості випадків для поновлення процедури плазмаферезу необхідно:

4.7.2. Натиснути кнопку "СТОП", якщо необхідно зупинити процедуру.

4.7.3. Вимкнути апарат з джерела струму.

4.7.4. Видалити трубки та фільтрувальну камеру з детекторів повітря.

4.7.5. Зняти пакет з плазмою з ваг і покласти його на верхню частину апарату.

4.7.6. Знову підключити апарат до джерела струму, пересвідчитись, що ваги не блоковані.

4.7.7. Після появи на дисплеї напису "ГОТОВИЙ" показник ваг має дорівнювати "0"; вставити трубку у відповідні місця детектора повітря та фільтрувальної камери і перепрограмувати апарат на новий цикл взяття плазми згідно до формули:

4.7.8. Підняти покришку центрифуги, натиснути кнопку "ПОВЕРНЕННЯ". Коли на дисплеї апарату з'явиться напис "ПОКРИШКА ЦЕНТРИФУГИ НЕ ЗАКРИВАЄТЬСЯ", закрити її. При появі на дисплеї напису "ВИЛУЧЕННЯ", пересвідчитися, що вилучення почалося, і прикріпити пакет на вагах.

4.7.9. Цикл повернення закінчити у випадку появи напису "ПОВіТРЯ ВИЗНАЧАЄТЬСЯ РАНО" і за умови, що сепаратор порожній. Для цього провести такі дії: закрити покришку центрифуги; натиснути кнопку "ВИЛУЧЕННЯ"; пересвідчитися, що апарат почав цикл вилучення і на дисплеї з'явився напис "ВИЛУЧЕННЯ"; приладнати пакет на вагах.

4.7.10. Коли на дисплеї апарату з'явиться повідомлення "ПРОЦЕДУРУ ЗАКІНЧЕНО", від'єднати донора від апарату. Вагу отриманої плазми вирахувати за формулою:

Отриманий результат записати у донорській картці.

4.8. Експлуатація та обслуговування апарату для плазмаферезу. 4.8.1. Інформацію про всі пошкодження апарату необхідно заносити у відповідний журнал.

4.8.2. Перевірку та калібровку апаратів повинен проводити кваліфікований персонал відповідно до інструкції заводу-виготовлювача.

4.8.3. Обслуговувати апарати повинен кваліфікований персонал згідно інструкції заводу-виготовлювача. Всі дії з апаратом записують у відповідному журналі.

4.8.4. Щорічну профілактику апаратів повинен проводити кваліфікований персонал згідно інструкції заводу-виготовлювача.

4.8.5. Якщо кров або плазма потрапила на одну з функціонуючих частин апарату (включаючи помпу, детектори повітря, монітор, замок центрифуги), необхідно: натиском кнопки "СТОП" припинити процедуру плазмаферезу і відключити апарат від джерела струму; від'єднати донора, якщо кров або плазма витікають внаслідок порушення герметичності в одній із частин системи, наприклад, у полівінілхлоридних трубках, антикоагулянтній системі, сепараторі або пакеті для плазми. Повернення донору клітин крові у цих випадках недопустиме в зв'язку з їх можливим забрудненням. Процедура плазмаферезу може бути продовжена на іншому апараті.

4.8.6. Під час очищення і миття апарату необхідно дотримуватись інструкції фірми-виготовлювача щодо обслуговування апарату для плазмаферезу. Відкрити задню панель апарату і переконатись, чи не затікає рідина у внутрішню його частину. Якщо рідина не виявлена, апарат можна використовувати для плазмаферезу; якщо виявлена, то необхідно провести очищення всіх доступних частин. Подальшу роботу з перевірки та очищення апарату, повинен провести кваліфікований технічний персонал. Усі маніпуляції з апаратом слід задокументувати у журналі.

4.8.7. Знищення крові та її компонентів, отриманих в ситуації, описаній в п. 4.8.5, проводять за затвердженими правилами роботи з інфікованими матеріалами.

проводять згідно Інструкції з контролю стерильності консервованої крові, її компонентів, препаратів, кровозамінників, консервуючих розчинів.

проводять згідно Інструкції з фракціонування донорської крові на її компоненти (плазма, еритроцити, лейкоцити) та їх консервування.

6.1. Заморожування, температура та інші умови зберігання.

6.2. Плазма зберігається за температурним режимом, відповідним до мети подальшого використання.

6.3. Плазма повинна бути заморожена в максимально короткий термін, проте не пізніше 20 хвилин з моменту відділення від клітин крові та не пізніше 2-х годин з моменту її вилучення у донора при ручному плазмаферезі. Для цього плазму необхідно розмістити на полиці в морозильній камері одним шаром контейнерів. Заморожування можливе у двох режимах: при температурі -75 град. C та зберіганні при - 30 - 40 град. C плазму можна використовувати протягом 2-х років; якщо плазма заморожена при -30 - 40 град. C, а зберігається при -20 град. C, то її можна використовувати протягом одного року.

6.4. Температурний режим у морозильних та холодильних камерах, де зберігається плазма, контролюють двічі на добу за допомогою термометрів та реєструють у відповідному журналі. Моніторинг температурних умов зберігання плазми можна вести за допомогою термографів.

6.5. Транспортування плазми здійснюють у термоізолюючих контейнерах, які тривалий проміжок часу забезпечують температуру, відповідну до зберігання. Транспортування плазми на значні відстані здійснюють в автохолодильниках або авторефрижераторах.

Усі випадки реакцій у донорів повинні бути занесені в розділ "Коментарі" карти донора.

7.1. Анафілактичні реакції, які можуть виникнути у донора в результаті введення препаратів, відносяться до реакцій негайного і віддаленого типів. Перші з них розвиваються гостро і при прогресуванні є загрозливими для життя донора. Клінічними проявами анафілактичної реакції негайного типу, в залежності від її тяжкості, є: суб'єктивні порушення, болі в спині, нудота, шкірні прояви (прилив крові, кропив'янка, набряк Квінке); колапс (зниження систолічного артеріального тиску нижче 90 мм рт. ст., тахікардія); задишка; шок; зупинка серця і дихання.

7.1.1. Виникнення анафілактичної реакції у донора вимагає від лікаря швидкої діагностики і надання невідкладної медичної допомоги. При появі анафілактичної реакції негайного типу необхідно зупинити процедуру плазмаферезу, що може бути достатнім при суб'єктивних проявах.

7.1.2. Медикаментозна терапія. При шкірних проявах вводять внутрішньом'язово або внутрішньовенно антигістамінні препарати (димедрол, піпольфен, супрастин тощо), 10 мл 10% розчину кальцію глюконату (хлориду). При явищах колапсу необхідно ввести донору кортикостероїди (розчин преднізолону 30,0 мг внутрішньом'язово або внутрішньовенно), кордіамін 2 - 4 мл. Якщо прояви колапсу і задишка наростають, донору вводять внутрішньовенно 0,4 - 0,6 мл 5% розчину ефедрину; 0,2 - 0,5 мл 1% розчину мезатону; 0,5 - 1,0 мл 0,1% розчину адреналіну у 0,9% розчині натрію хлориду або змішують в шприці з його кров'ю, збільшити дозу кортикостероїдів (преднізолон до 100 - 250 мг); 0,5 - 0,8 мл 0,1% розчин атропіну. Виражені явища шоку вимагають повторних введень адреналіну кожні 1 - 2 хв. або переходу на внутрішньовенну крапельну інфузію адреналіну (0,1 мг) з кортикостероїдами, антигістамінними препаратами, еуфіліном 10 мл 2,4% розчину в 300 мл 0,9% розчину натрію хлориду чи глюкози протягом 2 годин та на керовану гемодилюцію.

7.1.3. При явищах зупинки серця і дихання необхідно негайно перейти до реанімаційних заходів (встановлення орафарингеального повітропроводу, оксигенотерапія, штучна вентиляція легень, непрямий масаж серця тощо).

7.1.4. Після виходу донора з анафілактичного стану його слід залишити під наглядом протягом 3 - 5 годин, а при необхідності - госпіталізувати.

7.1.5. Детальний запис реакції необхідно зробити в карті донора.

7.2. Пірогенні реакції можуть бути зумовлені забрудненням розчину для внутрішньовенного введення. При цьому спостерігаються такі симптоми: тремтіння, гарячка, задуха, відчуття страху. Після припинення внутрішньовенної інфузії розчину ці симптоми швидко зменшуються.

7.2.1. Якщо пірогенна реакція має місце, терміново повідомити про це лікаря і зупинити процедуру плазмаферезу. Відновити її можна після нормалізації стану донора і тільки з дозволу лікаря. Перевести донора у напівлежаче положення, накрити ковдрою.

7.2.2. При підвищенні температури повільно ввести внутрішньовенно 50,0 мг розчину димедролу.

7.2.3. За призначенням лікаря забезпечити вдихання зволоженого кисню через маску в кількості 3 л за хвилину.

7.2.4. Кожні (15 +- 1) хв. проводити визначення та запис показників температури, пульсу і артеріального тиску до повної стабілізації стану донора.

7.2.5. За необхідністю донора госпіталізувати.

7.2.6. Зберігати флакон з розчином, що викликав реакцію.

7.2.7. Детальний опис реакції повинен бути зроблений в карті донора.

7.3. Судоми потребують спостереження і консультації спеціаліста (терапевт, невропатолог). При їх виникненні:

7.3.1. Зупинити процедуру плазмаферезу.

7.3.2. Повідомити лікаря.

7.3.3. Вжити заходів для запобігання травм донора.

7.3.4. Послабити зав'язки одягу.

7.3.5. Повернути голову донора в бік для запобігання аспірації секрету з ротової порожнини і забезпечити адекватну вентиляцію легень.

7.3.6. Якщо судоми повторюються і має місце розвиток епілептичного статусу, необхідно терміново транспортувати донора у відділення інтенсивної терапії лікарні.

7.3.7. Під час судоми та після її припинення донор повинен залишатися під наглядом лікаря протягом 3 - 5 годин. Донор, у якого розвинувся епілептичний статус, на майбутнє не може бути донором крові або її компонентів без ретельного обстеження фахівцями.

7.3.8. Детальний опис реакції слід зробити в карті донора.

7.4. Гостра серцева недостатність супроводжується такими ознаками: задуха, холодний піт, блідість, тахікардія або брадикардія, гіпотензія. Гострий біль у грудній клітці може бути ознакою коронарної недостатності, інфаркту або емболії легеневої артерії. При їх виникненні виконати наступні дії:

7.4.1. Припинити процедуру плазмаферезу. Залежно від стану донора, лікар приймає рішення щодо повернення йому формених елементів крові.

7.4.2. Перевести донора в напівлежаче положення і налагодити вдихання зволоженого кисню в кількості 3 л за хвилину.

7.4.3. Викликати швидку медичну допомогу для надання спеціалізованої допомоги.

7.4.4. Під час надання першої допомоги необхідно ретельно спостерігати за всіма життєво важливими функціями.

7.4.5. Якщо є підозра на наявність у донора повітряної емболії, перевести його у положення Тренделенбурга і застосувати кисень.

7.4.6. Детальний опис реакції слід зробити в карті донора.

7.5. Клінічна смерть (зупинка серця) - раптова зупинка серцевих скорочень або розвиток фібриляції серцевих шлуночків, зупинка дихання. Цей стан може бути зворотній за умови своєчасної діагностики та лікування. При цьому необхідно терміново виконати наступні дії:

7.5.1. Перевірити наявність таких ознак: розширення зіниць, відсутність пульсу, серцевих скорочень, самостійного дихання. Якщо настала зупинка серця необхідно негайно розпочати серцево-легеневу реанімацію за загальноприйнятою методикою і викликати спеціалізовану реанімаційну бригаду швидкої медичної допомоги.

7.5.2. Під час проведення маніпуляцій необхідно спостерігати за появою таких важливих життєвих ознак: поява пульсу на сонній і стегновій артеріях, звуження зіниць і поява поодиноких вдихів. Реанімаційні заходи слід проводити до відновлення пульсу достатнього наповнення і нормалізації показників артеріального тиску.

7.5.3. Детальний опис випадку, що слід занести до карти донора.

7.5.4. Якщо з будь-якої причини донор помирає у плазмоцентрі або поблизу нього, слід вжити таких заходів:

- негайно викликати реанімаційну бригаду швидкої медичної допомоги;

- не переміщувати тіло до прибуття бригади швидкої медичної допомоги;

7.6. Цитратні реакції проявляються появою таких симптомів: поколювання пальців і в ділянці навколо рота, м'язові посмикування, карпопедальна позиція рук, гіперрефлексія, ларингеальний стридор, судоми, зупинка серця. При наявності цих симптомів необхідно провести наступні дії:

- якщо реакція незначна, зменшити швидкість повернення клітин крові до 20,0 мл за 1 хв. і ретельно спостерігати за станом донора. Якщо стан донора погіршується, компоненти крові, що залишились в системі, не повертати;

- лікар призначає інфузію 0,9% розчину натрію хлориду. У разі розвитку генералізованих судом або ларингеальної обструкції - повільне внутрішньовенне введення 10% розчину кальцію глюконату зі швидкістю не більшою ніж 10,0 мл за 1 хв.;

- повну інформацію про випадок слід занести до карти донора.

Необхідно пересвідчитись, що повітря не потрапляє до вени донора під час плазмаферезу. У випадку емболії можуть проявлятися такі симптоми: занепокоєння, кашель, задуха, біль в грудях, частий слабкого наповнення пульс, який може бути аритмічним, гіпотензія. При цьому слід вдатися до таких дій:

- негайно повідомити лікаря, зупинити процедуру, але зберегти венозний доступ. Якщо це можливо, проводити повільне внутрішньовенне введення 0,9% розчину натрію хлориду;

- розпочати кисневу терапію;

- терміново викликати бригаду спеціалізованої медичної допомоги;

- повну інформацію про випадок слід занести до карти донора.

9.1. Атропін. Доза при внутрішньовенному введенні - 0,6 мг. Показання: брадикардія, вазовазальні реакції.

9.2. Димедрол. Доза для внутрішньом'язового та внутрішньовенного введення від 10,0 до 50,0 мг. Показання: всі вищезазначені реакції.

9.3. Адреналін. Внутрішньовенно застосовують тільки за призначенням лікаря. Дози: підшкірно - 0,2 - 0,3 мл; внутрішньовенно - 0,25 - 0,5 мл у десятикратному розведенні. Показання: алергічні реакції.

9.4 Кальцію глюконат 10%. Доза 10,0 мл, вводять внутрішньовенно повільно протягом 1 хв. Показання: цитратні реакції.

9.5. Еуфілін (амінофілін). Доза - 240,0 мг, вводять внутрішньовенно повільно протягом 15 хв. Показання: наявність тяжкого бронхоспазму.

кисень;

дихальний апарат з комплектом трубок, масок;

повітропроводи;

мішок Амбу або аналог (дихальний апарат);

шприци (2,0 і 10,0 мл) з голками;

ковдри;

грілки;

джгути;

системи для інфузії розчинів;

тонометр;

стетофонендоскоп;

термометр;

перев'язочний матеріал;

ампули з амонію хлоридом.